快速检测重金属胁迫下核仁蛋白质定位的免疫荧光方法

摘要

本发明公开了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法。它是切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干，放在1％TritonX-100浸泡15分钟；然后滴入15μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，处理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后在荧光显微镜下观察。本发明的检测方法具有特异性高、实验结果准确，大大提高了观察细胞数目等特点。该方法为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其方法具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其特征在于，按如下的步骤进行：(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；经PBS缓冲液洗；

(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤后压片；

(3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取0.1-0.2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；

(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗涤；

(5)在(4)得到的载片上滴入15-20μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h-1.5h；再经PBS缓冲液洗涤；

(6)再将(5)得到的载片上滴入15-20μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min-1h；经PBS缓冲液洗涤；

(7)再将(6)的载玻片上滴加15-20μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；

(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1-2h后在荧光显微镜下观察。

2.权利要求1所述的检测方法，其中步骤(2)中酶解所用时间是指：在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。

3.权利要求1所述的检测方法，其中步骤(2)中所述的压片是指：酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不盖盖玻片，自然风干后备用。

4.权利要求1所述的检测方法，其中所述的PBS缓冲液洗涤是指采用PBS缓冲液洗3次，每次10-15分钟。

5.权利要求1所述的检测方法，其中的一抗为：鼠抗B23单克隆抗体，其浓度为0.5mg/ml。

6.权利要求1所述的检测方法，其中的二抗为：FITC-兔抗鼠IgG其浓度为0.75mg/ml。

7.权利要求1所述的检测方法，其中DAPI的浓度为1μg/m1。

8.权利要求1所述的检测方法，其中的重金属为Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb或Zn。

9.权利要求1所述的检测方法，其中所述的植物细胞包括洋葱、大蒜、蚕豆或小麦。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种快速检测重金属胁迫下核仁蛋白质变化的定位方法。更具体的说是一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法。该方法为研究重金属毒害植物细胞机理提供新的技术支持。

技术背景

近年来随着现代工业的迅速发展，矿山开采和矿石的冶炼，化肥和农药的不合理施用，“三废”和城市生活垃圾的排放，污泥农用等都导致了环境污染问题日益严重，尤其是含有重金属(As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn等)的污染物通过各种途径进入环境，并且通过食物链危害动物和人体健康，导致大气和水环境质量的进一步恶化。目前，全球性的重金属污染状况日益严重，如何控制和减轻重金属对环境的污染和危害，已成为环境、土壤及相关学科科学家们关注的热点课题。一些研究表明了低浓度重金属对植物的生长有积极的刺激作用，但当细胞中重金属浓度过高，则对植物的生长产生毒害作用，引起植物生理、生化的变化；抑制植物生长；损伤细胞结构；影响植物正常生长发育。

核仁(nucleolus)是细胞核内高度紧密的结构，它是rDNA转录和核糖体亚基组装的场所。核仁不仅是细胞内通讯和核糖体RNA加工的中心，而且在细胞周期，细胞增殖和衰老中起重要的调控作用；一般来说，核仁的化学成分主要由DNA、RNA、蛋白质和酶类等组成。其中以蛋白质为主，占干重的80％。RNA约占干重的10％，它多与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。利用蛋白质组学方法已鉴定了350中核仁蛋白，这些蛋白质与核仁的功能密切相关。目前，重金属胁迫下能够诱导损伤核仁的结构，影响核仁蛋白功能的报道已引起相关领域科学家的关注。人们利用生理生化方法、分子生物学和细胞生物学手段，从不同角度研究重金属对核仁蛋白质合成、分布及功能的影响。其中，硝酸银染是特异显示核仁中酸性非组蛋白的一种染色方法，常用于研究核仁蛋白质的定位。发明人利用此技术研究了不同重金属(Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn、Al)胁迫对大蒜、洋葱、蚕豆及玉米等植物幼苗根尖细胞核仁的影响，这些研究结果表明：重金属胁迫能够损伤核仁结构，导致核仁中银染蛋白物质外溢到细胞质中。其他学者的研究也得到相同的结果，李晓玲、张义贤用不同浓度氯化镍处理对绿豆和大麦后，通过银染的方法也观察到Ni2+能够诱导绿豆和大麦根尖细胞核仁银染蛋白颗粒数量明显增加。因此，利用银染技术研究对重金属对植物细胞核仁结构的影响，具有一定的科学价值。

但是，银染技术只能鉴定重金属胁迫后，从细胞核外溢到细胞质中的银染颗粒是核仁蛋白，不能鉴定是哪些种核仁蛋白受到重金属胁迫的影响，对深入研究重金属毒害机理有一定的局限性。

