胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法和应用

摘要

本发明涉及胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法和应用，有效解决胆固醇修饰壳聚糖共聚物载药胶束的制备问题，其解决的技术方案是，1、纯化壳聚糖；2、制备胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物；3、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的分离纯化；4、制备胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束，本发明具有在水性介质自组装形成一种热力学稳定的胶体溶液的特性，制备简单，效果好，是医学领域内的创新。

权利要求

1.一种胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法，其特征在于，所说的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物，其结构式如下：其中m、n为聚合度，m+n≤20，脱乙酰度为70～100％，其制备方法由以下步骤实现：(1)、壳聚糖的纯化：

称取5.00g分子量50kDa的壳聚糖粗品，溶于350ml0.1M的冰醋酸溶液中，搅拌溶解，过滤，滤液加入180ml0.2M的NaOH溶液，过滤，用去离子水洗涤滤饼至PH值在6，置于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到纯化的壳聚糖；

(2)、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的制备与纯化：

利用胆固醇甲酰氯中具有强反应活性的酰氯基团与壳聚糖主链上脱乙酰化的氨基之间的酰胺反应，合成胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物，其中，先取纯化后的分子量为

50kDa的壳聚糖1.008g置圆底烧瓶中，加入50ml二甲基亚砜溶液和27ml氯仿的溶液，然后加入三乙胺2ml并磁力搅拌，得混合溶液，备用；取1.360g胆固醇甲酰氯，溶解于27ml氯仿溶液中，然后缓慢滴入上述催化并磁力搅拌下的混合溶液中，磁力搅拌反应48小时，壳聚糖与胆固醇甲酰氯反应的摩尔比为2∶1，取出反应液，过滤，滤液装入透析袋，以去离子水为透析介质，透析5天，透析袋截留分子量为8000～14000，取出透析袋中的固体物，干燥后于硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷，收集产物洗脱液，挥去二氯甲烷，置于 干燥机中干燥，即得到纯化的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末；

(3)、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备：

利用胆固醇甲酰氯中具有强反应活性的酰氯基团与壳聚糖主链上脱乙酰化的氨基之间的酰胺反应，合成胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物：称取纯化的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末50.8mg，冬凌草甲素9.7mg，溶于15ml无水乙醇中，得溶解液，备用，再取60ml去离子水，磁力搅拌，将上述加入无水乙醇的溶解液缓慢滴加到此去离子水中，滴完后继续搅拌30min，然后在40℃，0.7kpa减压，用旋转蒸发仪旋转蒸发，蒸发至

20ml溶液，得到的溶液装入透析袋以去离子水透析60min，透析袋截留的分子量为8000～

14000，即得到胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束，胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的载药量5.72％。

2.权利要求1所述的制备方法制备的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束在制备抑制癌症细胞生长的药物中的应用。

说明书

胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法和

应用

一、技术领域

[0001] 本发明涉及医学领域，特别是一种胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法和应用。二、背景技术

[0002] 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化而得到的一种生物高分子，是甲壳素的主要衍生物，甲壳素和壳聚糖是含氮的多糖类物质，也是自然界中唯一含游离氨基天然碱性多糖，具有抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能，且具有无毒、无刺激、无免疫原性、无热源反应、不溶血、无致突变性及可自然降解、良好的组织相容性等特点，具有极大的医学应用价值。近20年来，随着壳聚糖多种衍生物活性的发现，全世界对该类产品的研究十分活跃，其应用领域也不断拓宽。1991年，美国、欧洲的医学界、科技界、营养食品研究机构将其作为继蛋白质、糖、脂肪、维生素、矿物质之后人体必需的第六生命要素。1997年，壳聚糖的研究开发课题列入我国国家科委九五攻关项目，后被列入我国国家863计划，并取得了大量研究成果。

