肿瘤特异嵌合启动子及其构建方法和应用

摘要

一种肿瘤特异嵌合启动子，由具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中1-233位的任何碱基的肿瘤特异启动子Survivin序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中1-62位的任何碱基的miniCMV序列组成，其肿瘤特异启动子Survivin序列在5’端，miniCMV序列在3’端，其序列具有核苷酸序列表中NO3所示的碱基序列中1-313位的任何碱基。其构建方法由克隆Survivin序列及构建肿瘤特异性嵌合启动子两个步骤组成。肿瘤特异嵌合启动子在表达小干扰RNA或构建条件复制型腺病毒载体或表达肿瘤治疗基因中的用途。

权利要求

1.一种肿瘤特异嵌合启动子，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中NO.3所示。

2.一种肿瘤特异嵌合启动子的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：(1)克隆Survivin序列

采用微量基因组DNA极速抽提试剂盒并采用试剂盒相应方法提取人外周血的基因组DNA，并设计针对Survivin序列的引物，引物序列如下：Survivin P1：Xho I ACTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTC；

P2：XbaI ATCTAGACGGTTAATGGCGCGCCGC；

通过聚合酶链式反应进行扩增，获得Survivin序列，通过质量浓度为1.0％琼脂糖电泳回收、连接、转化以及鉴定获得Survivin序列的阳性克隆，菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃；

(2)构建肿瘤特异性嵌合启动子

将Survivin序列的阳性克隆经酶切、质量浓度为1.0％琼脂糖电泳回收、连接到一个含有多克隆位点及SV40 poly A的载体中，命名为pEAAL-Survivin，通过设计合成含有miniCMV序列的linker片段，其DNA序列为：TCTAGAGTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT；

室温退火4小时，形成含有miniCMV序列的linker片段，并连接到经XbaI与ClaI酶切后的pEAAL-Survivin载体中，再通过转化、质粒提取以及鉴定，获得肿瘤特异性嵌合启动子。

3.权利要求1肿瘤特异嵌合启动子在表达小干扰RNA中的用途。

4.权利要求1肿瘤特异嵌合启动子在构建条件复制型腺病毒载体中的用途。

说明书

肿瘤特异嵌合启动子及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因治疗及病毒治疗技术领域，具体涉及肿瘤特异性嵌合启动子的构建。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对与极大多数化疗药物而言，其治疗指数依然很低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗手段通常伴有明显的毒性作用。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，目前肿瘤的靶向性治疗已经成为研究的热点。近年来，随着生物技术的迅速发展，肿瘤的基因治疗已经越来越受到人们的关注。肿瘤的基因治疗包括：靶向癌基因及抑癌基因；自杀基因治疗；免疫学基因治疗；溶瘤性腺病毒治疗。在基因治疗中对目的基因的靶向调节及溶瘤性腺病毒在肿瘤组织中的复制调控对基因治疗的效率和安全性有着重要的意义，也是目前基因治疗的挑战之一。

[0003] 肿瘤特异性启动子是一种能在一种或一类肿瘤细胞中特异性启动表达的DNA序列，它已经成为肿瘤基因治疗中一种重要的工具。目前，已经发现了一系列的肿瘤特异性启动子，其中比较理想的有人端粒逆转录酶启动子(hTERT)、α-胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、CXCR-4启动子等。但是这些启动子大都只针对一种肿瘤细胞，而且在肿瘤细胞中活性都不太高，在实际应用中受到了一定的限制。目前仍需要开发更加理想的肿瘤特异性启动子。Survivin启动子是最近发现的一种具有相对广谱的适用细胞的肿瘤特异性启动子，已有研究表明，Survivin启动子在多种肿瘤细胞中具有较高的活性和很好的特异性，但其活性仍然有待提高。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述肿瘤特异性启动子的缺点，提供一种提高Survivin启动子活性、保留启动子在肿瘤的特异性、用途广的肿瘤特异嵌合启动子。

