原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法及试剂盒，方法包括以下步骤：a、用等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法除去样品中的大部分蛋白质，再用盐酸溶液调节pH至2.0～3.0，作为样品溶液；b、向巯基乙酸包被的金胶溶液中加入样品溶液，用水稀释0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为1.9×10-5～4.8×10-5mol/L，混匀后室温下静置2～5分钟，目视观察溶液颜色变化；c、通过溶液颜色是否发生变化以及变化程度判断样品中是否含有三聚氰胺以及三聚氰胺的含量范围；试剂盒包括巯基乙酸包被的金胶溶液和标准比色卡；本发明方法和试剂盒检测准确，重现性好，不需要使用任何昂贵仪器，操作简便快速，成本低，易于为普通检测人员和消费者掌握，应用前景好。

权利要求

1.原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，其特征在于：包括以下步骤：a、样品的前处理

取原料乳或液体乳制品或固体乳制品的水溶液，用盐酸溶液调节pH至酪蛋白的等电点使酪蛋白沉淀，离心取上清液，再加入乙醇使其余蛋白质变性沉淀，离心取上清液，用盐酸溶液调节pH至2.0，作为样品溶液；

b、样品溶液的检测

向溶液颜色为红色的巯基乙酸包被的金胶溶液中加入步骤a所得样品溶液，用水稀释-5

0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为3.8×10 mol/L，混匀，室温下静置3分钟，目视观察溶液颜色的变化；

c、结果判断

将步骤b所得溶液颜色与试剂盒中的比色卡对照，如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色或蓝色或深蓝色，则判定样品中含有三聚氰胺：如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0.8mg/L≤c≤1.7mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为

1.7mg/L＜c＜2.5mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为深蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度大于2.5mg/L；

如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，则判定样品中不含有三聚氰胺或仅含有低含量的三聚氰胺：步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0mg/L≤c＜0.8mg/L；

根据步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度和样品的总稀释倍数，即可计算出样品中三聚氰胺的含量范围。

2.根据权利要求1所述的原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，其特征在于：将氯金酸溶液与巯基乙酸溶液混合，用氢氧化钠溶液调节pH至6～7，滴加还原剂硼氢化钠溶液，室温下搅拌反应，所得红色透明溶液即为巯基乙酸包被的金胶溶液。

3.用于权利要求1所述的原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括巯基乙酸包被的金胶溶液和标准比色卡。

说明书

原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法，特别涉及原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，以及用于该方法的试剂盒。

背景技术

[0002] 三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工原料，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，还可以用作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。

[0003] 由于我国主要通过测定含氮量来估算食品的蛋白质含量，而三聚氰胺的含氮量约为66％，远远高于蛋白质的平均含氮量16％，因此，三聚氰胺被不法商人掺入食品中，使食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品蒙混过关。动物实验结果表明，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，导致膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。2007年，美国爆发宠物食品污染事件，事后调查表明，掺杂了≤6.6％三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年，我国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。

[0004] 现有原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法等。这些方法虽然能够实现三聚氰胺的精确检测，但其需要精密仪器和专业人员操作，耗时较长，检测费用较高，在大部分食品生产企业和普通消费者中难以普及。因此，国家科技部面向社会征集快速检测原料乳及乳制品中三聚氰胺的技术和产品，并提出三项要求：对三聚氰胺的检测准确，检测限小于或等于2毫克/每公斤或每升，重现性好；适合现场、快速检测，平均每个样品检测时间小于30分钟(包括样品前处理时间)；技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，具有检测准确、重现性好、不需要使用任何贵重仪器，操作简便快速、成本低等特点，易于为普通检测人员和消费者掌握，有利于实际推广和应用；目的之二在于提供一种用于原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的试剂盒。

[0006] 为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，包括如下步骤：

[0007] a、样品的前处理

[0008] 取原料乳或液体乳制品或固体乳制品的水溶液，用盐酸溶液调节pH至酪蛋白的等电点使酪蛋白沉淀，离心取上清液，再加入乙醇使其余蛋白质变性沉淀，离心取上清液，用盐酸溶液调节pH至2.0～3.0，作为样品溶液；

