一株耐热产漆酶杈戴氏霉菌株及其产漆酶培养方法

摘要

本发明公开了一株耐高温的、产漆酶的杈戴氏霉，该霉属于粪壳菌目、戴氏霉属，菌株为杈戴氏霉Taifanglania furcata GZUIFR-H104.1，菌株保藏号为：CCTCC No：M209119，2009年5月30日在中国典型培养物保藏中心保藏。该杈戴氏霉菌株在查氏培养基上，40℃下培养7d，菌落平展，绒毛状，淡灰黄色，背面浅灰色；菌丝宽1.2-3.5μm；无明显的分生孢子梗，瓶梗单生，直接着生在气生菌丝或菌丝突起上，基部椭圆膨大或锥形，顶端突然变细或逐渐变细成长的颈部，常二叉形，乃至分枝状。分生孢子光滑，长椭圆或卵形，聚集成长链状。本菌株从山东省烟台市大豆土样中分离获得，为中国本土的菌株，能适应本地的自然环境。该杈戴氏霉能耐高温、产漆酶，在堆肥、垃圾及食用菌栽培料的处理中具有潜在应用价值。

权利要求

1.一株耐热产漆酶的杈戴氏霉，其特征在于该霉属于粪壳菌目、戴氏霉属，菌株为杈戴氏霉Taifanglania furcata GZUIFR-H104.1，菌株保藏号为：CCTCC No：M209119，2009年5月30日在中国典型培养物保藏中心保藏。

2.如权利要求1所述杈戴氏霉产漆酶的培养方法，其特征是：按照以下条件：以葡萄糖为碳源，以碳酸氢铵为氮源，碳氮比为葡萄糖20g/L∶碳酸氢铵2.844g/L，产酶培养温度为

40℃，初始pH为6.5，连续培养7天，酶活测定时间为培养的第7天。

说明书

一株耐热产漆酶杈戴氏霉菌株及其产漆酶培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物，进一步来说，涉及漆酶；具体而言，涉及耐热产漆酶杈戴氏霉菌株，还涉及其产漆酶培养方法。

背景技术

[0002] 漆酶(Laccases)是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，不仅存在于漆树的分泌物中，而且广泛地存在于多种植物、昆虫和高等真菌中。其中担子菌纲的白腐菌是漆酶的主要产生者。分泌漆酶的真菌主要集中在担子菌门、子囊菌门以及半知菌类等高等真菌，其中最主要的是担子菌门的白腐真菌。在半知菌中，对漆酶的研究报道不多。特别是在拟青霉属中，仅报道了膨大拟青霉Paecilomyces inflatus具有分解木质素的能力。近年来，漆酶的研究引起了社会的重视，在中国专利申请件中，就有03156878.5号“一种漆酶及其编码基因与工程菌”、200310118373.0号“一种血红密孔菌GW菌漆酶的制备方法”、
200410034016.0号“一种漆酶及其生产方法与专用生产菌株”、200410007200.6号“新漆酶的表达载体、表达微生物菌株、表达的漆酶蛋白及其应用”、200510086586.9号“从盐肤木筛选漆酶内生菌及通过固态发酵制漆酶的方法”、200610039351.9号“漆酶高产菌的快速筛选方法”等属于漆酶的生物技术。漆酶在生物纸浆及其漂白、环境污染治理、生物除污、饲料加工及堆肥、食品工业、新能源、有机合成、生物及免疫检测等方面均有广泛的应用。因此，研究与开发产漆酶意义重大。

发明内容

[0003] 提供所述菌株产漆酶的培养方法。

[0004] 本发明提供的耐高温、产漆酶的杈戴氏霉，属于粪壳菌目、戴氏霉属，菌株为杈戴氏霉Taifanglania furcata GZUIFR-H104.1，菌株保藏号为：CCTCC No：M209119，2009年5月30日在中国典型培养物保藏中心保藏。

[0005] 上述杈戴氏霉菌株是从山东烟台大豆地土样中分离而获得，在查氏培养基上，40℃下培养7d，菌落平展，绒毛状，淡灰黄色，背面浅灰色；菌丝宽
1.2-3.5μm；无明显的分生孢子梗，瓶梗单生，直接着生在气生菌丝或菌丝突起上，(3.7-)4.0-20.1(-23.3)×1.8-4.5μm，基部椭圆膨大或锥形，顶端突然变细或逐渐变细成长的颈部，长4.7-13.9(-14.8)μm，常二叉形，乃至分枝状。分生孢子光滑，长椭圆或卵形，(3.6-)4.0-7.9×1.9-3.9(-4.3)μm，聚集成长链状。