近些年来，荧光免疫分析技术的发展尤为迅速，已在生命科学领域中广泛地用于测定生长因子、蛋白质定位、核酸分析、神经递质等方面研究。核仁蛋白B23是真核细胞核仁的重要的蛋白组份之一，在核糖体前体的加工、装配和运输、维持核仁的结构、功能和调节细胞生长等方面具有重要作用。但是，利用免疫荧光技术研究重金属胁迫对核仁周期过程中B23蛋白质的功能和动态变化的影响尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，为研究逆境胁迫下细胞中蛋白质定位及变化特征提供了简易、准确、快速的方法。
本发明人结合实验室前期工作，发明了一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法。该技术的主要原理是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。特别是本发明涉及的压片方法的改革，能够提高观察细胞数目，可适用于其它细胞生物学研究。为达到上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其特征在于，按如下的步骤进行：
(1)切取重金属处理后的植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；经PBS缓冲液洗；
(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤后压片；
(3)将植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取约0.1-0.2ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；
(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分钟；经PBS缓冲液洗涤；
(5)在(4)得到的载片上滴入15-20μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h-1.5h；再经PBS缓冲液洗涤；
(6)再将(5)得到的载片上滴入15-20μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min-1h；经PBS缓冲液洗涤；
(7)再将(6)的载玻片上滴加15-20μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；
(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1-2h后在荧光显微镜下观察。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中步骤(2)中酶解所用时间是指：在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时，即结束酶解。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中步骤(2)中所述的压片是指：酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不盖载玻片，自然风干后备用。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中的一抗为：鼠抗B23单克隆抗体，其浓度为0.5mg/ml。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中的二抗为：FITC-兔抗鼠IgG其浓度为0.75mg/ml。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中DAPI(4，6-二胺-2苯基吲哚-二盐酸)的浓度为1μg/ml。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中的1％Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中的防淬灭剂为10×1ml。
本发明所述的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中的重金属为As、Cd、Co、Al、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb或Zn。优选As、Cd、Co、Al、Cr、Cu、Hg特别优选Cd、Pb和Al。
本发明的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，其中所述的植物细胞包括：洋葱、蚕豆、大蒜和小麦根尖细胞中核仁B23蛋白质的变化。
本发明的检测重金属胁迫下植物细胞核仁B23蛋白质定位的免疫荧光方法，能够对重金属胁迫后，细胞内核仁B23蛋白质的变化进行精确定位。
本发明用到的用于固定样品的多聚甲醛试剂属危险化学品，请注意适当防护。多聚甲醛在冷水中不易溶解，配制时要放置在通风橱中，90℃搅拌加热至溶解(呈透明色)，冷却至室温后，倒入棕色瓶中，4℃保存待用。
本发明酶解所需的时间，要根据样品酶解的具体情况而定。根据本发明人的经验，在镜检时观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下细胞核时结束酶解，获得的效果最佳。酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不用盖盖玻片，自然风干后备用。这种方法减去了常规压片中盖片和揭片两个步骤，避免了在这两个步骤的操作中对细胞的损伤。
更加详细的实验步骤如下：
以植物根尖为实验材料，待根生长长度约1.5cm左右时，进行不同重金属胁迫实验。
(1)切取重金属处理后的根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h。
(2)PBS缓冲液(pH 7.0)中洗3次(每次10分钟)。
(3)2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶，37℃温箱酶解，根据细胞酶解情况确定时间。
(4)PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。
(5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约0.1-0.2ml样品液，均匀涂于载片上分散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1％TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡20分钟。
(7)PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。
