高效转化谷氨酰胺合成L-茶氨酸的大肠杆菌菌株及其应用转让专利
申请号 : CN200910035096.4
文献号 : CN101643712B
文献日 : 2010-12-29
发明人 : 殷志敏 , 沈青红 , 吕志祥 , 王正才 , 傅珒 , 张正平
申请人 : 南京师范大学 , 常州阿格罗生物科技有限公司
摘要 :
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种生物转化合成茶氨酸的大肠杆菌菌株及其应用。所说的高效转化L-谷氨酰胺和乙胺的大肠杆菌，是大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号CCTCC No.M 209166。该菌株高产茶氨酸合成酶，高效转化谷氨酰胺和乙胺为L-茶氨酸并在工业化生产过程中获得成功；对谷氨酰胺的转化超过80％。
权利要求 :
1.一种高效转化L-谷氨酰胺和乙胺产生L-茶氨酸大肠杆菌的菌株，是大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号CCTCC No.M 209166。
2.权利要求1所说的高效转化合成L-茶氨酸大肠杆菌的菌株在制备L-茶氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所说的应用，其特征在于，具体是：
(1)培养菌株至OD600在2.0以上，得到酶活单位在12-23U/毫升的菌体，收集菌体，高压破碎菌体，得酶液；
(2)将酶液加入到谷氨酰胺和乙胺溶液中进行生物转化，经发酵培养后，得富含L-茶氨酸的发酵液；其中，所加入的谷氨酰胺为0.2-0.8M，乙胺溶液为40-100ml/升，加入酶活单位在4-8U/毫升，转化温度控制在20-37℃。
说明书 :
技术领域：
本发明涉及高效生物转化生产茶氨酸的大肠杆菌菌株以及在工业化制备茶氨酸中的应用。
背景技术
L-茶氨酸是绿茶中特有的一种氨基酸，50年代日本学者首次从茶叶中提取、精制出茶氨酸，并确定了它的化学结构，此后许多学者对其进行了大量的研究工作一般说来，茶氨酸的制备方法主要有植物细胞组培、化学合成、微生物发酵和离子交换树脂分离等四种。大量的研究表明：茶氨酸具有多种营养保健功能，安神放松、促进大脑功能、降血压、抗肿瘤和抗疲劳作用。茶氨酸作用一种新兴的食品添加剂，具有安全无毒的特性，已经广泛的应用于医药保健和食品工业中。
L-茶氨酸(L-theanine)是茶叶游离氨基酸的主体，是构成茶叶自然品质的主要成分之一，约占整个游离氨基酸的50％以上，春茶中含量可达1.5％-2％，嫩茎中可高达3％。L-茶氨酸作为茶叶中的一种特有氨基酸，是构成绿茶风味的物质。L-茶氨酸在茶树根部合成，通过枝干转移到叶并在叶中蓄积，但一遇阳光照射就会转化为儿茶酸。因此，L-茶氨酸在覆盖栽培的高级绿茶叶中含量多，在粗茶叶中含量较少。1950年酒户弥二郎博士在研究玉露茶鲜爽滋味成分时，从新梢中分离鉴定出L-茶氨酸，1964年日本将L-茶氨酸定为食品添加剂使用，其用途是作为绿茶风味增强剂，但由于当时提取的L-茶氨酸价格非常昂贵，在食品中几乎无法使用推广。1992年日本太阳化学公司研制成功的L-茶氨酸，价格低廉、纯度高且能大规模工厂化生产，使之作为商品可以在食品中添加应用。
由于L-茶氨酸(L-theanine)通过化学合成存在手性分离的难点，制约了该方法在大规模工厂化生产中的应用，因此，利用微生物生物发酵成为大规模工厂化生产的必然方向，但筛选高效转化茶氨酸大肠杆菌菌株十分困难。
L-茶氨酸(L-theanine)是茶叶游离氨基酸的主体，是构成茶叶自然品质的主要成分之一，约占整个游离氨基酸的50％以上，春茶中含量可达1.5％-2％，嫩茎中可高达3％。L-茶氨酸作为茶叶中的一种特有氨基酸，是构成绿茶风味的物质。L-茶氨酸在茶树根部合成，通过枝干转移到叶并在叶中蓄积，但一遇阳光照射就会转化为儿茶酸。因此，L-茶氨酸在覆盖栽培的高级绿茶叶中含量多，在粗茶叶中含量较少。1950年酒户弥二郎博士在研究玉露茶鲜爽滋味成分时，从新梢中分离鉴定出L-茶氨酸，1964年日本将L-茶氨酸定为食品添加剂使用，其用途是作为绿茶风味增强剂，但由于当时提取的L-茶氨酸价格非常昂贵，在食品中几乎无法使用推广。1992年日本太阳化学公司研制成功的L-茶氨酸，价格低廉、纯度高且能大规模工厂化生产，使之作为商品可以在食品中添加应用。
由于L-茶氨酸(L-theanine)通过化学合成存在手性分离的难点，制约了该方法在大规模工厂化生产中的应用，因此，利用微生物生物发酵成为大规模工厂化生产的必然方向，但筛选高效转化茶氨酸大肠杆菌菌株十分困难。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株高效转化谷氨酰胺和乙胺的大肠杆菌，以及该菌株在制备L-茶氨酸中的应用。
本发明所说的菌株，是大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号CCTCC No.M209166。
本发明还公开了上述菌株在制备L-茶氨酸中的应用。具体是：(1)培养南师一号至OD600大于2.0，收集菌体，高压破碎菌体，得酶液；
(2)将酶液加入到谷氨酰胺和乙胺溶液中进行生物转化，经发酵培养后，得富含L-茶氨酸的发酵液。
上述步骤(1)中培养得到酶活单位在12000-23000/升的菌体。
上述步骤(2)中，谷氨酰胺优选为0.2-0.8M，在每升反应液中乙胺溶液40-100ml，加入酶活单位为4000-8000/升，转化温度控制在20-37℃。
南师一号的培养条件：将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升
采用该大肠杆菌菌株在摇床-50升发酵罐-500升发酵罐-10吨发酵罐培养后获得大量酶活单位在23000/升的菌体，在5吨反应釜中对0.6M/L谷氨酰胺进行生物转化，经40～48h的25℃酶反应后得到0.49M/L的L-茶氨酸，对谷氨酰胺的转化率超过80％，该菌株成功地在大规模工业化生产中获得应用。
