一种透明质酸的制备方法

摘要

本发明涉及一种透明质酸的制备方法，通过调整氢氧化钠的质量体积比在30～5％来控制发酵液粘度在100～500cp，最后制得透明质酸。本发明的透明质酸的制备方法明能够明显提高透明质酸产量；只需要通过添加水，调节氢氧化钠的浓度，在调节pH的同时控制发酵液的粘度，提高了发酵液的传质效果，综合生产成本下降了近30％。

权利要求

1.一种透明质酸的制备方法，其特征在于，在发酵过程中，从发酵2小时开始控制氢氧化钠质量体积比浓度为30％，在发酵进行到8～14小时开始降低氢氧化钠的质量体积比在

5％，控制发酵液粘度在100～500cp，最后制得透明质酸。

2.根据权利要求1所述的透明质酸的制备方法，其特征在于，在发酵进行到9～12小时开始降低氢氧化钠的质量体积比在5％，控制发酵液粘度在200～300cp。

3.根据权利要求1或2所述的透明质酸的制备方法，其特征在于，所述发酵液粘度控制在280cp。

4.根据权利要求1或2所述的透明质酸的制备方法，其特征在于，发酵过程中，控制温度在30～40℃，搅拌速度为100～500r/min，通气量为0～2vvm，维持pH 6.0～8.0，发酵10～30小时。

5.根据权利要求3所述的透明质酸的制备方法，其特征在于，发酵过程中，控制温度在

30～40℃，搅拌速度为100～500r/min，通气量为0～2vvm，维持pH 6.0～8.0，发酵10～

30小时。

说明书

一种透明质酸的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种发酵制备透明质酸的方法。

背景技术

[0002] 透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质(Meyer K.，Palmer J.W.The polysaccharide of the vitreous humor.J.biol.chem，1934，107：629～634)。HA作为一种生化药物，不仅在医学上应用广泛，在日化工业，由于HA具有良好的保湿作用，又是皮肤和其他组织中广泛存在的天然生物分子，从20世纪80年代开始用于化妆品中，被誉为理想的天然保湿因子(凌沛学，贺艳丽，郭学平。透明质酸。中国轻工业出版社，2000)，因而其在化妆品工业中应用广泛。

[0003] HA的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法成本高，分离纯化复杂，逐步被发酵法替代。微生物发酵生产HA的实现是HA生产领域在近年来取得的最重大的进展。链球菌属属于兼性厌氧菌，在有氧和无氧条件下都可以生长，而从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成(Goh，L.T.Fermentation studies ofhyaluronic acid fermentation by Streptococcus zooepidemicus.InChemical Engineering；Brisbane：University of Queensland，1998)。但是在发酵过程中由于产生的透明质酸包裹在菌体周围，增加了发酵液粘度，降低溶氧，限制了菌体的生长和透明质酸的产量，成为了限制透明质酸发酵工业的一个重要因素。发酵过程中通过加大风量、提高转速以及添加氧载体的方法提高发酵液中的溶氧，对提高透明质酸的产量都有一定的效果，但同时生产成本有一定程度的增加。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种透明质酸的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

[0005] 本发明提供一种透明质酸的制备方法，在发酵过程中，通过调整氢氧化钠的质量体积比在30～5％来控制发酵液粘度在100～500cp，最后制得透明质酸。

[0006] 本发明提透明质酸的制备方法使用链球菌FYFJ-623进行发酵。

[0007] 其中，从发酵2小时开始控制氢氧化钠质量体积比浓度为30％。

[0008] 在发酵进行到8～14小时开始降低氢氧化钠的质量体积比在30～5％，控制发酵液粘度在100～500cp。

[0009] 优选地，在发酵进行到9～12小时开始降低氢氧化钠的质量体积比在30～5％，控制发酵液粘度在200～300cp。

[0010] 优选地，所述发酵液粘度控制在280cp。

[0011] 发酵过程中，控制温度在30～40℃，搅拌速度为100～500r/min，通气量为0～2vvm，维持pH 6.0～8.0，发酵10～30小时。

[0012] 本发明测定粘度的方法为旋转式粘度计法。

[0013] 本发明透明质酸的制备方法通过控制发酵液粘度提高发酵制备的透明质酸产量，从发酵8～14小时到发酵结束，逐渐降低氢氧化钠的质量体积比浓度，由30％降到5％，控制发酵液的粘度在100～500cp，改善了发酵液的流动性，提高了发酵液的传质效果。50升发酵罐验证，同样的原料消耗，透明质酸的产量由170克提高到205克。

[0014] 本发明透明质酸的制备方法具有以下有益效果：

[0015] 1、利用本发明能够明显提高透明质酸产量；

[0016] 2、只需要通过添加水，调节氢氧化钠的浓度，在调节pH的同时控制发酵液的粘度，提高了发酵液的传质效果，综合生产成本下降了近30％；

[0017] 3、本发明所提供的控制发酵液粘度，改善发酵液流动性，提高传质效果的策略对其他高粘度发酵具有一定的借鉴意义。

具体实施方式

[0018] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0019] 链球菌FYFJ-623的来源：原始菌种购自中国药科大南京伊贝加科技有限公司；