[0006] 本发明提供的上述GZUIFR-H104.1菌株产漆酶的培养方法是：按照以下条件，以葡萄糖为碳源，以碳酸氢铵为氮源，碳氮比为葡萄糖20g/L∶碳酸氢铵2.844g/L，产酶培养温度为40℃，初始pH为6.5，连续培养7天，酶活测定时间为培养的第7天。

[0007] 发明人指出：不同金属离子对酶活的影响差异显著。在5mmol/L的浓度下，Mn2+，2+ 3+ 2+ 2+
Ca 均表现出明显的增强作用，Fe ，Zn ，Cu 表现出明显的抑制作用。在0.0005-0.05mmol/
2+ 2+ 3+
L的浓度梯度范围内，当Mn ，Cu 为0.5mmol/L时，酶活最高，低浓度的Fe 对菌株产酶稍有增强作用。

[0008] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：本菌株从山东省烟台市大豆土样中分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。该杈戴氏霉能耐高温、产漆酶，在堆肥、垃圾及食用菌栽培料的处理中具有潜在应用价值。 附图说明

[0009] 图1杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株在查氏培养基上的菌落及产孢结构； [0010] 图2杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株在测试培养基上氧化带直径与菌落生长比较图(培养5天)；

[0011] 图3培养基起始pH对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产漆酶的影响；

[0012] 图4培养温度对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产酶的影响；

[0013] 图5Fe3+对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产酶的影响；

[0014] 图6Cu2+对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产酶的影响；

[0015] 图7Mn2+对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产酶的影响。

具体实施方式

[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。

[0017] 实施例1菌株的分离鉴定

[0018] 1.实验材料与方法

[0019] 1.1材料来源

[0020] 采自山东省烟台市大豆土样。

[0021] 马丁氏培养基：KH2PO41g，MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g，孟加拉红1/300mL。灭菌条件：121℃，30min。用前待温度冷却在40℃左右，加青霉素20/mg，链霉素40μg/mg。

[0022] 查氏培养基：NaNO32g，K2HPO41g，KCL 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，蔗糖30g，琼脂17-20g，水1000mL，pH自然。灭菌条件：121℃，30min。

[0023] 1.2菌株的分离纯化

[0024] 称取2g土样加入盛有20mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡10min左右，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。

[0025] 吸取1mL土壤悬液到9mL无菌水中，依次按10倍法稀释，通常稀释在10-1～10-3。 [0026] 采用混菌法接种，吸取1mL悬液于直径为9厘米的灭菌培养皿中，然后倾注已熔化并冷却到45℃的双抗马丁氏培养基，充分混匀，待凝固后倒置，40℃保温培养。待菌落长出后转移到新的培养皿进行纯化，获得GZUIFR-H104.1菌株。

[0027] 1.3分离株的鉴定

[0028] 把待鉴定菌株移入查氏培养基中，采用点中法接种，倒置放于40C温箱中培养7d。采用胶带粘帖法进行标本片的制作并采用Motic数码显微镜进行显微摄影，描述记载待定菌株的菌落特征和微观形态特征。

[0029] 2.实验结果

[0030] 2.1菌株的形态描述

[0031] 通过经典形态学鉴定，该分离株为杈戴氏霉，具体描述如下：

[0032] 在查氏培养基上，40℃，7d，菌落平展，绒毛状，淡灰黄色，背面浅灰色。菌丝宽1.2-3.5μm。没有明显的分生孢子梗，瓶梗单生，直接着生在气生菌丝或菌丝突起上，(3.7-)4.0-20.1(-23.3)×1.8-4.5μm，基部椭圆膨大或锥形，顶端突然变细或逐渐变细成长的颈部，长4.7-13.9(-14.8)μm，常二叉形，乃至分枝状。分生孢子光滑，长椭圆或卵形，(3.6-)4.0-7.9×1.9-3.9(-4.3)μm，聚集成长链状。

[0033] 实施例2培养基配方对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1产漆酶的影响

[0034] 1.实验材料与方法

[0035] 1.1试验用培养基

[0036] 摇瓶发酵培养基：蔗糖2g，NH4NO31g，K2HPO41g，KCL 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，CuSO40.01g，VB10.015g，水1000ml，pH自然。

