用于降解黄曲霉毒素B1的粘球菌菌株及其活性蛋白

摘要

本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1的粘球菌菌株及其活性蛋白，该活性蛋白由粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068 CGMCCNo.3194产生。其降解黄曲霉毒素B1的方法，包括下述步骤：取上述得到的活性蛋白，加入黄曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH5.0-9.0，在20-40℃反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。本发明得到的活性蛋白解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，适用于在饲料工业中黄曲霉毒素的去除。

权利要求

1.一种能产生降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068 CGMCC No.3194。

2.一种制备能降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1所述粘球菌菌株，进行摇瓶发酵，用溶剂提取发酵液中的活性蛋白；其中，所述摇瓶发酵的培养基由下述组分组成：酵母粉5-10g，CaCl2·2H2O 0.5-1.5g，VB12 0.3-1mg，蒸馏水

800-1200mL；pH值为7.0-8.0；所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为20-35℃，发酵时间

30-60h，转速100-200r/min。

3.如权利要求2所述的活性蛋白的制备方法，其特征在于，摇瓶发酵结束后，过滤掉发酵液中的菌体得上清液，用冰预冷的体积比为95％的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白。

4.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括下述步骤：取权利要求1所述菌株的发酵液或权利要求2所述的从发酵液中提取的活性蛋白，加入黄曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH值为5.0-9.0，在20-40℃反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。

5.如权利要求4所述的降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，将反应体系调整至pH值7.5，在30℃反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。

说明书

用于降解黄曲霉毒素B1的粘球菌菌株及其活性蛋白

技术领域

[0001] 本发明涉及粘球菌，特别是，涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1的粘球菌菌株及其活性蛋白。

背景技术

[0002] 自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的预防和去毒方法。目前对黄曲霉毒素解毒方法的研究大部分集中在化学处理法，和物理脱毒法等。传统的理化方法去毒都存在一些问题，如导致饲料中的营养损失，影响饲料的感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了实际生产中的应用。

[0003] 利用微生物脱毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有刘大岭发现一种真菌代谢产物具有降解毒素的作用。国外的研究报道比较多的集中在乳酸菌，双歧杆菌，酵母菌和白腐真菌等，还有橙色黄杆菌，红球菌，假密环菌，根霉菌等的报道。对于乳酸菌，双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50％以下，而且最关键的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一些细菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作用时间，溶液pH值，菌体数量，毒素浓度，金属离子浓度等影响，还没有发现一种微生物能完全的不可逆的降解饲料中的黄曲霉毒素。至今为止，还没有关于粘细菌及其代谢产物降解黄曲霉毒素的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种粘球菌菌株及其活性蛋白，以解决现有技术中存在的上述问题。

[0005] 本发明提供一种能产生降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068 CGMCC No.3194。

[0006] 本发明还提供一种制备能降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的方法，包括利用上述粘球菌菌株，进行摇瓶发酵，用溶剂提取发酵液中的活性蛋白。

[0007] 所述摇瓶发酵的培养基包括下述组分：酵母粉5-10g，CaCl2·2H2O0.5-1.5g，VB120.3-1mg，蒸馏水800-1200mL；pH值为7.0-8.0。优选地，包括酵母粉7g，CaCl2·2H2O 1g，VB12 0.75mg，蒸馏水1000mL，pH值为7.5。

[0008] 所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为20-35℃，发酵时间30-60h，pH值7.0-8.0，转速100-200r/min。优选地，所述发酵温度30℃，发酵时间50h，pH值7.5，转速160r/min。

[0009] 摇瓶发酵结束后，过滤掉发酵液中的菌体得上清液，用冰预冷的体积比为95％的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白，沉淀时间可为30min。

[0010] 本发明还提供一种从粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068CGMCC No.3194中制备得到的能降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白(又称解毒酶)。

[0011] 本发明进一步提供降解黄曲霉毒素B1的方法，包括下述步骤：取粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068CGMCC No.3194中得到的发酵液或活性蛋白，加入黄曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH值为5.0-9.0，在20-40℃反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。

[0012] 优选地，将反应体系调整至pH值7.5，在30℃反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。

[0013] 上述菌株是以特异性方法筛选得到的橙色粘球菌ANSM068，已于2009年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.3194。