[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种肿瘤特异嵌合启动子的构建方法。

[0006] 本发明所要解决的还有一个技术问题在于提供一种肿瘤特异嵌合启动子的用途。

[0007] 解决上述技术问题采用的技术方案是：由具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中1-233位的任何碱基的肿瘤特异启动子Survivin序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中1-62位的任何碱基的miniCMV序列组成，其肿瘤特异启动子Survivin序列在5’端，miniCMV序列在3’端，其序列具有核苷酸序列表中NO3所示的碱基序列中1-313位的任何碱基为：

[0008] CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCT

[0009] GGGTGCACCGCGACCACGGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACAACTCCCGGCACACCCCGCGCCGCCCCGCCTCTACTCC

[0010] CAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGTCTAGAGTAG

[0011] GCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT。

[0012] 本发明的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中1-233位的任何碱基的肿瘤特异启动子Survivin序列为：

[0013] CCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCTGGGTGC

[0014] ACCGCGACCACGGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACAACTCCCGGCACACCCCGCGCCGCCCCGCCTCTACTCCCAGAAG

[0015] GCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCG。

[0016] 本发明的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中1-62位的任何碱基的miniCMV序列为：

[0017] GTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTC。

[0018] 上述的肿瘤特异嵌合启动子的构建方法，由下述步骤组成：

[0019] 1、克隆Survivin序列

[0020] 采取人外周血，采用微量基因组DNA极速抽提试剂盒并采用试剂盒相应方法提取人基因组DNA，并设计针对Survivin序列的引物，通过聚合酶链式反应进行扩增，获得Survivin序列，通过质量浓度为1.0％琼脂糖电泳回收、连接、转化以及鉴定获得Survivin序列的阳性克隆，菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。

[0021] 2、构建肿瘤特异性嵌合启动子

[0022] 将Survivin序列的阳性克隆经酶切、质量浓度为1.0％琼脂糖电泳回收、连接到一个含有多克隆位点及SV40poly A的载体中，命名为pEAAL-Survivin。通过设计合成得到的含有miniCMV序列的linker，室温退火4小时，合成含有miniCMV序列的linker片段，并连接到经XbaI与ClaI酶切后的pEAAL-Survivin载体中，再通过转化、质粒提取以及鉴定，获得肿瘤特异性嵌合启动子。

[0023] 肿瘤特异嵌合启动子在表达小干扰RNA中的用途。

[0024] 肿瘤特异嵌合启动子在构建条件复制型腺病毒载体中的用途。

[0025] 肿瘤特异嵌合启动子在表达肿瘤治疗基因中的用途。

[0026] 本发明提供一种适用该肿瘤特异嵌合启动子的肿瘤细胞模型，所述嵌合启动子包括肿瘤特异性Survivin启动子部分序列和miniCMV序列，肿瘤细胞模型为恶性胶质母细胞瘤，该嵌合启动子在U87细胞系有很好的特异性和非常强的启动子活性。在恶性胶质母细胞瘤基因治疗中具有重要的意义。本发明通过比较发现该新型启动子具有肿瘤特异性，且比亲本Survivin启动子活性强，可用于条件复制型腺病毒载体的制备、脑肿瘤的基因治疗、表达小干扰RNA、肿瘤基因治疗。

附图说明

[0027] 图1是Survivin核心序列的质粒鉴别图。

[0028] 图2是肿瘤特异性启动子的质粒鉴别图。

[0029] 图3是肿瘤特异性启动子表达绿色荧光蛋白的载体图谱。

[0030] 图4是肿瘤特异性启动子在肿瘤细胞中的活性检测图。

[0031] 图5是肿瘤特异性启动子在肿瘤细胞中的特异性检测图。

[0032] 图6是肿瘤特异性嵌合启动子表达扩增肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的载体图谱。

[0033] 图7是表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体的载体图谱。

具体实施方式

[0034] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

[0035] 实施例1

[0036] 以肿瘤特异嵌合启动子为例其构建方法步骤如下：

[0037] 1、克隆Survivin序列

[0038] 采取人外周血，采用飞捷生物试剂公司的微量基因组DNA极速抽提试剂盒并采用试剂盒相应方法提取人基因组DNA。并设计针对Survivin的特异启动子部分序列的引物如下：

[0039] Survivin P1：XhoI ACTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTC

[0040] P2：XbaI ATCTAGACGGTTAATGGCGCGCCGC

[0041] 通过聚合酶链式反应进行扩增，聚合酶链式反应体积为：5μl 10×PCR buffer、1μl P1、1μlP2、0.5μl LA Taq、1μl Genomic DNA、1μl 10mM dNTPs、40.5μl三蒸水。
聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，反应循环次数为30次。

[0042] 获得Survivin的特异启动子部分序列，其DNA序列为：

[0043] CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCT

[0044] GGGTGCACCGCGACCACGGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACAACTCCCGGCACACCCCGCGCCGCCCCGCCTCTACTCC

[0045] CAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGGCGTGCGCTCCCGGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGTCTAGA。

[0046] 聚合酶链式反应产物经浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收。并与pGEMT-easy载体经T4连接酶14.5℃连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。然后转化感受态细胞DH5α并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经EcoRI酶切及测序鉴定。如图1所示，M代表DNA分子量，1-10代表质粒DNA，其中除8号其余均为阳性克隆。获得阳性克隆命名为pGEMT-Survivin。将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。

[0047] 2.构建肿瘤特异嵌合启动子

[0048] 将pGEMT-Survivin在37℃条件下，经XhoI与XbaI双酶切后，经质量浓度为1.0％琼脂糖电泳回收纯化后连接到到一个含有多克隆位点及SV40pol y A的载体中，命名为pEAAL-Survivin。通过设计得到的含有CMV启动子的核心区域miniCMV的linker的序列并送公司(上海生工)合成，合成产物浓度配制成20mM，将相对应的引物各取15μl，混合后，在室温退火4小时从而合成含有miniCMV的linker片段。其DNA序列为：

[0049] TCTAGAGTAGGCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT

[0050] 将合成的含有miniCMV的linker，通过连接酶14.5℃过夜连接到并连接到经XbaI与ClaI酶切后的Survivin启动子核心序列的3’端，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。经转化感受态细胞DH5α后，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切及测序鉴定阳性克隆，由此获得肿瘤特异嵌合启动子。其DNA序列为：

[0051] CTCGAGCCCGGCCTGCACGCGTTCTTTGAAAGCAGTCGAGGGGGCGCTAGGTGTGGGCAGGGACGAGCTGGCGCGGCGTCGCT

[0052] GGGTGCACCGCGACCACGGGCAGAGCCACGCGGCGGGAGGACTACAACTCCCGGCACACCCCGCGCCGCCCCGCCTCTACTCC

[0053] CAGAAGGCCGCGGGGGGTGGACCGCCTAAGAGGGCGTGCGCTCCCGACATGCCCCGCGGCGCGCCATTAACCGTCTAGAGTAG

[0054] GCCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCTCATCGAT。

[0055] Survivin启动子核心部分在5’端，CMV启动子的核心区域miniCMV在3’端。经XhoI和ClaI双酶切及测序鉴定后，如图2所示，M代表DNA分子量，11-15代表质粒DNA，鉴定均为阳性克隆，命名为pSurvivin-miniCMV。

[0056] 3.构建肿瘤特异嵌合启动子表达绿色荧光蛋白的载体

[0057] 通过聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白基因，聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟。使用伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经质量浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5α后，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定后，将阳性克隆经过ClaI和SpeI双酶切与同样的酶切处理的pSurvivin-miniCMV载体连接，获得的载体称之为pSurvivin-miniCMV-eGFP，载体图谱见图3。

[0058] 4、肿瘤特异嵌合启动子在肿瘤细胞中的活性检测

[0059] 转染前1天，将U87细胞、Hela细胞以及A549细胞接种于含有10％胎牛血清的5
DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞数为别是1×10 个。采用脂质体Lipofectamine 2000TM进行转染，即在一个1.5ml的Eppendorf管中加入50μl OPTI-MEM，再加入质粒DNA，混匀后作用5分钟；在另一个1.5ml的Eppendorf管中加入2μl的脂质体，混合后作用5分钟，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后作用20分钟，将混合物加入到含有10％胎牛血清的DMEM培养基的24孔板中，4小时后换液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养基，24小时后，检测绿色荧光蛋白表达量。转染的质粒分别为pSurvivin-miniCMV-eGFP和pCMV-eGFP，质粒DNA用量均为0.26μg，每种质粒转染3个复孔，其中pCMV-eGFP作为阳性对照。在图4中，16为CMV启动子在3种肿瘤细胞中表达绿色荧光蛋白，17为肿瘤特异嵌合启动子在3种肿瘤细胞中表达绿色荧光蛋白，结果显示，肿瘤特异嵌合启动子在多种肿瘤细胞中均具有活性，尤其在U87细胞中，活性较高。