本发明的有益效果体现在：通过高浓度的乙胺(0.45M)进行培育筛选，获得的一株高效生物转化谷氨酰胺为茶氨酸的大肠杆菌菌株，该菌株不仅能有效通过利用谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，而且该菌株能高效对谷氨酰胺和乙胺转化为L-茶氨酸，其对谷氨酰胺的转化率超过了80％；且其特性经数代的培养后保持不变，合成茶氨酸的能力与开始的亲代相同，是今后工业化生产茶氨酸的有效的生产菌株。
本发明所说的菌株，是大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号CCTCC No.M209166。
本发明还公开了上述菌株在制备L-茶氨酸中的应用。具体是：(1)培养南师一号至OD600大于2.0，收集菌体，高压破碎菌体，得酶液；
(2)将酶液加入到谷氨酰胺和乙胺溶液中进行生物转化，经发酵培养后，得富含L-茶氨酸的发酵液。
上述步骤(1)中培养得到酶活单位在12000-23000/升的菌体。
上述步骤(2)中，谷氨酰胺优选为0.2-0.8M，在每升反应液中乙胺溶液40-100ml，加入酶活单位为4000-8000/升，转化温度控制在20-37℃。
南师一号的培养条件：将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升
采用该大肠杆菌菌株在摇床-50升发酵罐-500升发酵罐-10吨发酵罐培养后获得大量酶活单位在23000/升的菌体，在5吨反应釜中对0.6M/L谷氨酰胺进行生物转化，经40～48h的25℃酶反应后得到0.49M/L的L-茶氨酸，对谷氨酰胺的转化率超过80％，该菌株成功地在大规模工业化生产中获得应用。
本发明的有益效果体现在：通过高浓度的乙胺(0.45M)进行培育筛选，获得的一株高效生物转化谷氨酰胺为茶氨酸的大肠杆菌菌株，该菌株不仅能有效通过利用谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸，而且该菌株能高效对谷氨酰胺和乙胺转化为L-茶氨酸，其对谷氨酰胺的转化率超过了80％；且其特性经数代的培养后保持不变，合成茶氨酸的能力与开始的亲代相同，是今后工业化生产茶氨酸的有效的生产菌株。
附图说明
图1是实施例二菌生长曲线附图
图2是实施例二酶活单位曲线附图
图3是实施例三菌生长曲线附图
图4实施例三菌生长曲线附图
图5实施例四菌生长曲线附图
图6是实施例四酶活单位曲线附图
图2是实施例二酶活单位曲线附图
图3是实施例三菌生长曲线附图
图4实施例三菌生长曲线附图
图5实施例四菌生长曲线附图
图6是实施例四酶活单位曲线附图
具体实施方式
实施例一菌株筛选
将茶叶树土壤中分离出23株大肠杆菌菌株分别接种到含乙胺(0.45M)的LB培养基中进行过夜培养。
培养24小时后用显微镜对培养的大肠杆菌菌株进行观察，发现其中3株大肠杆菌菌株的细胞形态正常且有较多的细胞数，而其它20株的细胞形态为不规则形，且细胞数非常少。
将对数生长期的大肠杆菌细胞中加入400mM的谷氨酰胺和1M乙氨进行生物转化，经12小时的进一步发酵，大部分谷氨酰胺将被大肠杆菌菌株中的L-茶氨酸合成酶转化为茶氨酸。
对以上3株大肠杆菌的发酵转化茶氨酸结果经HPLC分析发现，其中有一株大肠杆菌能对谷氨酰胺的转化率超过了80％，我们将其命名为大肠杆菌南师一号，进一步在1升反应体系中进行生物转化实验发现，该菌株合成茶氨酸的浓度高达51.2克，经过数代的培养，该菌株的合成茶氨酸的能力保持不变。
于2009年7月28日将南师一号送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：武汉大学生命科学学院；保藏菌株分类命名为：大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号，保藏编号CCTCC No.M 209166。
实施例二
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.0～2.2(图1)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到12000～14000(图2)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成酶。
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和70％(质量)乙胺水溶液加4000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的25℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率高达70％。
用0.2、0.8M/L谷氨酰胺重复上述实验，结果基本相同。
实施例三
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL自主MB培养基，每升培养基含Na2HPO4 15g，KH2PO4 5g，NaCl 1g，NH4Cl2g，甘油3ml，蛋白胨10g；37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL自主MB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.1～2.3(图3)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到15000～16000(图4)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成的gamma-谷氨酰转移酶
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加5000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的25℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率达到80％。
实施例四
