盐芥V-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用

摘要

本发明公开一种盐芥V-焦磷酸酶基因(TsVP1)启动子序列和其缺失突变体的应用，是从盐生植物盐芥的基因组文库中筛选出携带TsVP1启动子的克隆，截取TsVP1编码框5′上游的2200核甘酸序列为全长启动子，通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，然后分别与gus基因融合，重组到植物表达载体中转化拟南芥。检测转基因植株的GUS酶活性，确定了TsVP1启动子和其部分缺失突变体是盐胁迫诱导型启动子。其中T5启动子不仅序列短(667bp)，而且具有根特异性。将TsVP1启动子和T5启动子分别与来自大肠杆菌的betA基因相连，转入烟草和玉米，确定了TsVP1启动子和T5启动子在转基因烟草和玉米中能正常行使功能，是盐胁迫诱导型的强启动子，并在植物基因工程的产业化开发中有重要应用价值。

权利要求

1.盐芥V-焦磷酸酶基因启动子或其缺失突变体在制备转基因植物中的应用，其中，所述V-焦磷酸酶基因启动子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述缺失突变体为V-焦磷酸酶基因启动子的序列的-667位到+1位。

2.如权利要求1所述的应用，其中，从盐芥的基因组中克隆得到V-焦磷酸酶基因启动子，以该启动子为模板扩增获得其缺失突变体，将V-焦磷酸酶基因启动子或其缺失突变体作为启动子和抗逆基因连接，从而构建融合基因，并将构建的融合基因转入植物，检测该融合基因在转基因植物中的表达。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述V-焦磷酸酶基因启动子或所述缺失突变体是盐胁迫诱导型的启动子。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述缺失突变体具有根特异性。

5.如权利要求1所述的应用，其中通过转入的融合基因获得对逆境抗性提高或降低的转基因植株。

6.如权利要求5所述的应用，所述转基因植物是转基因烟草、转基因玉米、转基因小麦、转基因棉花或转基因大豆。

说明书

盐芥V-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用

技术领域

[0001] 本发明属农作物和林木的生物工程育种领域，具体说，涉及一种植物基因启动子序列(盐芥编码液泡膜焦磷酸酶基因TsVP1启动子的序列)的克隆、改造和应用。 [0002] 背景技术

[0003] 盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度Na+对许多植物的生长和发育造成很大的伤害。土壤盐碱化和次生盐碱化问题，已经成为世界灌溉农业可持续发展的制约因素。随着人口的增长以及水资源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和利用盐碱地已成为关系国计民生的重要课题。近年来，随着对拟南芥、水稻等模式生物的深入研究和生物技术的迅速发展，已为培育高度盐耐性作物新品种提供了新思路、新方法和新材料，利用分子生物学方法和手段发现新的遗传资源是培育高度耐盐耐旱新品种的重要环节。

[0004] 随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些作物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量已经成为一种重要的技术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。

[0005] 常见的启动子可分为组成型启动子、组织特异启动子和诱导表达启动子。不同启动子启动的基因表达强度有很大差别，往往具有明显的种属特异性。在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。组织特异启动子由于其表达的空间特异性，可将外源基因在转基因植物中定位表达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，而且可以提高外源基因产物在特定部位的浓度，增加转基因的效果。目前组织特异性启动子主要应用在以下几方面：①提高作物的抗冻、抗旱、抗盐能力和防止水果腐烂，②改良花卉品质、控制观赏花卉的颜色，③提高植物的抗病性、抗虫性和抗除草剂能力，④开发生物反应器用于生物制药，⑤创建雄性不育系和恢复系，⑥用于植物的分化发育研究等(王瑞琲，2008)。诱导型启动子可使转基因在特定条件下表达，在植物抗逆基因工程中急待开放应用。已报道的诱导型启动子有胁迫诱导启动子和化学物质诱导启动子两大类，前一类包括热诱导启动子、冷诱导启动子、干旱诱导启动子、损伤诱导启动子等，后一类有激素诱导启动子、乙醇诱导启动子、固醇诱导启动子等。尽管目前已有一定数量的器官特异性启动子和诱导表达的启动子，但在多数工作中，所用的启动子仍为组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35SRNA基因启动子(CaMV35S)、玉米泛素基因启动子(Ubi1)，水稻肌动蛋白基因启动子(Act1)等，其主要原因是可用的诱导型启动子和组织特异性启动子或受专利保护或启动子的启动能力较弱。

[0006] 在植物基因工程中大量应用组成型启动子，使用组成型强启动子可以提高外源基因的表达强度，在一定程度上对目的基因的表达有很强的促进作用，但是随之也带来了一些问题，如组成型启动子使基因产物在宿主的整个生命周期以及所有的组织器官持续表达不仅造成了宿主体内资源的浪费，而且往往导致转基因材料的某些性状的改变。影响 转基因材料正常的生长发育，使其出现发育迟缓，植株矮化等现象。如Shan等在棉花中组成型表达GhDREB1基因，虽然提高了植物的抗逆性，但是其开花期与对照植株相比明显推迟。Nakashima等在水稻中用玉米的泛素基因启动子组成型表达OsNAC6基因，造成植株生长期延长，产量降低。此外，组成型表达一些基因虽然可以增加作物的抗逆性，但是对转基因作物的安全性也造成一定的影响，比如组成型表达抗虫基因可以在一定程度上防止病虫害，但是由于果实或者种子中也存在该蛋白，往往为转基因材料的释放造成一定的困难。 [0007] 近年来，越来越多的科研者乐意采用诱导型启动子或者组织特异性启动子构建植物表达载体。与组成型表达启动子相比，它们启动的转基因只有在特定的环境下或者在特定的组织中才有高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时空表达。Liu等利用组成型启动子CaMV35S和胁迫诱导型启动子RD29A分别启动下游基因AtbZIP17构建载体并转化拟南芥，结果表明这两种组合均可提高拟南芥的抗逆性，但是在正常生长条件下，组成型表达该基因导致转基因材料发育迟缓，但是诱导型表达该基因则没有这种状况。同样，Kazuo等人在水稻中过表达OsNAC6基因，利用组成型启动子导致水稻生长延迟产量降低，但是利用其本身的启动子就可以解决这个问题。Aryadee等在烟草中利用其本身启动子表达基因Rab16A，只有在胁迫条件下该基因才能在叶中大量表达，从而提高其抗逆性，而且转基因植株与对照相比其形态发育以及产量都没有受到影响。