[0009] b、样品溶液的检测

[0010] 向溶液颜色为红色的巯基乙酸包被的金胶溶液中加入步骤a所得样品溶液，用水-5 -5稀释0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为1.9×10 ～4.8×10 mol/L，混匀，室温下静置2～5分钟，目视观察溶液颜色的变化；

[0011] c、结果判断

[0012] 如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色或蓝色或深蓝色，则判定样品中含有三聚氰胺；如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，则判定样品中不含有三聚氰胺或仅含有低含量的三聚氰胺。

[0013] 进一步，所述方法包括以下步骤：

[0014] a、样品的前处理

[0015] 取原料乳或液体乳制品或固体乳制品的水溶液，用盐酸溶液调节pH至酪蛋白的等电点使酪蛋白沉淀，离心取上清液，再加入乙醇使其余蛋白质变性沉淀，离心取上清液，用盐酸溶液调节pH至2.0，作为样品溶液；

[0016] b、样品溶液的检测

[0017] 向溶液颜色为红色的巯基乙酸包被的金胶溶液中加入步骤a所得样品溶液，用水-5稀释0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为3.8×10 mol/L，混匀，室温下静置3分钟，目视观察溶液颜色的变化；

[0018] c、结果判断

[0019] 将步骤b所得溶液颜色与试剂盒中的比色卡对照，如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色或蓝色或深蓝色，则判定样品中含有三聚氰胺：如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0.8mg/L≤c≤1.7mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为
1.7mg/L＜c＜2.5mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为深蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度大于2.5mg/L；

[0020] 如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，则判定样品中不含有三聚氰胺或仅含有低含量的三聚氰胺：步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0mg/L≤c＜0.8mg/L；

[0021] 根据步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度和样品的总稀释倍数，即可计算出样品中三聚氰胺的含量范围。

[0022] 进一步，所述巯基乙酸包被的金胶溶液可由以下方法得到：将氯金酸溶液与巯基乙酸溶液混合，用氢氧化钠溶液调节pH至6～7，滴加还原剂硼氢化钠溶液，室温下搅拌反应，所得红色透明溶液即为巯基乙酸包被的金胶溶液。

[0023] 在本发明的第二方面，提供了一种用于原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括巯基乙酸包被的金胶溶液和标准比色卡。

[0024] 本发明的有益效果在于：本发明检测方法为色度半定量检测，通过反应液的颜色变化及变化程度，不仅可判断样品中三聚氰胺的有无，而且可判断样品中三聚氰胺的含量范围，检测准确，重现性好，不需要使用任何贵重仪器，成本低，操作简便快速，易于为普通检测人员和消费者掌握，有利于实际推广和应用。本发明检测试剂盒成本低，使用方便，具有良好的市场前景。

附图说明

[0025] 图1为巯基乙酸包被的金胶与三聚氰胺作用的可见吸收光谱图；其中：曲线1为巯基乙酸包被的金胶溶液的可见吸收光谱(空白对照)，曲线2为巯基乙酸包被的金胶溶液与pH为2.0的盐酸溶液作用的可见吸收光谱(阴性对照)，曲线3～5为巯基乙酸包被的金胶溶液与pH为2.0的浓度分别为1.6，1.8，2.5mg/L的三聚氰胺溶液作用的可见吸收光谱。

[0026] 图2为样品溶液的酸度优化结果。

[0027] 图3为巯基乙酸包被的金胶的反应浓度优化结果。

[0028] 图4为三聚氰胺浓度与金胶最大吸收波长之间的关系示意图。

具体实施方式

[0029] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

[0030] 本发明使用的巯基乙酸包被的金胶溶液的制备方法已有大量文献报道，优选实施例中使用的巯基乙酸包被的金胶溶液是参照文献方法(徐娇珍等，pH值对硫醇修饰的金纳米粒子聚集态的影响，化学研究，2003，14(4)：16-18)制得：取浓度为12mmol/L的氯金酸溶液2ml，加水50ml和浓度为10mmol/L的巯基乙酸溶液260μl，用浓度为0.02mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至6～7，加水稀释至99ml，混匀，滴加新制的质量分数为1％的硼氢化钠溶液1ml，室温下搅拌反应3小时，所得红色透明溶液即为巯基乙酸包被的金胶溶液，用紫外分光光度计测得溶液的最大吸收波长为518nm，根据氯金酸的用量和溶液总体积计算出金胶浓度。