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃震荡培养4h后，补加60mL LB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.8～3.0(图5)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到18000～22000(图6)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成酶。
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加6000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的20-37℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率超过80％。
实施例五
将在10吨发酵罐培养后获得大量酶活单位在23000/升的菌体经高压破碎后取100升酶液，加入到含4吨底物(0.6M/L L-谷氨酰胺以及2M乙胺的溶液中，经48h的25℃酶反应后得到0.49M/L的L-茶氨酸，对谷氨酰胺的转化率超过80％。
实验仪器与材料：
摇床；三角烧瓶；微生物超净工作台；LB培养基；HPLC；高压破碎仪；发酵罐，反应釜。
将茶叶树土壤中分离出23株大肠杆菌菌株分别接种到含乙胺(0.45M)的LB培养基中进行过夜培养。
培养24小时后用显微镜对培养的大肠杆菌菌株进行观察，发现其中3株大肠杆菌菌株的细胞形态正常且有较多的细胞数，而其它20株的细胞形态为不规则形，且细胞数非常少。
将对数生长期的大肠杆菌细胞中加入400mM的谷氨酰胺和1M乙氨进行生物转化，经12小时的进一步发酵，大部分谷氨酰胺将被大肠杆菌菌株中的L-茶氨酸合成酶转化为茶氨酸。
对以上3株大肠杆菌的发酵转化茶氨酸结果经HPLC分析发现，其中有一株大肠杆菌能对谷氨酰胺的转化率超过了80％，我们将其命名为大肠杆菌南师一号，进一步在1升反应体系中进行生物转化实验发现，该菌株合成茶氨酸的浓度高达51.2克，经过数代的培养，该菌株的合成茶氨酸的能力保持不变。
于2009年7月28日将南师一号送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：武汉大学生命科学学院；保藏菌株分类命名为：大肠杆菌(Escherichia coli)南师一号，保藏编号CCTCC No.M 209166。
实施例二
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.0～2.2(图1)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到12000～14000(图2)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成酶。
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和70％(质量)乙胺水溶液加4000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的25℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率高达70％。
用0.2、0.8M/L谷氨酰胺重复上述实验，结果基本相同。
实施例三
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL自主MB培养基，每升培养基含Na2HPO4 15g，KH2PO4 5g，NaCl 1g，NH4Cl2g，甘油3ml，蛋白胨10g；37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL自主MB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.1～2.3(图3)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到15000～16000(图4)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成的gamma-谷氨酰转移酶
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加5000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的25℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率达到80％。
实施例四
(1)将筛选到的大肠杆菌南师一号接种于LB固体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，37℃培养12h，挑单菌落接种于10mL LB液体培养基，每升培养基含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃震荡培养12h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃震荡培养4h后，补加60mL LB液体培养基，37℃震荡培养6～8h，OD600达到2.8～3.0(图5)，酶活单位(南京建成生物试剂盒检测)OD530达到18000～22000(图6)，离心15min收集菌体，经高压破碎，获得茶氨酸合成酶。
(2)按每0.6M/L谷氨酰胺和乙胺水溶液加6000单位的茶氨酸合成酶，经40～48h的20-37℃酶反应后，经HPLC检测发现其对谷氨酰胺的转化率超过80％。
实施例五
将在10吨发酵罐培养后获得大量酶活单位在23000/升的菌体经高压破碎后取100升酶液，加入到含4吨底物(0.6M/L L-谷氨酰胺以及2M乙胺的溶液中，经48h的25℃酶反应后得到0.49M/L的L-茶氨酸，对谷氨酰胺的转化率超过80％。
实验仪器与材料：
摇床；三角烧瓶；微生物超净工作台；LB培养基；HPLC；高压破碎仪；发酵罐，反应釜。