[0008] 虽然诱导型启动子与组成型启动子相比具有很多优点，但是目前已知的诱导型启动子很少，应用比较广泛的主要还是RD29A等比较经典的启动子，而我国具有自主知识产权的胁迫诱导型启动子更是少之又少，因此克隆鉴定新的胁迫诱导型启动子序列并找出其中的核心作用元件具有重要的意义。

[0009] 盐芥是一种生长于盐碱地中的拟南芥近亲物种，也是研究植物抗逆机制的重要模式植物。盐芥和拟南芥的cDNA序列相似性非常高，但是盐芥对于非生物胁迫的抗逆性要远远高于拟南芥，申请人克隆了盐芥中编码液泡膜焦磷酸酶的基因TsVP1，并对其进行了功能分析。该基因在拟南芥中的同源基因是AVP1。将这两个基因分别转入酵母盐敏感突变体，发现它们均能明显提高酵母的抗盐性；在烟草中分别过表达这两个基因也可显著提高烟草的耐盐性，表明这两个基因的功能具有很高的相似性。分别检测这两个基因在盐芥和拟南芥中的表达模式发现，在盐胁迫条件下，TsVP1基因的表达受到明显的诱导作用，而AVP1的表达基本没有变化。这说明二者的基因表达调控机制存在很大的差异，克隆TsVP1基因的启动子序列并对其进行功能分析，寻找其中的关键作用元件具有重要的意义。 [0010] 高等植物启动子一般由两部分组成：一部分是形成普遍性转录结构所需要的，通常称为核心启动区，包括转录起始点及邻近的TATA框；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域，由多个保守序列组成，这些保守序列在不同启动子的位置、种类及拷贝数存在较大差异。两部分都参与基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用，寻找启动子中的关键作用元件对于启动子的改造和利用具有重要意义。

[0011] 发明内容

[0012] 针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种植物基因启动子序列(盐芥编码液泡膜焦磷酸酶基因TsVP1启动子的序列)及其改造和应用。

[0013] 本发明所述的盐芥V-焦磷酸酶基因启动子及其缺失突变体的应用方法是从盐生植物盐芥克隆V-焦磷酸酶基因启动子序列并进行生物信息学分析。

[0014] 大体步骤是从盐生植物盐芥的基因组文库中筛选出携带TsVP1启动子的克隆，截取TsVP1开放读码框5′上游的2200核苷酸序列作为全长启动子序列，以此为模板通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段T2～T7，分别将其与报告基因融合后转入拟南芥，确定了TsVP1启动子和其部分系列缺失突变体是盐胁迫诱导型启动子，其中T5启动子具有较强的根特异性；TsVP1启动子和T5启动子分别与来自大肠杆菌的betA基因相连转入烟草和玉米，确定了它们在转基因烟草和玉米中能正常行使启动功能，是盐胁迫诱导型的强启动子。

[0015] 其中，所述V-焦磷酸酶基因启动子全长序列为V-焦磷酸酶基因(TsVP1)上游2200bp的序列(其序列如序列表SEQ ID NO.3所示)。利用PLANTCARE在线分析软件分析发现，该序列中存在多个调控元件，包括厌氧诱导响应元件ARE，干旱诱导响应元件MBS，ABA响应元件ABRE，热诱导响应元件HSE，水杨酸响应元件TCA element，茉莉酸响应元件CGTCA motif，光诱导响应元件SP1，ACE，AE-box，G-box等(见附图1)。

[0016] 其中，缺失突变体的构建是根据生物信息学分析结果，利用这些预测元件的间隔区域设计上下游引物，通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，产生成套缺失突变体(附图2)，并将它们分别连接进入植物表达载体pCAMBIA1391z中的多克隆位点，而多克隆位点的下游为GUS报告基因，即插入多克隆位点的启动子片段与gus基因形成融合基因。 [0017] 其中，所述用于构建融合基因的启动子可为启动子的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。

[0018] 所述的应用方法是通过在转基因植株中检测融合基因的表达来确定启动子序列的功能及利用价值。

[0019] 其中，所述的应用方法还可以是通过转融合基因获得对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代。

[0020] 本发明所克隆的盐芥启动子序列用于构建植物表达结构，插入植物表达载体后转入农杆菌GV3101，通过花序侵染法转化拟南芥。转化植株产生的种子在加有抗生素的琼脂培养基平板上筛选，萌发的小苗移栽到营养土中，成活后进行PCR检测，筛选转基因植株。转基因植株连续自交2代产生纯合系。后者用于转基因表达强度分析。同时将克隆的拟南芥Avp1基因的启动子序列与报告基因相连，构建融合基因Avp1-gus的植物表达载体，通过转基因植株中两个同源基因表达模式上的差异分析它们启动子功能的差异及各自的利用价值。