[0031] 1、原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的建立

[0032] (1)巯基乙酸包被的金胶与三聚氰胺反应的光谱特征

[0033] 取浓度为2.4×10-4mol/L的巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入用盐酸溶液调节pH至2.0的不同浓度的三聚氰胺溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml(巯基乙酸包被的-5金胶的反应浓度为3.8×10 mol/L，三聚氰胺的反应浓度分别为1.6，1.8和2.5mg/L)；同时设空白对照(不加入三聚氰胺溶液)和阴性对照(以pH为2.0的盐酸溶液替代三聚氰胺溶液)；室温下静置3分钟，用分光光度计扫描可见吸收光谱。

[0034] 结果如图1所示，与空白对照比较，阴性对照的金胶最大吸收波长未发生变化，而在巯基乙酸包被的金胶溶液中加入pH为2.0的不同浓度的三聚氰胺溶液后，金胶的最大吸收波长发生红移，峰形变宽，且随着三聚氰胺浓度的增加，波长红移和峰形变宽的程度逐渐增大，溶液颜色由红色→淡紫色→蓝色→深蓝色逐渐变化。推测其反应机理如下：巯基乙酸-通过Au-S键包被在金胶表面，其羧基裸露在外，当溶液pH近中性时主要以COO 的形式存+
在；而三聚氰胺的氨基当溶液pH为2.0时主要以NH3 的形式存在；在巯基乙酸包被的金胶- +
溶液中加入pH为2.0的三聚氰胺溶液后，金胶表面的COO 与三聚氰胺的NH3 通过静电作用结合，拉近金胶之间的距离，从而使金胶的最大吸收波长发生红移，峰形变宽。

[0035] (2)样品溶液的酸度优化

[0036] 取浓度为2.4×10-4mol/L的巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入不同pH(分别为1.2，1.5，1.8，1.9，2.0，3.1，4.3和5.5)的盐酸溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml(巯-5基乙酸包被的金胶的反应浓度为3.8×10 mol/L)，室温下静置3分钟，用分光光度计扫描可见吸收光谱，记录金胶的最大吸收波长，并与空白对照(不加入盐酸溶液)进行比较，计算最大吸收波长的红移值(Δλ)，再以盐酸溶液的pH为横坐标，最大吸收波长的红移值(Δλ)为纵坐标绘制曲线。

[0037] 结果如图2所示，在巯基乙酸包被的金胶溶液中加入pH≥2.0的盐酸溶液后，金胶的最大吸收波长未发生变化；而在巯基乙酸包被的金胶溶液中加入pH＜2.0的盐酸溶液后，金胶的最大吸收波长发生红移，且红移程度随着pH降低而逐渐增大。推测其反应机理- -如下：当溶液pH近中性时，金胶表面的羧基主要以COO 的形式存在，COO 之间的静电斥力- +
作用使金胶呈稳定的分散状态；当溶液pH降低时，COO 会逐渐与H 结合形成COOH，COOH之间可以通过氢键作用拉近金胶之间的距离，从而使金胶的最大吸收波长发生红移。因此，为了避免盐酸本身对检测结果的干扰，同时又保证三聚氰胺尽可能的质子化，样品溶液的酸度优选为pH 2.0～3.0，最优选为2.0。

[0038] (3)巯基乙酸包被的金胶的反应浓度优化

[0039] 取不同浓度的巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入用盐酸溶液调节pH至2.0的三聚氰胺溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml[巯基乙酸包被的金胶的反应浓度分别为-51.0，1.9，2.9，3.8，4.8，5.8，6.7(×10 )mol/L，三聚氰胺的反应浓度为1.6mg/L]，室温下静置3分钟，用分光光度计扫描可见吸收光谱，记录金胶的最大吸收波长，并与阴性对照(以pH为2.0的盐酸溶液替代三聚氰胺溶液)进行比较，计算最大吸收波长的红移值(Δλ)，再以巯基乙酸包被的金胶的反应浓度(c)为横坐标，最大吸收波长的红移值(Δλ)为纵坐标绘制曲线。