[0003] 然而，壳聚糖内部分子的高度取向和分子间强烈的氢键作用，限制了其应用。壳聚糖分子中存在游离胺基和活性羟基，因此易于对壳聚糖进行结构改造，得到不同结构、不同功能且溶解度增强的衍生物。衍生化的方式主要有：酰基化、羧基化、烷基化、酯化、羟基化和醚化等。壳聚糖诸多的可修饰基团使其衍生物具有许多独特的性能，所以倍受国内外药物研究者以及制药企业的关注。尤其适用于多肽、蛋白质以及核苷类药物等生物活性大分子药物的包埋和释放。在药物制剂方面，如应用于缓释、控释制剂，已有了相当的研究深度和广度。对壳聚糖纳米微粒进行修饰，使得微粒对某些器官、组织或者细胞具有靶向性，将会更进一步拓宽壳聚糖的应用价值，是现在的研究热点。

[0004] 肿瘤一直是威胁人类健康的重大疾病，其药物治疗关键是提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶部位的聚集，从而解决治疗效果差、毒副作用巨大等问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织(器官)、细胞是解决癌症化疗治疗效果差和降低其毒副作用的重要手段之一。

[0005] 随着生物纳米技术的发展，将肿瘤药物装在于微载体，发挥纳米尺寸效应，易透过各种生物屏障，并可载有更多的药物，这已成为抗癌药物新型给药系统研究的热点。其中，可生物降解的两亲性共聚物载药系统倍受注目。两亲性是指分子结构中同时具有疏水基团和亲水基团两部分。共聚物胶束是这种两亲性的嵌段或接枝共聚物在水性介质中自聚形成，具有核-壳结构，胶束直径在纳米级范围(＜200nm)。其疏水性链段构成胶束的内核，亲水性链段形成胶束的外壳。疏水性可为难溶性药物提供储库的作用，亲水性外膜保持胶束在水性环境中的稳定性，并可进行理化性质修饰以达到特定的目的，如胶束的主动靶向等，形成两亲性共聚物纳米胶束载药系统。

[0006] 这种载药系统，具有以下几个特性：(1)临界胶束浓度低，热力学稳定性高；(2)壳-核结构两亲性共聚物载药系统在水或体液中可自组装形成纳米胶束，胶束的外层是亲水段形成的壳，内层为疏水段形成的核，壳-核结构是两亲性共聚物的特有构型；(3)靶向性肿瘤组织比正常组织有更丰富的毛细血管，并且毛细血管壁具有更大的孔隙，当抗癌药物制成两亲性共聚物载药胶束后，由于载药胶束尺寸小，比表面积大，其对肿瘤细胞的渗透增强，肿瘤细胞内的药物浓度将明显高于血药浓度，这显示出了制剂的靶向性；(4)共聚物胶束脱水后，复溶于溶剂，即恢复原胶束结构。

[0007] 近年来，共聚物胶束在药物制剂学、生物医学及高分子领域已经引起了人们广泛的重视。共聚物胶束作为一种药物传输系统，有许多优势：(1)共聚物胶束由于其共聚物溶解度小，故临界胶束浓度很低，且其疏水核芯更稳定，因此共聚物胶束可以经稀释而不易解聚合。因此其对药物更具保护和屏蔽作用，可在一定程度上避免药物的分解，保持药物的稳定性，降低药物的毒性；(2)与脂质体相比，共聚物胶束的载药量较高；(3)共聚物材料的多样性，使得以共聚物为载体的药物制剂亦多样化，能满足各种使用需求；(4)由于胶束粒径很小，故可穿过网状内皮组织系统、血脑屏障，也可使肠胃黏膜等对其良好吸收，到达大尺寸粒子无法通过的部位，达到被动靶向的目的；(5)两亲性共聚物实际上是一种大分子表面活性剂，与低分子表面活性剂的区别是，低分子表面活性剂形成的核是液态的，而共聚物胶束的核是固态的，固态核十分有利于药物的缓释，通过调整材料的pH值、溶解性、Zeta电位等可以控制药物在生物体内的释放。但至今未见到有关制备胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的方法的公开报导。三、发明内容

[0008] 针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备方法和应用，可有效解决胆固醇修饰壳聚糖共聚物载药胶束的制备问题，其解决的技术方案是，1、纯化壳聚糖；2、制备胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物；3、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的分离纯化；4、制备胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束。本发明具有在水性介质自组装形成一种热力学稳定的胶体溶液的特性，制备简单，效果好，是医学领域内的创新。四、具体实施方式