[0021] 本发明所说的启动子控制的表达模式分析，包括对TsVP1-T1(全长启动子连接GUS基因)转基因植株的染色分析，确定该启动子启动基因的表达部位，包括拟南芥根、茎、叶、花和荚果，发现在根和叶中GUS表达强度要高于其他器官。根染色结果的组织学观察表明，在根部GUS表达主要分布在中轴部位，根表皮和皮层组织中的表达量低。并且在侧根发生部位，GUS表达强度要明显高于主根的其它部位。

[0022] 本发明所说的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的耐(抗)旱性、耐(抗)盐性、耐冷性、抗寒性、耐涝性、耐热性、抗(耐)辐射性、抗病性、抗虫性、抗除草剂等特性及其组合。这种抗(耐)性在植株水平上可表现在某些发育阶 段或全生育期，可通过多种指标衡量或评价。

[0023] 本发明所说的植物主要指高等植物，包括各类作物和经济植物、观赏植物、生态植物、杂草等；包括被子植物、裸子植物；包括草本和木本植物等。

[0024] V-焦磷酸酶基因编码区5′上游区域的克隆和分析

[0025] 用购自Merck公司的λBlueSTARTM Xho I Half-site Arms KIT和KIT构建盐芥小片段基因组文库。从盐芥叶片提取基因组DNA，用限制酶MboI部分消化。
对部分酶解DNA的部分末端补平，然后在0.6％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳，电泳完成后用手术刀切下含有10-23 Kb DNA片段的凝胶块回收DNA，回收产物纯化后用于连接反应。连接反应分别在3个无菌的0.5mL的离心管中独立进行。每管λ-噬菌体载体1μL(500ng/μL)，基因组DNA片段分别为2、4、6μL，1μL T4 DNA连接酶，加无菌水至体积10μL，于
4℃连接16-24h。然后将连接产物小心的加到50μL融化的包装提取物中，加入500μL SM buffer(50mM Tris-Cl，pH 7.3，100mM NaCl，10mM MgCl2，0.01％Glutin)，轻轻涡旋混匀，加入25μL氯仿，轻轻涡旋混匀后分为120个亚库保存在4℃备用。

[0026] 根 据 盐 芥 TsVP1 基 因 的 序 列 信 息，在 其5 ′ 端 设 计PCR 引 物PTsVP-P1(5′GTGGCGTCGGCGTTTCTTC 3′)和PTsVP-P2(5′CTTGGCGACGACACTCTGC 3′)，采用PCR方法分级筛选盐芥基因组文库。PCR阳性的亚库分成次级库再次进行筛选，经过3级筛选后对阳性亚库铺平板进行噬菌斑印迹法筛选。滤膜印迹时，噬菌斑直径大约0.5-0.8mm，分散良好，互不相连。滤膜吸印前应将平板预先放入4℃至少1h，然后将尼龙膜覆盖在长有适量噬菌斑的平板上，用3个不对称小孔进行定位。膜全部浸湿后继续在平板上放置1min。取出尼龙膜，印迹面朝上，室温放置10min晾干。

[0027] 取1μg回收的TsVP1cDNA，采用罗氏公司(Roche)的DIG-High Prime KIT进行探针标记，标记的方法见试剂盒说明书。杂交、显色使用Roche公司的DIG Nucleic AcidDetection KIT，操作过程和方法见试剂盒说明书。

[0028] 用原位杂交的方法来分离阳性噬菌斑，杂交时，将尼龙膜依次放在被变性液(0.5MNaOH，1.5 M NaCl)饱和的滤纸上5min，中和液(0.5M Tris·Cl，pH 7.4；1.5 M NaCl)饱和的滤纸上5min，重复一次；然后将膜在2×SSC溶液中洗涤5min。尼龙膜处理完毕后，室温放置30min晾干，然后置于80℃烘干2h，用保鲜膜包好，存放于4℃备用。随机挑取阳性噬菌斑，将其转换为λBlueSTAR质粒。获得λBlueSTAR质粒后，对插入片段进行测序，得到基因编码区上游5452bp的序列。

[0029] 通过对盐芥TsVP1基因启动子序列进行Blast比对分析，其近5′端850核酸序列与拟南芥AT1G15670有很高的相似性(87％)。对盐芥TsVP1基因及其上游基因间隔区的4587bp和拟南芥AVP1基因及其上游基因间隔区的4475bp的核苷酸序列进行比对分析，发现盐芥TsVP1基因的启动子序列与拟南芥H+-PPase基因AVP1的启动子序列的相似性很低(＜10％)。通过NSITE-PL(http://www.softberry.com)程序分析启动子序列中的顺式作用元件，盐芥TsVP1基因启动子序列含有18个不同的顺式调控元件，拟南芥AVP1启动子序列中包含27个(可以和25个不同调控因子相互作用)顺式作用元件。其中有5个顺式作用元件(RSP00079，RSP00377，RSP00420，RSP00635，RSP00653)为两个启动子序列所共有。而且在盐芥TsVP1基因启动子序列中发现了多个胁迫相关顺式作用元件(如ABRE顺 式作用元件：RSP00049)。这两个基因启动子序列所包含的顺式作用元件的个数和种类存在着巨大差异，与它们的不同表达模式相对应。