[0060] 5.肿瘤特异嵌合启动子在肿瘤细胞中的特异性检测

[0061] 转染前1天，将239细胞、EVC304细胞、A549细胞、Hela细胞、Shsy5y细胞以及5
U87细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养基的24孔板中，每孔细胞数为别是1×10个。采用脂质体Lipofectamine 2000TM进行转染，即在一个1.5ml的Eppendorf管中加入
50μl OPTI-MEM，再加入质粒DNA，混匀后作用5分钟；在另一个1.5ml的Eppendorf管中加入2μl的脂质体，混合后作用5分钟，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后作用20分钟，最后将混合物加入到含有10％胎牛血清的DMEM培养基的24孔板中，4小时后换液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养基，24小时后，检测绿色荧光蛋白表达量。转染的质粒是pSurvivin-miniCMV-eGFP，质粒用量均为0.26μg，每种质粒转染3个复孔。如图5所示，肿瘤特异嵌合启动子在6种肿瘤细胞中表达绿色荧光蛋白，结果显示，293细胞，EVC304细胞中，绿色荧光蛋白的表达量很低。而A549细胞、Hela细胞、Shsy5y细胞、U87细胞，绿色荧光蛋白的表达量较高，说明肿瘤特异嵌合启动子在肿瘤细胞中具有特异性。

[0062] 实施例2

[0063] 以肿瘤特异性嵌合启动子表达扩增肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Trail)载体为例，其构建方法步骤如下：

[0064] 1、克隆Survivin序列

[0065] 克隆Survivin的特异启动子部分序列的步骤与实施例1相同，获得Survivin的特异启动子部分序列。

[0066] 2、构建肿瘤特异嵌合启动子

[0067] 构建新型肿瘤特异性嵌合启动子Survivin-miniCMV与实施例1相同，获得肿瘤特异嵌合启动子。

[0068] 3、构建肿瘤特异性嵌合启动子表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的载体[0069] 利用聚合酶链式反应的方法扩增肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因。聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分钟。使用伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经转化感受态细胞DH5α后，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定后，将阳性克隆经过ClaI和SpeI双酶切后与同样的酶切处理后pSurvivin-miniCMV载体连接，获得的载体称之为pSurvivin-miniCMV-Trail，载体图谱见图6。

[0070] 实施例3

[0071] 构建肿瘤特异性嵌合启动子表达E1A基因，并且E4-fiber区同时表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA(siHecl)的条件复制型腺病毒载体。

[0072] 1、克隆Survivin序列

[0073] 克隆Survivin的特异启动子部分序列的步骤与实施例1相同，获得Survivin的特异启动子部分序列。

[0074] 2、构建肿瘤特异性嵌合启动子

[0075] 构建肿瘤特异性嵌合启动子与实施例1相同，获得肿瘤特异性嵌合启动子。

[0076] 3、构建肿瘤特异性嵌合启动子表达E1A的穿梭载体

[0077] 将肿瘤特异性嵌合启动子从pSurvivin-miniCMV上经KpnI和XhoI双酶切下来，经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用KpnI和XhoI双酶切处理的含有腺病毒E1片段的穿梭载体进行连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pAd5-Survivin-miniCMV-E1A。此载体为获得的肿瘤特异性嵌合启动子表达E1A的穿穿梭载体。

[0078] 4、构建Ad5E1A区插入肿瘤特异性嵌合启动子的腺病毒载体骨架

[0079] 将ScaI与SpeI线性化的pAd5-Survivin-miniCMV-E1A穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按照摩尔比3∶1共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为肿瘤特异性嵌合启动子表达E1A的腺病毒载体骨架，命名为pAd5-Survivin-miniCMV-E1A/SwaI载体。