[0037] 1.2液体发酵培养

[0038] 将研究菌株接种在含固体PDA培养基的培养皿中，40℃培养5d，用直径7mm的打孔器打空，然后将菌丝块接种到装有50ml复筛液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接3孔菌丝块，每组作3个重复，放入40℃培养箱中，保温静止培养，测定酶活力。

[0039] 1.3粗酶液的制备

[0040] 孢子液的制备：取4℃冰箱保藏菌株斜面，用接种环挑取少量菌丝，采用划线法将其接种于PDA固体培养基上，37℃培养箱中培养。5d后发现所接微生物已大量扩增，用灭菌的5‰Tween-80轻轻洗出平板表面上的分生孢子，并在无菌条件下用16层纱布过滤，所得孢子悬浮液以血球计数器计数后置于4℃冰箱保存。

[0041] 粗酶液的提取：移取适量孢子液至300ml三角烧瓶中(内装80ml产酶培养液)，于40℃，120rpm摇床上培养。7d后将适量发酵液于6000rpm下离心8min，取上清夜即可。 [0042] 漆酶活力的测定

[0043] ①取5ml的具塞比色管1#中加入适量粗酶液，用pH4.5的50mmol/L琥珀酸钠(含1mmol/L的愈创木酚)缓冲液定容至5ml，混合均匀，作为样品管。

[0044] ②取另一支5ml的具塞比色管2#，加入等量已煮沸灭活的粗酶液，用pH4.5的50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(含1mmol/L的愈创木酚)定容至5ml，混合均匀，作为空白管。 [0045] ③将样品、空白管置于40℃恒温水浴锅中反应30min。

[0046] ④将样品和空白置于1cm比色皿中，在465nm下测量其吸光度。

[0047] 以1min钟内催化氧化1mmol/L愈创木酚的酶量定义为1个酶活单位(U)。已知4 -1 -1
465nm处愈创木酚摩尔消光系数为：ε465＝1.21×10M cm 。

[0048] 2.实验结果

[0049] 2.1不同碳源对产漆酶的影响

[0050] 40℃培养条件下，采用静止和振荡(120r/min)两种培养方式。以除去碳源的发酵培养基作为基础培养基，加入葡萄糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉和小麦粉五种糖类作碳源，浓度分别为2g/L和10g/L进行试验。

[0051] 表1振荡和静止培养条件下，不同碳源对杈戴氏霉菌株产漆酶的影响 [0052]

[0053] 以2g/L果糖作为碳源的发酵液酶活最高，10g/L的葡萄糖作为碳源的次之；振荡培养条件下，以10g/L果糖作为碳源的发酵液酶活最高，10g/L的葡萄糖作为碳源的次之。振荡培养条件下，菌株在各种碳源水平中总体上出现最高酶活的时间要比静止培养早。所以选用静止培养方式来进行下一步的试验。10g/L的葡萄糖作碳源时持续产酶时间比2g/L的果糖长，所以选定10g/L的葡萄糖作为菌株产漆酶的最佳碳源。

[0054] 2.2不同氮源对产漆酶的影响

[0055] 除去氮源的发酵液体培养基作为基础培养基，加入不同种类的氮源进行试验，40℃静止培养。从表2的结果看出：对产酶影响方面，无机氮源优于有 机氮源。在有机氮源中，以尿素作为氮源的酶活较高，酵母膏和黄豆粉未检测到漆酶酶活；在无机氮源中，以硝酸钾作为氮源的发酵液酶活最高，以碳酸氢铵作为氮源的发酵液的酶活次之，但二者酶活相差不大，故均可作为菌株产漆酶的适合氮源，由于以碳酸氢铵作氮源时，在整个培养过程中，产酶持续时间比硝酸钾作氮源时相对要长，从能够获得的漆酶酶活总量来考虑，选定碳酸氢铵作为菌株产漆酶的最佳氮源。

[0056] 表2不同氮源对杈戴氏霉产漆酶的影响

[0057]

[0058] 2.3不同碳氮比对菌株产漆酶的影响

[0059] 除去碳、氮源的发酵液体培养基作为基础培养基，碳源选用葡萄糖，设定六个浓度：2g/L，5g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L；氮源选 用碳酸氢铵，设定四个浓度：0.474g/L(6mmol/L)，0.948g/L(12mmol/L)，1.896g/L(24mmol/L)，2.844g/L(36mmol/L)，40℃静止培养。