[0030] V-焦磷酸酶基因启动子的基本特征

[0031] 根据测序和利用生物信息学工具分析结果，取近TsVP1基因开放读码框上游的2200bp的核甘酸序列(附图1)作为全长启动子，利用PLANTCARE在线分析软件对其进行生物信息学分析发现，在该启动子序列中存在的调控元件有：厌氧诱导响应元件ARE，干旱诱导响应元件MBS，ABA响应元件ABRE，热诱导响应元件HSE，水杨酸响应元件TCAelement，茉莉酸甲酯响应元件CGTCA motif，光诱导响应元件SP1、ACE、AE-box、G-box等，推测该启动子控制的基因表达受到盐或干旱胁迫等的诱导。

[0032] V-焦磷酸酶基因启动子的成套缺失突变体构建和与报告基因的重组

[0033] 根据V-焦磷酸酶基因TsVP1启动子序列，在预测的调控元件的间隔区域设计上下游引物，采用常规的分子克隆技术通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，分别连接到植物表达载体，如pCam系pCAMBIA1391z和pROK2的报告基因gus上游的多克隆位点处，构建出成套缺失突变体。

[0034] 用构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选转化克隆，提取重组质粒进行测序，然后选择重组正确的质粒采用冻融法转化农杆菌GV3101。将克隆的拟南芥Avp1基因的启动子序列也与报告基因相连，构建Avp1-gus基因表达载体，然后采用同样程序获得携带Avp1-gus基因表达载体的农杆菌。以农杆菌为中介将由不同启动子(片段)启动的gus基因分别转入拟南芥，检测不同启动子(片段)启动基因的表达模式。拟南芥转化采用花浸染法。

[0035] V-焦磷酸酶基因全长启动子表达模式分析

[0036] 通过对转T1(TsVP1全长启动子连接gus基因结构)结构的转基因拟南芥植株的GUS染色观察，发现该启动子启动的GUS表达部位包括根、茎、叶、花和角果。其中在根和叶中的表达强度要高于其他器官的。在根部，该启动子启动的GUS表达部位主要是根的中轴位置，根皮层组织中GUS表达量低，即染色很浅。在主根中，侧根发生部位GUS表达量要明显高于主根的其他部位。通过对转T1结构植株的不同器官的GUS酶活性测定，进一步证实了该启动子启动的gus基因在植株根和叶中的表达强度要高于其他器官的(附图3)。 [0037] 将转T1-gus结构的拟南芥植株用200mM NaCl处理，在处理3、6、12、16和24小时分别取材测量GUS酶活性，同时进行染色观察。由酶活性测定结果得出，GUS表达在盐胁迫条件下得到明显的提高，在16小时活性达到最大值，此时植株地上部分的GUS活性约是未处理植株的4倍，根中约是未处理植株的6倍(附图4)。染色观察发现，在盐胁迫条件下，根中，尤其是根尖处GUS染色强度大幅度提高。由于未受盐胁迫处理植株的叶片，GUS的表达量已很高，通过染色很难看出盐胁迫处理后GUS染色强度的明显变化。

[0038] V-焦磷酸酶基因启动子缺失突变体的表达模式分析

[0039] 将一系列的缺失突变体分别与gus基因融合，转入拟南芥。对转基因植株进行染色分析，发现T2片段(1517bp)启动的gus基因表达在叶中的表达强度要明显低于T1的，而在T2片段、T3片段(905bp)、T4片段(788bp)和T5片段(667bp)分别启 动的基因在表达特异性和强度方面彼此差异不明显。T6片段(537bp)与T5片段的启动活性相比，根中GUS表达量明显要低。T6片段和T7片段(328bp)启动的基因，在表达强度和特异性方面没有明显的区别。这些结果表明，与完整的TsVP1启动子相比，T2片段所缺少的序列中存在促进报告基因在叶中高强度表达的调控元件；而与T5片段相比，T6片段缺少的序列中存在促进报告基因在根中高效表达的元件。

[0040] 对转基因植株进行染色分析，发现T2、T3、T4、T5分别启动的gus基因在盐胁迫条件下其表达强度有明显增加，在根尖处的增强作用非常显著。而对转T6-gus基因植株进行分析发现，这种盐诱导作用消失。

[0041] 比较T3片段和T4片段的序列，发现T3片段多出的部分存在与地上组织特异表达相关的作用元件。对该段序列进行的生物信息学分析发现，存在10个光响应元件、1个ABA响应元件、1个干旱响应元件、1个热响应元件和1个昼夜节律调控元件，还有与叶部栅栏组织发育相关的元件有2个、还有未知功能的元件3个。

[0042] 在T5与T6的差异序列中，存在与根部特异表达相关的元件，存在响应盐胁迫的元件，后者可以使报告基因在盐胁迫的条件下在植株根尖部位的表达显著上调。对这段差异序列进行生物信息学分析，发现存在4个预测的作用元件，分别为光诱导响应元件G-box、茉莉酸甲酯响应元件CGCTA-box、与植物防卫以及胁迫响应相关的元件TC-richrepeats以及蛋白结合位点Box III。将这段序列(130bp)与拟南芥中AVP1的启动子片段进行序列比对，发现这两段启动子片段具有较高的相似性，但存在着序列差异。

[0043] 经济植物的遗传转化

[0044] 采用农杆菌介导法获得转基因植物。常用的转化方法有：通过花序侵染法转化拟南芥、茄科植物叶盘遗传转化法、禾谷类作物愈伤组织转化法及幼胚感染法、丛生芽块转化法、无菌苗生长点转化法等。通常采用PCR方法和分子杂交方法检测转化植株，获得阳性转化植株进行后续分析。以下以烟草叶盘遗传转化和玉米自交系无菌苗茎尖生长点转化法为例予以说明。