[0009] 以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

[0010] 本发明中的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物，其结构式如下：

[0011]

[0012] 其中m、n为聚合度，m+n≤20，壳聚糖的分子量为3～50kDa，脱乙酰度为70～100％，壳聚糖链上的部分氨基被胆固醇甲酰氯取代；

[0013] 本发明胆固醇甲酰氯修饰壳聚糖制备的方法，由以下步骤实现：

[0014] 1、壳聚糖的纯化：取分子量3～50kDa的壳聚糖粗品，加入壳聚糖重量的65～85倍的0.1M(M为摩尔浓度)的冰醋酸溶液(通常固液混合，固体物用重量g计，液体物用体积ml计，称重量体积，因此，壳聚糖加入0.1M的冰醋酸溶液还可写为“取分子量3～50kDa的壳聚糖粗品，加入壳聚糖重量体积的65～85倍的0.1M的冰醋酸溶液，以下同)，搅拌溶解，过滤，滤液中加入0.2M的氢氧化钠(NaOH)溶液，中和冰醋酸，使壳聚糖完全沉淀，过滤，用去离子水洗涤滤饼至PH值在6～7，冷冻干燥，得到纯化的壳聚糖；

[0015] 2、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的制备：

[0016] 利用胆固醇甲酰氯中具有强反应活性的酰氯基团与壳聚糖主链上脱乙酰化的氨基之间的酰胺反应，合成胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物，步骤是：称取纯化的壳聚糖和胆固醇甲酰氯，壳聚糖分散在体积比为：1～3∶3～1的二甲基亚砜和氯仿溶液中，溶液中壳聚糖的浓度为5～15mg/ml，加入三乙胺1ml～2ml进行催化并磁力搅拌，得混合溶液，备用；再将胆固醇甲酰氯溶于氯仿溶液中，胆固醇甲酰氯的浓度是50～100mg/ml，将此溶液缓慢滴加到上述催化并磁力搅拌下的混合溶液中，反应36～54小时后停止，壳聚糖和胆固醇甲酰氯的反应的摩尔比例是1～4∶4～1，即得胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物；

[0017] 3、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的分离纯化：

[0018] 将胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物过滤，滤液装入透析袋中于去离子水中透析5～7天后，透析袋截留分子量为8000～14000，得到固体物，干燥，于硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷或用石油醚和乙酸乙酯，其中石油醚和乙酸乙酯按体积比为4～6∶1的比例混合，收集产物的洗脱液，挥发除去二氯甲烷或石油醚和乙酸乙酯，干燥，得到胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末；

[0019] 4、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备：

[0020] 将药物与胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末按重量比为1∶1～10的比例溶于无水乙醇中，使药物与胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末完全溶解，得溶解液，药物在无水乙醇中的浓度为0.5～1mg/ml，胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物在无水乙醇中浓度为0.5mg/ml～10mg/ml，另取去离子水，磁力搅拌，将上述加入无水乙醇的溶解液缓慢滴加到此去离子水中，无水乙醇与去离子水的体积比为1∶2～5，滴加完后，再继续搅拌20min～120min，然后在20℃～70℃，0.4kpa～1kpa减压，用旋转蒸发仪旋转蒸发，蒸发至搅拌后溶液体积的1/5～1/3，得到的溶液装入透析袋以去离子水为透析介质透析50～100min，透析袋截留分子量8000～14000，即得到胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束，胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的载药量为2％～15％，所说的旋转蒸发仪是上海亚荣生化仪器厂生产的型号RE-52AA的旋转蒸发仪。

[0021] 胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束可以包裹水溶性不理想的药物，以下以冬凌草甲素(模型药)为例，具体制备步骤如下：

[0022] 1、壳聚糖的纯化：

[0023] 称取5.00g分子量50kDa的壳聚糖粗品，溶于350ml 0.1M的冰醋酸溶液中，搅拌溶解，过滤，滤液加入180ml 0.2M的NaOH溶液，过滤，用去离子水洗涤滤饼至PH值在6，置于冷冻干燥机中冷冻干燥，得到纯化的壳聚糖；