[0040] 结果如图3所示，与阴性对照比较，当巯基乙酸包被的金胶的反应浓度-5c≥4.8×10 mol/L时，金胶的最大吸收波长未发生变化；而当巯基乙酸包被的金胶的反-5
应浓度c＜4.8×10 mol/L时，金胶的最大吸收波长发生红移，且红移程度随着浓度降低-5
而逐渐增大；但巯基乙酸包被的金胶的反应浓度c＜1.9×10 mol/L时，溶液颜色很浅，-5
不利于色度观察；因此，综合考虑，巯基乙酸包被的金胶的反应浓度优选为1.9×10 ～-5 -5
4.8×10 mol/L，最优选为3.8×10 mol/L。

[0041] (4)三聚氰胺浓度与金胶最大吸收波长之间的关系

[0042] 取巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入用盐酸溶液调节pH至2.0的不同浓度的三聚氰胺溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml(巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为-53.8×10 mol/L，三聚氰胺的反应浓度分别为0.8，1.2，1.6，1.7，1.8，1.9，2.1，2.5，2.9，
3.4，3.8，4.2和4.6mg/L)，室温下静置3分钟，用分光光度计扫描可见吸收光谱，记录金胶的最大吸收波长，并与阴性对照(以pH为2.0的盐酸溶液替代三聚氰胺溶液)进行比较，计算最大吸收波长的红移值(Δλ)，再以三聚氰胺的反应浓度(c)为横坐标，最大吸收波长的红移值(Δλ)为纵坐标绘制散点图。

[0043] 结果如图4所示，与阴性对照比较，当三聚氰胺的反应浓度c＜0.8mg/L时，金胶的最大吸收波长未发生变化，溶液颜色仍为红色；当三聚氰胺的反应浓度c为0.8mg/L≤c≤1.7mg/L时，金胶的最大吸收波长均红移2nm，溶液颜色由红色变为淡紫色；当三聚氰胺的反应浓度c为1.7mg/L＜c＜2.5mg/L时，金胶的最大吸收波长红移2～12nm(不包括2nm和12nm)，溶液颜色由红色变为蓝色；当三聚氰胺的反应浓度c≥2.5mg/L时，金胶的最大吸收波长均红移12nm，溶液颜色由红色变为深蓝色。

[0044] (5)原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法

[0045] 根据上述实验结果和优化的反应条件，建立原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，包括以下步骤：

[0046] a、样品的前处理

[0047] 取原料乳或液体乳制品或固体乳制品的水溶液，用盐酸溶液调节pH至酪蛋白的等电点使酪蛋白沉淀，离心取上清液，再加入乙醇使其余蛋白质变性沉淀，离心取上清液，用盐酸溶液调节pH至2.0～3.0，作为样品溶液；

[0048] b、样品溶液的检测

[0049] 向溶液颜色为红色的巯基乙酸包被的金胶溶液中加入步骤a所得样品溶液，用水-5 -5稀释0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为1.9×10 ～4.8×10 mol/L，混匀，室温下静置2～5分钟，目视观察溶液颜色的变化；

[0050] c、结果判断

[0051] 如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色或蓝色或深蓝色，则判定样品中含有三聚氰胺；如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，则判定样品中不含有三聚氰胺或仅含有低含量的三聚氰胺。

[0052] 进一步，在上述方法基础上，根据最优选的反应条件，原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法包括以下步骤：

[0053] a、样品的前处理

[0054] 取原料乳或液体乳制品或固体乳制品的水溶液，用盐酸溶液调节pH至酪蛋白的等电点使酪蛋白沉淀，离心取上清液，再加入乙醇使其余蛋白质变性沉淀，离心取上清液，用盐酸溶液调节pH至2.0，作为样品溶液；