[0045] A.烟草叶盘遗传转化及转基因植株的分析

[0046] 取烟草无菌苗为材料，利用叶盘法进行转化。农杆菌菌株为LBA4404，携带含有gus基因和植物筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因nptII的Mini-Ti质粒或植物抗逆相关基因betA(编码来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶，催化由胆碱合成甘氨酸甜菜碱)和除草剂抗性基因，gus基因和抗逆相关基因分别由TsVP1启动子或其缺失突变体片段启动。采用常规转化方法进行转化，转基因小芽在含有选择剂卡那霉素(Kan)150μg/ml的诱导培养基上筛选，在生根培养基上生根。采用PCR和Southern杂交分析法确定转基因植株。通过PCR方法检测出分别含gus基因或耐盐相关基因的阳性植株，以不含目的基因的空载体转化植株为对照。Northern杂交表明转基因在烟草中有很高的表达水平，而未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株不出现杂交信号。

[0047] 转基因烟草植株的分析

[0048] 为了确定转基因的表达特异性和表达强度，对于转gus基因的烟草小苗，检测根、叶片和叶柄的GUS酶活性。在正常生长条件下，转基因烟草根系的GUS酶活性在转TsVP1启动子和T5片段的植株之间差异不显著，而叶片和叶柄的GUS酶活性则是转TsVP1启动子植株的显著高于转T5片段植株的。用250mM NaCl溶液浸泡转基因烟草小苗根系 24小时，转基因植株根系、叶片和叶柄的GUS酶活性均大幅度升高。与转TsVP1启动子的植株相比较，转T5片段植株的根系GUS酶活性无明显差异，而叶片和叶柄的GUS酶活性升高幅度相对较小。即在转基因烟草中TsVP1启动子和T5启动子均具有盐诱导特性，但T5启动子有较强的根特异性。

[0049] 将转betA基因和对照植株(空载体转化烟草和未转基因植株)的叶片切成0.5cm2的叶盘，分别在含1.0％、1.5％、2.0％和2.5％NaCl的培养基上进行培养，并测定其相对生长量。在含有1.0％NaCl的培养基上，各种叶盘生长旺盛，产生愈伤组织继而分化成芽，彼此之间的相对生长量没有显著差别。在加有1.5％NaCl的培养基上，转TsVP1启动子和T5启动子的烟草叶盘呈绿色，边缘有愈伤组织生成。在加有2.0％NaCl的培养基上，各种叶盘间的生长状况差异明显，来自对照植株的叶盘约半数死亡，其余生长较差；转T5启动子的叶盘依然存活，生长较好；转TsVP1启动子的叶盘相对生长量明显高于来自转T5启动子的，远高于对照植株叶盘的相对生长量。即通过检测转betA基因烟草叶盘的盐耐受性发现，转TsVP1启动子的烟草与对照植株相比，其耐盐性及耐旱性明显提高，而转T5启动子的烟草与对照植株相比耐盐性及耐旱性提高幅度不如转T5启动子的。用不含目的基因的空载体转化烟草未影响再生植株的生理指标，所以转基因烟草耐盐性及耐旱性的改变是由于转基因betA的表达促成，转T5启动子的烟草叶盘耐盐性提高幅度较小与其启动的betA在叶片中表达强度较低相对应。

[0050] 为了解由不同启动子启动的betA基因对转基因烟草植株耐旱性影响的差异，将转基因烟草小苗置于含10％(W/V)PEG 6000的MS无机盐溶液中进行渗透胁迫处理，检测叶片相对含水量的变化。在渗透胁迫过程中，烟草叶片相对含水量逐渐降低，转TsVP1启动子植株相对含水量降低速率显著低于对照植株的，18h后叶片相对含水量从渗透胁迫处理前的94％-99％降低为62％-66％，转T5启动子的叶片相对含水量从96％-98％降低为64％-65％，而未转基因对照植株叶片的相对含水量从94％-98％降低到54％-60％。这说明不同启动子启动的betA基因在烟草叶片中的表达强度有差异，但启动子之间的差异达不到显著程度。

[0051] B.玉米自交系遗传转化及转基因植株的分析

[0052] 套袋获取玉米骨干自交系或杂交种种子，用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40mL水/250mL三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上，在黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖生长锥。

[0053] 将带有双元载体(Mini-Ti质粒或带有TsVP1启动子-betA和除草剂绿黄隆抗性基因als或T5启动子-betA和als，als基因来自抗绿黄隆的拟南芥植株并进过修饰，李国圣等，2000，《科学通报》，45：2181-2184)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。转化时首先将菌液倒在培养皿中，倾斜培养皿，将露出茎尖生长锥的玉米无菌苗顶端减 压浸泡在菌液中4-8分钟(AGL16分钟，LBA44048分钟)。然后将浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，将根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃，然后将无菌苗放在散射光下培养2天，再将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石和下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

[0054] 转化植株长出3片叶后，喷洒20-30mg/l绿黄隆(用量因自交系抗性而变化，沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为宜。对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株套袋自交或姊妹交结实。

[0055] 转化植株产生的种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测和RT-PCR检测，从中选出转基因植株。同时对转基因植株进行套袋自交留种，分析下一代中转基因个体的比例，选出转基因纯合系进行转基因表达分析和植株抗性检测。