[0060] 在设定的24个C∶N组合试验中，低碳高氮水平下，漆酶酶活很低，C∶N低于2.1，几乎不产漆酶。5∶36的C∶N为1.8，在培养的前6d，酶活很低，第7d开始增加，说明菌株产漆酶活力可能与碳源的绝对量有关，不一定与比值大小相关性大。 [0061] 20∶12，20∶24，20∶36从第4d开始出现酶活，并增加，产酶持续的时间长。 [0062] 5∶6，10∶12，20∶24，30∶36的C∶N比相同，酶活力不同，20∶24的酶活最大，说明适当的碳氮绝对量酶活力高。

[0063] 在设定的组合试验中，C∶N比为20∶36的酶活力最高，且产酶时间长，选定该组合为最适的碳氮比，即葡萄糖浓度为20g/L，碳酸氢铵为浓度2.844g/L。

[0064] 表3不同碳氮比对产酶的影响

[0065]

[0066]

[0067] 实施例3培养条件对杈戴氏霉GZUIFR-H104.1产漆酶的影响

[0068] 1.实验材料与方法

[0069] 1.1试验用培养基

[0070] 摇瓶发酵培养基：蔗糖2g，NH4NO31g，K2HPO41g，KCL 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，CuSO40.01g，VB10.015g，水1000ml，pH自然。

[0071] 1.2液体发酵培养

[0072] 将研究菌株接种在含固体PDA培养基的培养皿中，40℃培养5d，用直径7mm的打孔器打空，然后将菌丝块接种到装有50mL复筛液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌丝块，每组作3个重复，放入40℃培养箱中，保温静止培养，测定酶活力。

[0073] 1.3粗酶液的制备

[0074] 孢子液的制备：取4℃冰箱保藏菌株斜面，用接种环挑取少量菌丝，采用划线法将其接种于PDA固体培养基上，37℃培养箱中培养。5d后发现所 接微生物已大量扩增，用灭菌的5‰Tween-80轻轻洗出平板表面上的分生孢子，并在无菌条件下用16层纱布过滤，所得孢子悬浮液以血球计数器计数后置于4℃冰箱保存。

[0075] 粗酶液的提取：移取适量孢子液至300ml三角烧瓶中(内装80mL产酶培养液)，于40℃，120r/min摇床上培养。7d后将适量发酵液于6000r/min下离心8min，取上清夜即可。

[0076] 漆酶活力的测定

[0077] ①取5mL的具塞比色管1#中加入适量粗酶液，用pH4.5的50mmol/L琥珀酸钠(含1mmol/L的愈创木酚)缓冲液定容至5mL，混合均匀，作为样品管。

[0078] ②取另一支5mL的具塞比色管2#，加入等量已煮沸灭活的粗酶液，用pH4.5的50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(含1mmol/L的愈创木酚)定容至5mL，混合均匀，作为空白管。 [0079] ③将样品、空白管置于40℃恒温水浴锅中反应30min。

[0080] ④将样品和空白置于1cm比色皿中，在465nm下测量其吸光度。

[0081] 以1min钟内催化氧化1mmol/L愈创木酚的酶量定义为1个酶活单位(U)。已知4 -1 -1
465nm处愈创木酚摩尔消光系数为：ε465＝1.21×10M ·cm 。

[0082] 2.实验结果

[0083] 2.1不同培养时间对菌株产酶活性的影响

[0084] 培养5天后，杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产生的氧化带的直径与菌落生长直径的差值最大。综合比较氧化带产生情况和菌落生长状况，即既要求氧化带直径大，又要求菌株的生物量适合，选定杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株作为进一步研究的实验菌株，0.03％的愈创木酚浓度作为菌株产漆酶条件等进一步研究的底物浓度。

[0085] 2.2初始pH值对产酶水平的影响

[0086] 将最适发酵培养基的初始pH值分别调至不同的大小(3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5.，9.5，10.5)，40℃静止培养7d，制备粗酶液，测定漆酶活性。

[0087] 真菌最适生长pH值通常为弱酸性。由图可以看出，pH值为6时漆酶酶活最高，为最适产酶初始pH值。当pH值低于4时菌体几乎无生长，发酵液的漆酶活力很低，而过高的pH值也不利于菌体的生长，漆酶酶活相应就降低。

