用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品去脂方法

摘要

一种用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品去脂方法，其特征在于包括以下步骤：(1)结合态合成性激素残留的酶解释放；(2)合成性激素残留的提取：酶解反应完成后加入有机溶剂提取，取上清液；(3)脂类的去除：向上清液中添加二价金属盐酸盐，待沉淀析出离心分离，取上清液；(4)目标合成性激素提取液的制备：将去脂后的上清液蒸发近干加入有机溶剂与水，得目标合成性激素提取液；(5)固相萃取柱净化：将目标合成性激素提取液载入固相萃取柱，收集洗脱液，氮气吹干加入有机溶剂溶解，滤膜过滤后上机测试。本发明的优点在于去脂效率较高、操作简单，并且能避免固相萃取柱的堵塞与目标合成性激素的损失，从而获得较好的回收率。

权利要求

1.一种用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品去脂方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)结合态合成性激素残留的酶解释放：称取5.0g已打碎鱼制品样品或咸蛋样品，准确至0.1g，置于50mL具塞塑料离心管中，若为加标样品加入一定量的标准溶液及内标物，然后加入0.2mol/L的pH为5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液10mL，再加入β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶的酶解液50μL，于37℃水浴震荡器中震荡酶解12h，取出冷却至室温，其中

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内标物及各内标物的浓度如下：氘代诺龙-d3为2μg/kg；雌二醇- C2为4μg/kg；己稀雌酚-d8为4μg/kg；

(2)合成性激素残留的提取：酶解反应完成后在具塞塑料离心管中加入15mL甲醇，涡旋振荡混匀后，超声提取15min，10000r/min离心10min，上清液转入另一洁净离心管中，向残渣中加入15mL甲醇重复提取一次，10000r/min离心10min，合并两次所得上清液；

(3)脂类的去除：在步骤(2)得到的上清液中加入1gZnCl2固体，搅拌至ZnCl2完全溶解，此时有沉淀析出，10000r/min离心10min后，取上清液；

(4)目标合成性激素提取液的制备：将去脂后的上清液转移至100mL鸡心瓶中，加入

5mL正丙醇溶液，于45℃旋转蒸发至近干，加入1mL甲醇超声溶解后，再加入10mL水稀释，得目标合成性激素提取液；

(5)固相萃取柱净化：将LC-C18固相萃取柱以5mL甲醇、5mL水活化平衡后，将所得目标合成性激素提取液载入LC-C18固相萃取柱，并以5mL体积比为10％的甲醇水溶液或水洗涤鸡心瓶上残留的溶液，作为淋洗液淋洗LC-C18固相萃取柱后抽至近干，LC-C18固相萃取柱下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脱后，将LC-C18固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脱LC-NH2固相萃取柱，收集全部甲醇洗脱液，于50℃下氮气吹干，加入1mL体积比为50％的甲醇水溶液，漩涡混匀30s，超声溶解30s，过0.2μm滤膜后，得到能够直接上机用于检测分析的样品液。

说明书

用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品去脂方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品前处理方法，尤其是涉及一种用于动物源食品中合成性激素残留检测的样品去脂方法。

背景技术

[0002] 合成性激素是一类由动物性腺分泌或者人工合成的低分子量、强亲脂性、具有生物活性的类固醇类物质。由于合成性激素具有增强食欲、抑制发情、增加体重等作用，并且极少量就能产生极大的促生效果。因而，动物源食品的生产者为了追求动物养殖的高经济效益，从20世纪50年代起，人工合成性激素常常被用于畜牧业生产中。

[0003] 合成性激素的稳定性较高，残留于动物源食品中，正常的烹调、加工均不能将其破坏，这些合成性激素通过食物链进入人体，在人体内积累，当其含量超过人体正常水平时，就会破坏机体的正常生理平衡，从而产生不良反应。近年来的研究结果认为，儿童性早熟、男性女性化、妇女子宫癌、乳腺癌等病例发病率逐年升高与动物性食品中残留的合成性激素有关。由此可见，合成性激素残留对食品安全性带来的问题不容忽视，已引起公众广泛关注。世界各国都相继出台了禁药令，严禁将合成性激素作为促生剂使用。我国发布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》及农业部、卫生部、国家药品监督管理局第176号公告——《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》即将已烯雌酚、玉米赤霉醇、去甲雄三烯醇酮、醋酸甲孕酮、丙酸睾酮等19类合成性激素及具有合成性激素作用的兽药列为违禁药物，严禁在食品源动物饲养中使用。

[0004] 为了保障食品安全，保护消费者的利益，准确检测动物源食品中残留的合成性激素具有十分重要的意义。当前，动物源食品中合成性激素的测定方法主要是气相色谱-质谱(GC-MS)法和液相色谱-质谱(LC-MS)法。由于动物性食品中合成性激素的残留量很低，常常在μg/g水平，甚至ng/kg的水平；同时，复杂的食品基质样品中的杂质会产生基质效应，从而干扰痕量合成性激素的确证和定量测定。因此，通过有效的样品前处理方法包括提取、富集、净化，使用于检测分析的样品液中目标合成性激素含量高，杂质少，有利于动物源食品中合成性激素的确证和定量测定，使分析结果更加准确。