[0056] 转基因玉米植株的分析及利用

[0057] 采为了解转基因的表达特异性和表达强度，采用实时定量RT-PCR方法分别检测玉米转基因小苗根和叶片器官中betA基因的表达强度。由于来自同一转化结构的不同转基因株系betA基因的表达强度差异大，因此，从10个独立转化体的后代株系中，剔除2个表达量偏高和2个表达量偏低株系的测定值，取其它6个株系的测定值的平均数来表示转基因表达强度。在正常生长条件下，转基因玉米根系的betA基因的转录丰度在转TsVP1启动子和T5启动子的株系之间差异不显著；而在叶片中，转TsVP1启动子的显著高于转T5启动子的。用250mM NaCl溶液浸泡转基因玉米小苗根系24小时，转基因植株根系和叶片的betA基因的转录丰度均大幅度升高。与转TsVP1启动子的植株相比较，转T5启动子植株的根系betA基因的转录丰度无明显变化，而叶片betA基因的转录丰度升高幅度也相对较小。即在转基因玉米中TsVP1启动子和T5启动子均表现盐胁迫诱导特性，但T5启动子具有较强的根特异性。

[0058] 转betA基因的种子播种在砂盆中，浇灌0.8％NaCl水溶液，以未转基因自交系为对照。转基因植株的不同株系在盐水浇灌下表现出不同的耐盐性，多数转TsVP1启动子的株系表现出比对照显著提高的耐盐性，半数以上株系的5叶期成活率在70％以上，而对照自交系出苗后很快死亡，5叶期成活率不到20％，且植株严重受害。转T5启动子的株系也表现出比对照明显提高的耐盐性，耐盐性与转TsVP1启动子的差异不明显。选出耐盐性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，挑选出配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于耐盐玉米杂交种培育。

[0059] 将转betA基因的玉米种子和未转基因的对照自交系种子播在花盆中，分别在苗期(3-7叶期)、雌雄穗发育期(9-13叶期)、开花授粉期进行干旱胁迫处理，检测干旱处理对玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度、单株产量及其它经济性状和生理指标的差异等。综合多方面的测试结果，转TsVP1启动子和T5启动子的玉米分别比对照植株表现出明显提高的耐旱性，且不因启动子不同而有明显差异。选出耐旱性优异的转基因植 株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。

[0060] 本发明的有益效果

[0061] 本发明公开了盐芥编码液泡膜焦磷酸酶基因TsVP1启动子序列和其不同区段的功能元件，构建了系列缺失突变体，通过检测由它们分别启动的gus基因在拟南芥中的表达，初步确定了它们的应用价值。进而在转基因烟草和玉米植株中进行验证，，确定了TsVP1启动子和T5启动子在转基因烟草和玉米中能正常行使功能，是盐胁迫诱导型的强启动子。该发明的价值在于：

[0062] 1)为植物抗逆育种提供盐胁迫诱导型强启动子TsVP1和T5启动子。在植物转基因抗逆育种中，目前缺少这类胁迫诱导型的启动子。

[0063] 2)T5启动子启动的基因表达不仅强度高，而且表达强度因器官不同而异，根中高强度表达，这对于启动植物抗逆相关基因的表达有重要意义。另外，由于序列短，便于基因重组和植物多基因遗传转化。

[0064] 3)在TsVP1启动子区域鉴定出一系列转录调控元件，并通过成套缺失突变体的构建和转基因植株的分析，初步确定了一些元件在启动基因表达中的左右，为TsVP1启动子和T5启动子改造打下了基础。

[0065] 附图说明

[0066] 图1：TSVP1启动子序列及顺式元件分析；

[0067] 图2：不同的TsVP1基因启动子片段与报告基因连接示意图

[0068] (+1代表该基因的转录起始位点)；

[0069] 图3：T1-gus基因在转基因拟南芥植株根和叶中的表达强度要高于其他器官； [0070] 图4：在0.2M NaCl处理条件下TsVP1启动子启动的GUS酶活性拟南芥各组织中的变化。

[0071] 具体实施方式

[0072] 实施例1：转TsVP1启动子启动的ZmPIS基因创造玉米耐旱自交系及应用 [0073] 1)构建TsVP1启动子与ZmPIS的融合基因

[0074] 采用常规的基因重组方法将TsVP1启动子与ZmPIS相连，经测序验证后重组到植物表达载体pCUA质粒的T-DNA区。pCUA质粒为本实验室构建，携带植物选择标记基因als。然后采用冻融法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。

[0075] 2)受体系统的建立以我国生产上所用的玉米骨干自交系为材料，如郑58、掖478、掖515等，取自交种子灭菌，离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有：

[0076] 种子萌发培养基：KNO3 1900mg/l，NH4NO3 1650mg/l，CaCl2·2H2O 440mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，FeSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO3 10mg/l，KI 0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O0.5mg/l，CuSO4·5H2O0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸
1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖
30g/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8-6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。 [0077] A培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5-9.0μmol/l和2，4-D 1.0-3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。

[0078] B培养基：种子萌发培养基附加6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。

[0079] 成苗培养基：种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。

[0080] 生根培养基：种子萌发培养基附加IBA 2.8-3.6μmol/l，用于无根小苗生根。 [0081] 基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。

[0082] 种子灭菌和萌发：玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-15分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30-40mL/250mL三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1--2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。

[0083] 茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化：萌发种子的胚芽伸长止3-5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24-27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5-6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。

[0084] 3)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生

[0085] 将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因和TsVP1启动子-ZmPIS基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

[0086] 取继代后培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7-12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养 后产生小芽。