(8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)配好的一抗(与B23核仁蛋白结合)至载玻片的样品处，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h-1.5h。需要强调的是：购买的抗体要尽快分装，分装可以最大程度地降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
(9)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)配好的二抗(与一抗结构的荧光素)至载玻片的样品上，盖上盖玻片。37℃温箱孵育45min-1h。
(11)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(12)DAPI(DNA染料)染色：用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)DAPI盖上载玻片。
(13)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(10μl)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后可在荧光显微镜下观察。
(15)荧光显微镜观察：核仁B23蛋白用蓝光450～490nm(FITC)激发呈绿色荧光。DNA(细胞核和染色体)用紫外光355～425nm(DAPI)激发呈蓝色荧光。
本发明所用到主要试剂的配置及保存：
(1)一抗：鼠抗B23单克隆抗体(mouse monoclonal anti-B23 antibody)，购自Sigma(美国)公司。一抗浓度为0.5mg/ml，每个包装为0.2ml。购买后按每管10μL分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。待用时解冻。使用前用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至1.5ml即可(相当于稀释了150倍)，4℃保存。
(2)二抗：FITC-兔抗鼠IgG(Fluorescein-conjugated rabbit anti-Mouse IgG(H+L))，购自Sigma(美国)公司。原装进口为冻干粉，2.0ml；进口分装为液体，0.1ml(另加0.1ml甘油)。按每管10μL分装于0.5ml离心管中，-20℃避光保存。待用时解冻，用PBS buffer(pH 7.6)稀释至0.5ml即可(相当于稀释了50倍)，4℃避光保存待用
(3)DAPI(4，6-二胺-2苯基吲哚-二盐酸)DAPI主要染核酸中DNA，储存液用无离子水配成1mg/ml浓度，4℃避光保存备用，使用终浓度为1μg/ml，4℃避光保存。紫外光激发，细胞核和染色体呈蓝色荧光。
(4)磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)
NaCl       0.14mM    0.0082g/L
KCl        2.7mM     0.2013g/L
Na2HPO4    8.0mM     2.8651g/L
NaH2PO4    1.5mM     0.2041g/L
加无离子水至1L，用0.1MNaH2PO4调pH至7.0
(5)固定剂4％多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer)：购自Sigma(美国)公司。称多聚甲醛白色粉末1g，量取25ml PBS buffer于烧杯中，盖盖儿，放置在通风橱中，90℃搅拌加热至溶解(呈透明色)，冷却至室温后，倒入棕色瓶中，4℃保存待用。固定剂4％多聚甲醛，主要是杀死细胞，维持细胞在活体时的结构状态。
(6)酶液(2.5％Cellulase纤维素酶+2.5％Pectolase果胶酶)：购自Yakult Honsha(日本)公司。一般配制5ml酶液，分别称0.125g Cellulase和0.125g Pectolase，于5ml无离子水中，充分溶解后，分装于4支1.5ml的离心管中，-24℃保存备用。主要作用去除细胞壁(纤维素和果胶)。
(7)1％Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)：购自上海化学试剂公司。一般配25ml，取0.25ml Triton X-100加到25ml PBS buffer中，现用现配。这是一种优异的表面活性剂、润湿及洗涤剂，破细胞膜，即在细胞膜上打孔，使抗体进入。
(8)抗荧光淬灭封片液(Antifade mounting medium)：购自上海杰美基因公司。
(9)指甲油市场购置。
本发明的实验中应注意的几个问题：
(1)抗体的活性决定了使用效果，如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。因此，买来的抗体要尽快分装，分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
(2)酶解是本实验关键的步骤之一，酶解时间依细胞具体情况而定。根据我们的经验，在镜检时如果观察到大部分细胞均分散开，成一层球形原生质体，其中少量细胞的细胞质已经解体，只剩下核时结束酶解。
(3)压片方法也是本实验成功的关键步骤。本发明对传统的制片方法进行了改革。酶解后直接将样品制成悬浮液状态，然后，均匀地滴在载玻片上，不用盖盖玻片，自然风干后备用。这种方法减去了常规压片中盖盖片和揭片两个步骤，避免了在这两个步骤的操作中对细胞的损伤。
本发明通过免疫荧光定位技术，对重金属胁迫后的核仁B23蛋白质的变化进行精确定位。我们利用上述方法已经观察了在Cd、Pb和Al胁迫下，洋葱和蚕豆根尖细胞中核仁B23蛋白质的变化，取得了很好的结果。本发明的检测技术具有特异性高、实验结果准确等特点。本发明中对常规压片方法进行了改革，使操作步骤更加简便易行、大大提高了观察细胞数目等优点。该方法为研究重金属等逆境胁迫下对细胞中蛋白质的影响提供科学依据。为探讨重金属毒害细胞机理提供了精确的检测方法，其方法具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1为未经重金属胁迫的细胞中核仁B23蛋白质的分布。其中A1：绿色荧光显示B23蛋白；A2：蓝色荧光显示细胞核(DNA)；A3：合成图。
图2为重金属胁迫后细胞中核仁B23蛋白质在细胞中的定位。B、N、O显示细胞核中的B23蛋自在重金属的胁迫下外溢到细胞质中，并随着重金属处理浓度的升高和处理时间的延长，B23蛋白量逐渐增多。
B1：绿色荧光显示B23蛋白；B2：蓝色荧光显示细胞核(DNA)；B3：合成图；
N1：绿色荧光显示B23蛋白；N2：蓝色荧光显示细胞核(DNA)；N3：合成图；
O1：绿色荧光显示B23蛋白；O2：蓝色荧光显示细胞核(DNA)；O3：合成图。