[0005] 当前，动物性食品中合成性激素残留检测的样品前处理方法往往采用图1所示步骤，在图1所示的样品前处理过程中，去脂是实验成败的关键技术之一，因为去脂效果不好会造成固相萃取柱的堵塞、基质效应较大，图中指出的常用去脂方法存在如下缺陷：(1)正己烷去脂因许多合成性激素的极性并不是很强而导致目标合成性激素的损失；(2)冷冻去脂需要花费较长的处理时间和较为苛刻的设备条件，并且该法仅仅对肌肉组织有用，而对于像鱼肉等水产品及禽蛋等蛋制品仍然存在固相萃取柱堵塞的问题。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于动物源食品中合成性激素残留检测的前处理过程中去脂效果好，目标合成性激素回收率高，基质效应有效消除的去脂方法。

[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：(1)结合态合成性激素残留的酶解释放：向装有动物源食品的离心管中加入酶解液，进行酶解反应；(2)合成性激素残留的提取：酶解反应完成后加入有机溶剂，涡旋振荡混匀后，超声提取，然后离心分离，取上清液，向固体残渣中加入有机溶剂，重复上述步骤，合并两次所得上清液；(3)脂类的去除：向上清液中添加二价金属盐酸盐，待沉淀析出，离心分离，取上清液；(4)目标合成性激素提取液的制备：将去脂后的上清液转移至鸡心瓶中，在40-50℃下旋转蒸发至近干，加入有机溶剂溶解，再加水稀释，得目标合成性激素提取液；(5)固相萃取柱净化：将上述步骤所得目标合成性激素提取液载入活化好的固相萃取柱，淋洗液淋洗后，用甲醇洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，加入有机溶剂，漩涡混匀，超声溶解，滤膜过滤后，得到可直接上机用于检测分析的样品液。

[0008] 所述二价金属盐酸盐包括ZnCl2、CaCl2、MgCl2、FeCl2、CdCl2，二价金属盐在总提取液中的质量体积浓度为0.25-125g/L。

[0009] 所述固相萃取柱净化的步骤包括，向LC-C18固相萃取柱中载入5mL甲醇、5mL水活化平衡后，将所得合成性激素提取液载入LC-C18固相萃取柱，并以5mL体积比为10％的甲醇水溶液或水洗涤鸡心瓶上残留的溶液，作为淋洗液淋洗LC-C18固相萃取柱，抽至近干，下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脱后，将LC-C18固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脱LC-NH2固相萃取柱，收集洗脱液于45-55℃下氮气吹干，加入1mL体积比为50％的甲醇水溶液，超声溶解，漩涡混匀，过0.2μm滤膜，得到可直接上机用于检测分析的样品液。

[0010] 与现有技术相比，本发明的优点在于：首先二价金属盐酸盐的去脂效率较高、操作简单，能够在较短的时间内简单的去除脂类物质，从而避免了固相萃取柱的堵塞现象；其次二价金属盐酸盐去脂能够避免合成性激素的损失，从而可获得较好的回收率。实验结果如表1所示，冷冻去脂效率低，且易堵塞固相萃取柱；正己烷去脂虽去脂效率高，但合成性激素回收率低；而本发明采用的二价金属盐酸盐去脂克服了现有技术中正己烷去脂与冷冻去脂的缺点，不仅去脂效率高，并且合成性激素回收率也远远高于现有去脂技术，因此具有很好的推广应用价值。

[0011] 表1不同去脂方法的去脂效率和回收率分析结果

[0012]

附图说明

[0013] 图1为当前合成性激素残留检测的样品前处理流程。

具体实施方式

[0014] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0015] 实施例1：鱼肉样品中合成性激素残留检测的样品去脂方法

[0016] 1、所用试剂及标准物质

[0017] 水：超纯水

[0018] 甲醇：色谱纯

[0019] 甲酸：优级纯

[0020] 标准物质：甲基炔诺酮(Norgestrel)、甲基睾酮(Methyltestosterone)、丙酸睾酮(Testosterone propionate)、醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroue Acetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)、诺龙(Nandrolone)；炔雌醇(Ethinylestradiol)；17α-雌二醇(17α-Estadiol)；17β-雌二醇(17β-Estadiol)；α-玉米赤酶醇(α-Zeranol)；雌酮(Estrone)；双烯雌酚13 13
(Dienestrol)；己烷雌酚(Hexestrol)；雌三醇(Estriol)；雌二醇- C2(Estadiol- C2)；己稀雌酚-d8((Diethylstilbestrol)等标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量均≥98％；
己稀雌酚(Diethylstilbestrol)购自Sigma-Aldrich，氘代诺龙(Nandrolone-d3)购自Toronto Research Chemicals Inc，含量98％；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶。

[0021] 2、主要仪器及材料

[0022] 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、离心机、固相萃取装置、超声仪、旋涡混合器、旋转蒸发仪、氮吹仪、LC-C18固相萃取柱，LC-NH2固相萃取柱。