[0087] 将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000 lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温
22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。

[0088] 4)转基因植株的抗性检测和选择利用

[0089] 取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自交结实。取种子播种在砂盆中，用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。

[0090] 实施例2：转T5-ZmPIS基因创造小麦优良抗旱育种材料

[0091] 1)构建T5启动子与ZmPIS的融合基因

[0092] 采用常规的基因重组方法将T5启动子与ZmPIS相连，经测序验证后重组到植物表达载体pCUA-bar质粒的T-DNA区。pCUA-bar质粒为本实验室构建，携带植物选择标记基因bar，然后采用冻融法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。

[0093] 2)小麦无菌苗获得

[0094] 小麦优良品种的种子，用70％乙醇浸泡1-3分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(20-25℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。

[0095] 3)农杆菌培养及活化

[0096] 将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和ZmPIS基因)的根瘤农杆菌LBA4404在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

[0097] 4)小麦无菌苗转化

[0098] (1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌5
苗浸泡在菌液中，在0.5×10Pa大气压下处理3-6分钟。

[0099] (2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。

[0100] (3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

[0101] 5)转化植株筛选与定植

[0102] 转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂 (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml ，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到7-8叶时，将其定植到田间，并促进分蘖。

[0103] 6)转化植株的分子检测

[0104] 抗除草剂植株经春化处理后，在起身-拔节期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转化植株。PCR阳性植株进行RT-PCR检测，在获得的抗除草剂植株中，约15％左右为转基因个体。

[0105] 6.转基因植株子代分析

[0106] 通过春化阶段(低温处理条件因品种而异)的植株在长日照下起身、拔节、开花结实。转基因植株产生的种子，在浸水萌动后放冰箱(0～2℃)中进行春化处理30-65天。部分春化处理后的种子用10.8ml 水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；另一部分春化处理后的种子播种在大田和砂盆，分别进行干旱胁迫处理和高盐胁迫处理，筛选耐旱和/或耐盐转基因植株。提取抗逆植株的叶片DNA，采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例，获得纯系后用于小麦育种或直接进入安全性实验和区域实验。

[0107] 实施例3、转T5启动子启动的betA基因创造棉花优良抗逆育种材料

[0108] 1)T5启动子与betA基因的融合基因及质粒构建和农杆菌培养

[0109] 采用常规的基因重组方法将T5启动子与betA基因相连，经测序验证后重组到植物表达载体pCUA质粒的T-DNA区。pCUA质粒携带植物选择标记基因als，然后采用冻融法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。农杆菌培养及活化同实例2。

[0110] 2)棉花无菌苗获得

[0111] 取棉花自交系或优良品种的种子，用浓硫酸脱去表面绒毛，用70％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在铵盐减半的改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴伸长至3～5厘米时，剥去一片子叶，露出茎端生长锥。

[0112] 3)棉花无菌苗转化

[0113] (1)将菌液涂到用解刨针刺伤的茎尖生长锥上，并用农杆菌浸湿的棉花球覆盖在其上，然后在黑暗中培养2-3天，培养温度为24-26℃。再将无菌苗放在散射光下培养2天。 [0114] (2)将照光培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。

[0115] 4)转化植株筛选与定植

[0116] 转化植株长出3片叶后，喷洒8mg/l绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水 溶液，以植株掉液滴为宜。未转化的对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体有很强抗性，持续生长。存活植株长到5叶期时，将其定植到田间。

[0117] 5)抗除草剂植株的分子生物学鉴定

[0118] 抗除草剂植株长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳性植株进行RT-PCR检测。在获得的抗除草剂植株中，10％以上的植株为转基因个体。 [0119] 6)转基因植株子代的分子生物学鉴定

[0120] 转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，在植株4-6叶期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测子代植株是否带有外源基因，并统计外源基因在子代分离比例，结果表明，在20％左右的转基因株系中，外源基因在子代植株中的分离比例符合孟德尔定律。

[0121] 7)转基因植株的抗性鉴定和利用

[0122] 取纯合的转基因植株的种子，播种在花盆中，植物2叶期时进行低温处理，通过存活率统计和生理指标测定，筛选出耐冷株系，用于生产。进行砂盆中，用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。该自交系可用于配制玉米耐盐杂交种。

[0123] 实施例4、转T5启动子启动的betA基因创造大豆耐旱育种材料

[0124] 1)T5启动子与betA基因的融合基因及质粒构建和农杆菌培养

[0125] 同实例3。但离心收集的农杆菌菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液体培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。

[0126] 2)大豆无菌苗获得和遗传转化

[0127] 取优良品种的种子，用70％乙醇浸泡2-3分钟，用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(50-60mL水/250mL三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下2-3天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良B5培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴长至3-5厘米时，剥去一片子叶并露出茎端生长锥。

[0128] 转化步骤为：

[0129] (1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理3-6分钟。

[0130] (2)浸染后的苗顶用无菌滤纸吸干，把小苗根端插入改良B5培养基上于黑暗中培养3-4天，培养温度为22-24℃。

[0131] (3)将无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，顶部覆盖蛭石，自然光照下生长，日温23-28℃，夜温20-25℃，隔天浇灌1/2改良B5培养基无机盐。

[0132] 3)转化植株筛选与定植

[0133] 转化植株在长日照(13-14小时/天)下生长，长出3片叶后，喷洒1.5-2.0mg/l(因基因型而不同)绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液，以植株掉液滴为宜，未转化的对照植株在喷洒后4天停止生长，15天左右开始死亡。转化植株在喷洒 后，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。