[0024] 2、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的制备与纯化：

[0025] 利用胆固醇甲酰氯中具有强反应活性的酰氯基团与壳聚糖主链上脱乙酰化的氨基之间的酰胺反应，合成胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物，其中，先取纯化后的分子量为50kDa的壳聚糖1.008g置圆底烧瓶中，加入50ml二甲基亚砜溶液和27ml氯仿的溶液，然后加入三乙胺2ml并磁力搅拌，得混合溶液，备用；取1.360g胆固醇甲酰氯，溶解于27ml氯仿溶液中，然后缓慢滴加入上述催化并磁力搅拌下的混合溶液中，磁力搅拌反应48小时，壳聚糖与胆固醇甲酰氯反应的摩尔比为2∶1，取出反应液，过滤，滤液装入透析袋，以去离子水为透析介质，透析5天，透析袋截留分子量为8000～14000，取出透析袋中的固体物，干燥后于硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷，收集产物洗脱液，挥去二氯甲烷，置于干燥机中干燥，即得到纯化的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末；

[0026] 3、胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的制备与理化性质的测定：

[0027] 利用胆固醇甲酰氯中具有强反应活性的酰氯基团与壳聚糖主链上脱乙酰化的氨基之间的酰胺反应，合成胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物：称取纯化的胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物的固体粉末50.8mg，冬凌草甲素9.7mg，溶于15ml无水乙醇中，得溶解液，备用，再取60ml去离子水，磁力搅拌，将上述加入无水乙醇的溶解液缓慢滴加到此去离子水中，滴完后继续搅拌30min，然后在40℃，0.7kpa减压，用旋转蒸发仪旋转蒸发，蒸发至20ml溶液，得到的溶液装入透析袋以去离子水透析60min，透析袋截留的分子量为8000～
14000，即得到胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束，胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共聚物载药胶束的载药量5.72％，经微粒粒度和表面电位测定仪测定，该载药胶束在水中的粒径为70～90nm，表面电位为-31～-30mV，胶束的包封率在50％～60％。

[0028] 本发明产品经试验，取得了良好的效果，以胆固醇甲酰氯修饰的壳聚糖共.聚物载药胶束对癌症细胞生长抑制作用为例，有关资料如下：

[0029] 宫颈癌Hela细胞生长于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中。细胞培养条件均为：37℃，5％CO2、饱和湿度、每2-3天用0.25％胰酶消化传代。取指数生长期细胞供实4
验。以0.5×10/mL细胞接种于96孔培养板，每孔200μL，在37℃，5％CO2条件下培养。
用RPMI-1640培养液分别稀释冬凌草甲素胶束和冬凌草甲素溶液至实验所需浓度，于细胞接种24小时后，加入96孔板，每孔200μL。调零组和对照组加相应体积的培养液，每组设
4个平行孔。培养48小时后，每孔加5mg/mL MTT 20μL(调零组除外)，再培养4小时，倾去培养液，加DMSO 150μL/孔，待沉淀完全溶解后，用酶标仪在波长570nm处调零后读取吸光度(A)。以不加药的肿瘤细胞组为对照，计算IC50值。

[0030] 相同实验条件下，Hela细胞接种于96孔板中培养24小时后，加入经RPMI-1640培养液稀释的相同浓度的冬凌草甲素胶束和冬凌草甲素溶液，每孔200μL。调零组和对照组加相应体积的培养液，每组设4个平行孔。培养4小时后，撤出含药的培养液，加入新鲜培养液，每孔200μL，继续培养72小时后，每孔加5mg/mL MTT 20μL(调零组除外)，再培养4小时，倾去培养液，加DMSO150μL/孔，待沉淀完全溶解后，用酶标仪在波长570nm处调零后读取吸光度(A)。以不加药的肿瘤细胞组为对照，计算IC50值。

[0031] 以MTT法测定冬凌草甲素胶束和溶液对Hela细胞生长的抑制作用。冬凌草甲素胶束对Hela细胞生长有明显的抑制和杀伤作用，而空白胶束对Hela细胞生长几乎无抑制和