具体实施方式

以下结合实施例用来帮助理解本发明，并且不用于也不应被解释为以任何方式对所列出的权利要求中发明的限制。
实施例1
材料培养以蚕豆为例：蚕豆主(侧)根根长约1.5cm左右时，用10μM、50μM、100μM的Cd2+处理24h、48h、72h。
(1)切取重金属处理后的蚕豆植物根尖分生组织细胞，于4％多聚甲醛中固定2h；经PBS缓冲液洗；
(2)采用2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶酶液于37℃温箱酶解；经PBS缓冲液洗涤后压片；
(3)将蚕豆植物根尖转至离心管中，滴加PBS缓冲液，手摇震荡至多数细胞游离状态，用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载玻片上分散成单个细胞，标记后自然风干后备用；
(4)将(3)得到的载玻片放在1％TritonX-100浸泡15分钟；经PBS缓冲液洗涤；
(5)在(4)得到的载片上滴入15μl配好的一抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育1h；再经PBS缓冲液洗涤；
(6)再将(5)得到的载片上滴入15μl配好的二抗，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min-1h；经PBS缓冲液洗涤；
(7)再将(6)的载玻片上滴加15μl DAPI，盖上盖玻片；经PBS缓冲液洗涤；
(8)用滤纸吸干多余PBS，滴加5μl防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后在荧光显微镜下观察。
(9)荧光显微镜观察及图像分析处理：制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型荧光显微镜观察，激发光分别为紫外光355～425nm(DAPI)和蓝光450～490nm(FITC)。Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392×1040象素。图像的后期处理利用Photoshop 7.0软件排版。
实施例2
材料培养以大蒜为例，大蒜不定根根长约1.5cm左右时，用10μM、50μM、100μM的Pb2+处理24h、48h、72h。Pb
实验步骤：
(1)切取重金属处理后的根尖约2mm，于4％多聚甲醛中固定2h。
(2)PBS缓冲液(pH 7.0)中洗3次(每次10分钟)。
(3)2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶，37℃温箱酶解，在酶解过程中随时镜检，直到有大量的球形原生质体产生结束酶解。
(4)PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。
(5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约0.2ml样品液，均匀涂于载片上分散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1％Triton X-100中抽提20min。
(7)PBS缓冲液洗3次(每次10分钟)。
(8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，用经PBS稀释的一抗(鼠抗B23单克隆抗体，工作浓度1∶150)37℃孵育1h或4℃孵育过夜。
(9)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工作浓度1∶50)至载玻片上的样品处，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min-1h。
(11)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(12)DAPI染色：用滤纸吸干多余PBS缓冲液，滴一滴(20μl)DAPI，盖上盖玻片。
(13)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(10μl)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后可在荧光显微镜下观察。
(15)荧光显微镜观察及图像分析处理：制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型荧光显微镜观察，激发光分别为紫外光355～425nm(DAPI)和蓝光450～490nm(FITC)。Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392×1040象素。图像的后期处理利用Photoshop 7.0软件排版。
实施例3
洋葱根尖细胞中核仁B23蛋白质的变化
材料培养以洋葱为例：洋葱不定根根长约1.5cm左右时，用10μM、50μM、100μM的Al3+处理24h、48h、72h。
实验步骤：
(1)切取重金属处理后的根尖约2mm，于4％多聚甲醛中固定2h。
(2)PBS缓冲液(pH 7.0)中洗3次(每次15分钟)。
(3)2.5％纤维素酶+2.5％果胶酶，37℃温箱酶解，在酶解过程中随时镜检，直到有大量的球形原生质体产生结束酶解。
(4)PBS缓冲液洗3次(每次15分钟)。
(5)将根尖转至0.5ml的离心管中，滴加PBS缓冲液少量(适样品多少而定)，盖离心管盖，手摇震荡至多数细胞游离状态。用滴管吸取约0.1ml样品液，均匀涂于载片上分散成单个细胞，不盖盖玻片，用记号笔在载片的无样品面标记，自然风干后备用。
(6)将要标记的切片放在1％Triton X-100中抽提20min。
(7)PBS缓冲液洗3次(每次15分钟)。
(8)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，用经PBS稀释的一抗(鼠抗B23单克隆抗体，工作浓度1∶150)37℃孵育1h或4℃孵育过夜。
(9)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(10)用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工作浓度1∶50)至载玻片上的样品处，盖上盖玻片，37℃温箱孵育45min。
(11)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(12)DAPI染色：用滤纸吸干多余的PBS缓冲液，滴一滴(20μl)DAPI盖上盖玻片。
(13)PBS缓冲液中洗3次(每次10分钟)。
(14)用滤纸吸干多余PBS，滴一滴(10μl)防淬灭剂于载玻片材料上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片四周封好，1h后可在荧光显微镜下观察。
(15)荧光显微镜观察及图像分析处理：制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型荧光显微镜观察，激发光分别为紫外光355～425nm(DAPI)和蓝光450～490nm(FITC)。Pixera Pro 600CL CCD数码照相。图像采集为1392×1040象素。图像的后期处理利用Photoshop 7.0软件排版。