[0134] 抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳性植株进行RT-PCR检测。在获得的抗除草剂PCR阳性植株中，约20％的植株为转基因个体。

[0135] 4)转基因植株后代的分子生物学鉴定和抗逆性测定及利用

[0136] 将转基因植株产生的种子，播种在大田或温室。植株(T1代)3-4叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，并进行Southern blotting验证，同时统计外源基因在子代植株中的分离比例。获得转基因纯合系后进行抗逆性测定，筛选抗逆株系。 [0137] 序列表

[0138] <110>山东大学

[0139] <120>盐芥V-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用

[0140] <141>2009-9-1

[0141] <160>3

[0142] <210>1

[0143] <211>19

[0144] <212>DNA

[0145] <213>PTsVP-P1

[0146] <400>1

[0147] gtggcgtcgg cgtttcttc 19 [0148] <210>2

[0149] <211>19

[0150] <212>DNA

[0151] <213>PTsVP-P2

[0152] <400>2

[0153] cttggcgacg acactctgc 19 [0154] <210>3

[0155] <211>2203

[0156] <212>DNA

[0157] <213>TSVP1启动子序列

[0158] <400>3

[0159] aagatttgct acctcccatt acgccaaaaa taattttaaa aaatcatcta gatattatac 60 [0160] gttttctaga taccaataaa gtatctgaca tgaataaaag aataaataaa ggaccacatg 120 [0161] ttcttaaaaa tataactcac atcaataaat caaataattc aacattttac ctttaaacat 180 [0162] agaaatgaac catccgtgac ttttatcaaa ataaatatat ttctatgaag aacaatagtt 240 [0163] cgtccatata tttcaagttt ctacgaatct tattaagata gattgtactg gtcaccgttt 300 [0164] tatggcattt tgtcaatata taaaagatta taaacataga ggtatcacca aattttggtg 360 [0165] aggctttgat tgccttaatt agaaaacaat ataattacga cagcgacgat catctaatca 420 [0166] tgtcacggaa agtcggaatt gttaccgtgt aaaatcatcc gcttctttct taattcaatt 480 [0167] attgttactt taattagttg gattggtttg aattctacgt ttacacctct gcatttggat 540 [0168] aacctatgcc atatagtatt gattatataa ctgataacta agggaactaa aatactaaat 600 [0169] cttgactgaa agataataag agaagtctct agtccctaat gtcagccaca tacctaggaa 660 [0170] agatttttta gttttcatta cgtggtaaat tttccagatt gattagcaac ctgcaaaaaa 720 [0171] gggaacaaga gggaggaaga taaagcatga gtggtcacta ctcactcact gatactacaa 780 [0172] gaaattaatt aatgctaaca aaaatccaca atataaattt ttaattaaga tattttttca 840 [0173] aaagagtatt tatccgattg gagggttgca caccattcaa tacacattaa tacgtcacag 900 [0174] ccgctcgaaa aggcctccgc tatatatcca tctttttgct aaagaatttt ttttttcgaa 960 [0175] gaatcatcaa tttactttat tcttggtctg aggaaatatc tatatacgtg aagtgtgcac 1020 [0176] cttatcttgt acagggcttc cttcggaaaa aaaaaaaatc ttgtacaggg cttccctcgt 1080 [0177] atgaagaaga gataaactcg taaaaaggtt ttggaatcca acttaatgga acaaatgcca 1140 [0178] aaataattta gtacaacgtc gaatcaagtt gcgaaagtac tgtagaatcg attcctatac 1200 [0179] agagacgaaa cgagttctta ttgcacttta taatattgat taaaaactga aacttttttt 1260 [0180] gtttctccga atattgttat ctttatttca cagctagata tcaatccgca catgcatata 1320 [0181] attagtttat cttttcacaa aaaagtatat ccccaaataa aatcccacgt aaatgaaaac 1380 [0182] acagttttaa tttttttttc atagtgttta cgataataca catggtttgt tgtaattaaa 1440 [0183] aagatagata cggttttttt tcaactgaaa atttgacttt gtatttatcc taatgatatc 1500 [0184] aaatgattta accatatcca tatctgatag tatgcacaca cattgaatcc ctcattgaaa 1560 [0185] attatgacga gctgagattc aatgatatta gttagtccat atacactgga tttggtaaga 1620 [0186] ataccattac tgtataaaca ctcgaatata ccatggataa gcataagatt cacctaatta 1680 [0187] attaatttcc accagtgaga aaaaaaggaa aactaattaa tttctacacg tagacaattg 1740 [0188] actacgaatc aaaaagagcg ctaatcgtgt acctgacagt cggacggaca caagcgcatg 1800 [0189] gatgcacacg tagttggtgt ctcttaccct aaaatcgacg gtgaagatgg acacgagcgt 1860 [0190] tacttgtccc tcgtgtctga taactatcgg tagacgaaac gagattatac cttccgacaa 1920 [0191] tttggagcgt cggctgcacg cgctttctaa tcaaaaaaaa gaaaaaaaaa gaaacgaggg 1980 [0192] gtgtagcgta aagaacggtg taactaaccg taccagattc caactttcgt tgtggatgtg 2040 [0193] agcatccaag aggaggagag tcagtgttat aaaacgacac gatatcctca ccgagtttac 2100 [0194] gccttcattt catcatctcg tcgaaaacac ttcccttcct ttctctctac tctctctctc 2160 [0195] tcgttatctt cggtttctgc tttctctatt cggaggagag atg 2203