[0055] b、样品溶液的检测

[0056] 向溶液颜色为红色的巯基乙酸包被的金胶溶液中加入步骤a所得样品溶液，用水-5稀释0～10倍使巯基乙酸包被的金胶的反应浓度为3.8×10 mol/L，混匀，室温下静置3分钟，目视观察溶液颜色的变化；

[0057] c、结果判断

[0058] 将步骤b所得溶液颜色与试剂盒中的比色卡对照，如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色或蓝色或深蓝色，则判定样品中含有三聚氰胺：如果步骤b所得溶液颜色由红色变为淡紫色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0.8mg/L≤c≤1.7mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为
1.7mg/L＜c＜2.5mg/L；如果步骤b所得溶液颜色由红色变为深蓝色，则判定步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度大于2.5mg/L；

[0059] 如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，则判定样品中不含有三聚氰胺或仅含有低含量的三聚氰胺：步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度c为0mg/L≤c＜0.8mg/L；

[0060] 根据步骤b所得溶液中三聚氰胺的浓度和样品的总稀释倍数，即可计算出样品中三聚氰胺的含量范围。

[0061] 当然，为了更准确地了解样品中三聚氰胺的浓度范围，如果步骤b所得溶液颜色由红色变为深蓝色，可以增大样品的稀释倍数后再按照步骤a～c进行检测；如果步骤b所得溶液颜色仍为红色，可以缩小样品的稀释倍数或将样品浓缩后再按照步骤a～c进行检测。

[0062] 在上述方法中，采用等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法进行样品前处理(分离除去样品中的大部分蛋白质)：原料乳与乳制品中酪蛋白的含量约占总蛋白含量的80～82％，故先采用等电点沉淀法除去酪蛋白，再采用有机溶剂沉淀法除去其它残留蛋白，在保证提纯样品的同时可以避免新的干扰杂质的掺入。

[0063] 2、用于原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的试剂盒

[0064] 根据建立的原料乳与乳制品中三聚氰胺的色度检测方法，可以制备用于原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法的试剂盒，该试剂盒包括巯基乙酸包被的金胶溶液。此外，为了统一颜色标准，使检测者更准确地判断步骤b所得溶液的颜色，该试剂盒中还包括标准比色卡。

[0065] 3、原料乳与乳制品中三聚氰胺色度检测方法及其检测试剂盒的应用[0066] (1)含有三聚氰胺的奶粉的检测

[0067] 取 已 知含 有 三 聚 氰 胺 的 奶 粉(施 恩 牌 婴 幼 儿 配 方 奶 粉，批 号4161080187700238)3g，加入蒸馏水30ml使溶解，用浓盐酸调节溶液pH至4.6，静置分层，离心取上清液，再加入乙醇10ml，静置分层，离心取上清液，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液调节pH为2.0，作为样品溶液；

[0068] 取浓度为2.4×10-4mol/L的巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入样品溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml，室温下静置3分钟，目视观察，溶液颜色由红色变为淡紫色，表明溶液中含有浓度为0.8～1.7mg/L的三聚氰胺，根据样品的稀释倍数，计算出该奶粉中三聚氰胺的含量为16.3mg/kg，与国家质检总局报道的采用高效液相色谱法检测的结果(17mg/kg)基本一致。

[0069] (2)不含有三聚氰胺的奶粉的检测

[0070] 取已知不含有三聚氰胺的奶粉(雅士利牌较大婴儿配方奶粉，批号：2548584479516281)3g，加入蒸馏水30ml使溶解，用浓盐酸调节溶液pH至4.6，静置分层，离心取上清液，再加入乙醇10ml，静置分层，离心取上清液，用浓度为0.02mol/L的盐酸溶液调节pH为2.0，作为样品溶液；

[0071] 取浓度为2.4×10-4mol/L的巯基乙酸包被的金胶溶液400μl，加入样品溶液250μl，用蒸馏水稀释至2.5ml，室温下静置3分钟，目视观察，溶液颜色未发生变化，表明样品中不含有三聚氰胺，与国家质检总局报道的采用高效液相色谱法检测的结果基本一致。

[0072] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。