[0020] 粘度测定采用旋转式粘度计法。

[0021] 实施例1

[0022] 1)斜面培养：链球菌FYFJ-623无菌条件下分别接种于固体培养基上，37℃条件下培养24小时；

[0023] 2)一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，37℃，200r/min摇床培养10小时，pH降至5.0，无水乙醇沉淀有絮状物出现即可；

[0024] 3)二级种子培养：按液体培养基的体积比2％的接种量，将一级种子接种到5L的发酵罐中，37℃条件下，搅拌速度为220r/min，通气量为1vvm，培养10小时，制得二级种子；

[0025] 4)发酵培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将二级种子接种到50L的发酵罐中，37℃条件下，搅拌速度为200r/min，培养20小时。

[0026] 其中步骤1)使用的培养基配方为：

[0027] 斜面配方(g/L)：牛肉膏5；蛋白胨5；酵母粉5；琼脂15；硫酸镁1；磷酸氢二钾2；葡萄糖5。

[0028] 其中步骤2)使用的培养基配方为：

[0029] 一级种子配方(g/L)：牛肉膏5；蛋白胨5；酵母粉10；硫酸镁2；磷酸氢二钾5；葡萄糖20。

[0030] 其中步骤3)使用的培养基配方为：

[0031] 二级种子配方(g/L)：牛肉膏5；酵母粉10；蛋白胨5；硫酸镁2；磷酸氢二钾5；葡萄糖10。

[0032] 其中步骤4)使用的培养基配方为：

[0033] 发酵配方(g/L)：酵母粉15；蛋白胨5；硫酸镁2；硫酸锰0.05；磷酸氢二钾5；硫酸锌0.01；硫酸亚铁0.03；葡萄糖70。

[0034] 发酵培养过程包括：37℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为0.8vvm，从发酵2小时开始控制氢氧化钠的质量体积比浓度为30％，维持pH7.0，10小时以后粘度达到215cp，将氢氧化钠质量体积比浓度从30％逐渐降低至5％，维持pH7.0，控制发酵液粘度
280cp，发酵20小时，获得透明质酸产品总量203克。

[0035] 实施例2

[0036] 1)斜面培养：链球菌FYFJ-623无菌条件下分别接种于固体培养基上，37℃条件下培养24小时；

[0037] 2)一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，37℃，200r/min摇床培养10小时，pH降至5.0，无水乙醇沉淀有絮状物出现即可；

[0038] 3)二级种子培养：按液体培养基的体积比2％的接种量，将一级种子接种到5L的发酵罐中，37℃条件下，搅拌速度为220r/min，通气量为1vvm，培养10小时，制得二级种子；

[0039] 4)发酵培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将二级种子接种到50L的发酵罐中，37℃条件下，搅拌速度为200r/min，培养20小时。

[0040] 其中步骤1)使用的培养基配方为：

[0041] 斜面配方(g/L)：牛肉膏5；蛋白胨5；酵母粉5；琼脂15；硫酸镁1；磷酸氢二钾2；葡萄糖5。

[0042] 其中步骤2)使用的培养基配方为：

[0043] 一级种子配方(g/L)：牛肉膏5；蛋白胨5；酵母粉10；硫酸镁2；磷酸氢二钾5；葡萄糖20。

[0044] 其中步骤3)使用的培养基配方为：

[0045] 二级种子配方(g/L)：牛肉膏5；酵母粉10；蛋白胨5；硫酸镁2；磷酸氢二钾5；葡萄糖10。

[0046] 其中步骤4)使用的培养基配方为：

[0047] 发酵配方：(g/L)：酵母粉15；蛋白胨5；硫酸镁2；硫酸锰0.05；磷酸氢二钾5；硫酸锌0.01；硫酸亚铁0.03；葡萄糖70。

[0048] 发酵培养过程包括：37℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1vvm，从发酵2小时开始控制氢氧化钠质量体积比浓度为30％维持pH7.0，10小时以后粘度达到220cp，将氢氧化钠质量体积比浓度从30％逐渐降低至5％，维持pH7.0，控制发酵液粘度280cp，发酵20小时，获得产品总量205克。

[0049] 实施例3

[0050] 前面步骤同实施例1。

[0051] 发酵培养过程包括：30℃条件下，搅拌速度为500r/min，通气量为2vvm，从发酵2小时开始控制氢氧化钠质量体积比浓度为30％维持pH7.0，8小时以后粘度达到100cp，将氢氧化钠质量体积比浓度从30％逐渐降低至5％，维持pH6.0，控制发酵液粘度220cp，发酵10小时，获得透明质酸产品总量193克。

[0052] 实施例4

[0053] 前面步骤同实施例1。

[0054] 发酵培养过程包括：40℃条件下，搅拌速度为150r/min，通气量为0.5vvm，从发酵2小时开始控制氢氧化钠质量体积比浓度为30％维持pH8.0，14小时以后粘度达到250cp，