[0088] 选用筛选出的最适培养基，将其初始pH值调至3.5至10.5，40℃进行培养，发酵7d测发酵液酶活。结果是，pH值为6.5时菌株产生的漆酶活力最高，在适当的中、碱性条件下，酶活高于酸性条件，pH值为3.5和10.5时菌体几乎不生长。

[0089] 2.3发酵温度对产酶水平的影响

[0090] 将菌株接种到筛选出的最适发酵培养基中，设置不同的培养温度(20℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃)，每组3个重复

[0091] 不同培养温度条件下培养7d后，杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产漆酶的酶活差异较大，40℃下漆酶的酶活力最高。在较高温度的培养下，生物量较多，漆酶活力较高。可见，中温培养对菌体的生长不利，但培养温度高于40℃后，酶活急剧下降，因此40℃是该菌株液体发酵的最佳培养温度。

[0092] 在以上最佳的培养基中接种，在不同温度下对菌株培养，进行产酶试验，7d后分别测发酵液的酶活力。结果是，40℃培养条件下菌株产生的漆酶酶活性最高，30℃和35℃培养条件下也能检测到相当量的酶活，45℃和50℃下菌体几乎不生长，这与真核生物的生长上限温度有关。

[0093] 2.4不同金属离子对产酶水平的影响

[0094] 在最佳培养基中，分别添加5mmol/L的Ca2+，Mg2+，Zn2+，Mn2+， Cu2+，Fe3+六种金属离子，以不加相应离子的培养液为对照，40C静止培养7d，制备粗酶液，测定漆酶活性。 [0095] 在最佳培养基中分别添加5mmol/L的六种不同金属离子，40℃静止培养，7d后分3+ 2+ 2+
别测发酵液的酶活力，以不加相应金属离子的培养作为对照。结果是，Fe ，Cu 和Zn 有明
2+ 2+ 2+ 2+
显的抑制作用，Ca 和Mn 有增强作用，Mg 影响不大。其中Cu 对GZUIFR-H104.1菌株菌
2+ 2+
株产漆酶有明显抑制作用，显然与漆酶是一种含Cu 的蛋白酶相矛盾，这可能与添加的Cu
2+ 3+
浓度过高有关。所以设定不同Cu 浓度观察其对GZUIFR-H104.1菌株产酶的影响，对Fe
2+
和Mn 也进行了相应的考察。

[0096] 表4金属离子对产酶的影响

[0097]

[0098] 2.5五种不同金属离子浓度对产酶的影响2+ 2+ 3+

[0099] 设定5个Cu 、Mn 、Fe 0.0005mmol-5mmol之间的不同浓度，以不加相应离子的培养液为对照。40℃静止培养7d，制备粗酶液，测定漆酶活性。3+

[0100] 从结果可看出，低浓度的Fe 对菌株产酶有增强作用，浓度增加到0.5mmol/L时开始产生抑制作用。2+

[0101] 在Cu 浓度0.0005-0.05mmol/L之间，随着浓度的增加，酶活呈递增 趋势，0.5mmol/L时，酶活最高，随后酶活迅速下降，浓度为5mmol/L时，菌体则不生长。
2+

[0102] 在设定的5个浓度范围内，Mn 对菌株产酶均具有增强作用，浓度在0.0005-0.5mmol/L之间时，随着浓度的增加，酶活呈递增趋势，0.5mmol/L时，酶活最高，随
2+
后酶活下降，但仍高于未加Mn 的对照。

[0103] 综上所述，杈戴氏霉GZUIFR-H104.1菌株产漆酶的最佳培养基配方和培养条件为：最适碳源为葡萄糖，最适氮源为碳酸氢铵，最佳碳氮比为葡萄糖20g/L，碳酸氢铵2.844g/L，最适产酶培养温度为40℃，最适初始pH为6.5，最佳酶活测定时间为培养的第7
2+ 2+
天。不同金属离子对酶活的影响差异显著。在5mmol/L的浓度下，Mn ，Ca 均表现出明显
3+ 2+ 2+
的增强作用，Fe ，Zn ，Cu 表现出明显的抑制作用。在0.0005-0.05mmol/L的浓度梯度范
2+ 2+ 3+
围内，当Mn ，Cu 为0.5mmol/L时，酶活最高，低浓度的Fe 对菌株产酶稍有增强作用。 [0104] 以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。