[0023] 3、样品前处理过程

[0024] 称取5.0g已打碎鱼制品样品，准确至0.1g，置于50mL具塞塑料离心管中，若为加标样品加入一定量的标准溶液及内标物(内标物浓度：氘代诺龙-d3，2μg/kg；雌二13
醇- C24μg/kg；己稀雌酚-d8，4μg/kg)，然后加入0.2mol/LpH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液10mL，再加入β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶的酶解液50μL，于37℃水浴震荡器中震荡酶解12h，取出冷却至室温，加入15mL甲醇，涡旋振荡混匀后，超声提取15min，10000r/min离心10min，上清液转入另一洁净离心管中，残渣再以15mL甲醇重复提取一次，10000r/min离心10min，合并两次所得上清液。向上清液中加入1gZnCl2固体，搅拌至ZnCl2完全溶解，此时有沉淀析出，10000r/min离心10min，上清液转入100mL鸡心瓶中，加入5mL正丙醇溶液，于45℃旋转蒸发至近干，加入1mL甲醇超声溶解后，再加入10mL水稀释，得目标合成性激素提取液，留待固相萃取柱净化。

[0025] LC-C18固相萃取柱以5mL甲醇、5mL水活化平衡后，将所得目标合成性激素提取液载入LC-C18固相萃取柱，并以5mL体积比为10％的甲醇水溶液或水洗涤鸡心瓶上残留的溶液，作为淋洗液淋洗LC-C18固相萃取柱后抽至近干。下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脱后，将LC-C18固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脱LC-NH2固相萃取柱，收集全部甲醇洗脱液，于50℃下氮气吹干，加入1mL体积比为50％的甲醇水溶液，漩涡混匀30s，超声溶解30s，过0.2μm滤膜后上机测试。分析结果显示，正离子模式采用氘代诺龙-d3为内标物进行定量，添加水平为4μg/kg时，样品中合成性激素平均回收率为70％～109％，相对标准偏差为6.2％～8.1％，；负离子模式中，雌三醇、炔雌醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、α-玉米赤酶醇以雌二醇-13C2为内标物进行定量，添加水平为4μg/kg时，样品中合成性激素平均回收率为86％～118％，相对标准偏差为4.5％～8.4％，雌酮、双烯雌酚、己烷雌酚、己稀雌酚以己稀雌酚-d8为内标物进行定量，添加水平为4μg/kg时，样品中合成性激素平均回收率为79％～111％，相对标准偏差为5.2％～10.2％，符合国内外兽药残留检测对方法的要求。

[0026] 实施例2：蛋制品中合成性激素残留检测的样品去脂方法

[0027] 1、所用试剂及标准物质

[0028] 同实施例1。

[0029] 2、主要仪器及材料

[0030] 同实施例1。

[0031] 3、样品前处理过程

[0032] 称取5.0g已打碎咸蛋样品，准确至0.1g，置于50mL具塞塑料离心管中，若为加标样品加入一定量的标准溶液及内标物(内标物浓度：氘代诺龙-d3，2μg/kg；雌二13
醇- C24μg/kg；己稀雌酚-d8，4μg/kg)，然后加入0.2mol/LpH＝5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液10mL，再加入β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶的酶解液50μL，于37℃水浴震荡器中震荡酶解12h，取出冷却至室温，加入15mL甲醇，涡旋振荡混匀后，超声提取15min，10000r/min离心10min，上清液转入另一洁净离心管中，残渣再以15mL甲醇重复提取一次，10000r/min离心10min，合并2次所得上清液。向上清液中加入1g的ZnCl2固体，搅拌至ZnCl2完全溶解，此时有沉淀析出，10000r/min离心10min，上清液转入100mL鸡心瓶中，加入5mL正丙醇溶液，于45℃旋转蒸发至近干，加入1mL甲醇超声溶解后，再加入10mL水稀释，得目标合成性激素提取液，留待固相萃取柱净化。

[0033] LC-C18固相萃取柱以5mL甲醇、5mL水活化平衡后，将所得目标合成性激素提取液载入LC-C18固相萃取柱，并以5mL体积比为10％的甲醇水溶液或水洗涤鸡心瓶上残留的溶液，作为淋洗液淋洗LC-C18固相萃取柱后抽至近干。下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脱后，将LC-C18固相萃取柱柱去掉，再以2mL甲醇洗脱LC-NH2固相萃取柱柱，收集全部甲醇洗脱液，于50℃下氮气吹干，加入1mL体积比为50％的甲醇水溶液，漩涡混匀30s，超声溶解30s，过0.2μm滤膜后上机测试。

[0034] 分析结果显示，正离子模式采用氘代诺龙-d3为内标物进行定量，添加水平为4μg负离子模式中，雌三醇、炔雌醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、α-玉米赤酶醇以雌
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二醇- C2为内标物进行定量，添加水平为4μg/kg时，样品中合成性激素平均回收率为
90％～114％，相对标准偏差为3.5％～7.4％，雌酮、双烯雌酚、己烷雌酚、己稀雌酚以己稀雌酚-d8为内标物进行定量，添加水平为4μg/kg时，样品中合成性激素平均回收率为
81％～110％，相对标准偏差为4.6％～9.1％，符合国内外兽药残留检测对方法的要求。