[0080] 5、构建表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体[0081] 以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码读框(ORF)的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点(XbaI及SfuI)，将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker(EcoRI PacI SwaI SpeI HindIII)连接，所获得的载体命名为pUCKanEHL。聚合酶链式反应扩增位于Ad5 E4区3′端上游约2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E4-3′。采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3′端上游约2.0kb的片段(基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点)。将此片段克隆到pshuttle Ad5-E4-3′载体相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber。

[0082] 通过聚合酶链式反应方法扩增U6-siHecl表达元件，聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、30秒，72℃、40秒，30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μlT4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，挑取菌落接种到含有
100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/U6-siHecl。将U6-siHecl片段从pGEMT/U6-siHecl上经ClaI和NotI双酶切后经末端补平后与用SwaI酶切处理的腺病毒E4fiber区穿梭载体进行连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttleAd5-E4-fiber-siHecl。

[0083] 6、构建表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体

[0084] 用PacI线性化的表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的腺病毒E4-fiber穿梭载体与SwaI线性化的肿瘤特异性嵌合启动子表达E1A的腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coli BJ5183，然后通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体称为pAd5-Survivin-miniCMV-E1A-siHecl。表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体见图7。

[0085] 7、获得表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体

[0086] 采用磷酸钙法将Pac I线性化的达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体pAd5-Survivin-miniCMV-E1A-siHecl转染HEK293 Val细胞系。经过7～10天后，可见明显的细胞病变，然后经过离心收获病毒原液，经过2～3轮的病毒扩增后，进一步将所获得的病毒原液感染10个150cm的细胞培养平皿，从而扩增获得足够量的病毒原液用于后续的进一步纯化。感染的病毒的细胞经过反复冻融
3次(37℃/酒精干冰)后经3500转/分钟离心15分钟，通过两次氯化铯密度梯度超速离心，获得纯化的达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体。将所获得表达针对癌症高表达蛋白的小干扰RNA的肿瘤特异性嵌合启动子的条件复制型腺病毒载体在-80℃的冰箱内保存。

[0087] 核苷酸序列

[0088] 核苷酸序列表

[0089] <110>陕西师范大学

[0090] <120>肿瘤特异嵌合启动子及其构建方法和应用

[0091] <160>3

[0092] <210>1

[0093] <211>233

[0094] <212>DNA

[0095] <213>人

[0096] <220>

[0097] <221>misc_recomb

[0098] <400>1

[0099] CCCGGCCTGC ACGCGTTCTT TGAAAGCAGT CGAGGGGGCG CTAGGTGTGG 50[0100] GCAGGGACGA GCTGGCGCGG CGTCGCTGGG TGCACCGCGA CCACGGGCAG 100[0101] AGCCACGCGG CGGGAGGACT ACAACTCCCG GCACACCCCG CGCCGCCCCG 150[0102] CCTCTACTCC CAGAAGGCCG CGGGGGGTGG ACCGCCTAAG AGGGCGTGCG 200[0103] CTCCCGACAT GCCCCGCGGC GCGCCATTAA CCG 233[0104] <210>2

[0105] <211>62

[0106] <212>DNA

[0107] <213>人工合成

[0108] <220>

[0109] <221>misc_recomb

[0110] <400>2

[0111] GTAGGCCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA 50[0112] CCGTCAGATC TC 62[0113] <210>3

[0114] <211>313

[0115] <212>DNA

[0116] <213>人工合成

[0117] <220>

[0118] <221>misc_recomb

[0119] <400>3

[0120] CTCGAGCCCG GCCTGCACGC GTTCTTTGAA AGCAGTCGAG GGGGCGCTAG 50[0121] GTGTGGGCAG GGACGAGCTG GCGCGGCGTC GCTGGGTGCA CCGCGACCAC 100[0122] GGGCAGAGCC ACGCGGCGGG AGGACTACAA CTCCCGGCAC ACCCCGCGCC 150[0123] GCCCCGCCTC TACTCCCAGA AGGCCGCGGG GGGTGGACCG CCTAAGAGGG 200[0124] CGTGCGCTCC CGACATGCCC CGCGGCGCGC CATTAACCGT CTAGAGTAGG 250[0125] CCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC 300[0126] AGATCTCATC GAT 313