[0014] 粘球菌菌株ANSM068具有下述性质：

[0015] 1)形态特征：营养细胞呈杆状、两端尖、细胞略屈；粘孢子球形、有折射性、直径1.5微米；子实体为橙色球形孢囊、下端收缩、并有一根明显的柄、不分支；菌落橙色、滑动生长、成薄的扩展菌落群。

[0016] 2)理化特性：

[0017] 表1

[0018]试验项目 试验结果 试验项目 试验结果
刚果红吸附试验 + 淀粉水解 +
酵母菌消化试验 + 氧化酶 -
水解纤维素 - 接触酶 +
水解酪素 +

[0019] 本发明粘球菌菌株得到的活性蛋白及其解毒方法具有以下有益效果：

[0020] 1)该活性蛋白添加在饲料中，能够降低黄曲霉毒素对小鼠的毒性，提高小鼠血清中蛋白含量及免疫能力，部分消除毒素其对免疫功能、抗氧化能力等的不良影响；

[0021] 2)生物酶法降解黄曲霉毒素效率高，特异性强，对饲料和环境没有污染，有效地解决了传统去毒方法存在的问题。

[0022] 3)本发明方法解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，适用于在饲料工业中黄曲霉毒素的去除。

附图说明

[0023] 图1对照组黄曲霉毒素B1图谱；

[0024] 图2蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1图谱。

具体实施方式

[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0026] 黄曲霉毒素B1为市购，购于Sigma公司；

[0027] PBS(0.01mol/L)的制备过程：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L即可。

[0028] 实施例1

[0029] 本发明活性蛋白的制备：利用粘球菌菌株Myxococcus fulvusANSM068 CGMCC No.3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为30℃，pH值7.5，转速160r/min，发酵时间50h。

[0030] 其中摇瓶发酵培养基包括下述组分：酵母粉7g，CaCl2·2H2O 1g，VB120.75mg，蒸馏水1000ml；pH值为7.5。

[0031] 将种子液以20％(占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发酵罐中，其发酵温度为30℃，pH值7.5，溶氧量60％，转速200r/min，发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。

[0032] 发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积冰预冷的乙醇(体积比为95％)溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min，离心15min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻干浓缩得到活性蛋白。

[0033] 实施例2

[0034] 本发明活性蛋白的制备：利用粘球菌菌株Myxococcus fulvusANSM068 CGMCC No.3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为25℃，发酵时间60h，pH值7.0，转速100r/min；

[0035] 其中摇瓶发酵培养基包括下述组分：酵母粉5g，CaCl2·2H2O 1.5，VB120.3mg，蒸馏水1000ml；pH值为7.0。

[0036] 将种子液以20％(占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发酵罐中，其发酵温度为35℃，pH值8.0，溶氧量60％，转速200r/min，发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。

[0037] 发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积冰预冷的乙醇(体积比为95％)溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min，离心20min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻干浓缩得到活性蛋白。

[0038] 实施例3

[0039] 本发明活性蛋白的制备：利用粘球菌菌株Myxococcus fulvusANSM068 CGMCC No.3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为35℃，pH8.0值，转速200r/min，发酵时间30h。

[0040] 其中摇瓶发酵培养基包括下述组分：酵母粉10g，CaCl2·2H2O0.5g，VB12 1.0mg，蒸馏水1000ml；pH值为7.0。

[0041] 将种子液以20％(占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发酵罐中，其发酵温度为20℃，pH值7.0，溶氧量60％，转速100r/min，发酵时间60h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。

[0042] 发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积冰预冷的乙醇(体积比为95％)溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min，离心15min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻干浓缩得到活性蛋白。

[0043] 实施例4

[0044] 本发明活性蛋白的制备：利用粘球菌菌株Myxococcus fulvusANSM068 CGMCC No.3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为30℃，pH值7.5，转速160r/min，发酵时间50h。

[0045] 其中摇瓶发酵培养基包括下述组分：酵母粉7g，CaCl2·2H2O 1g，VB12 0.75mg，蒸馏水1000ml；pH值为7.5。

[0046] 将种子液以20％(占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发酵罐中，其发酵温度为30℃，pH值7.5，溶氧量60％，转速200r/min，发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。

[0047] 发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积冰预冷的乙醇(体积比为95％)溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min，离心15min)，得到粗酶液。

[0048] 实施例5

[0049] 利用实施例1得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1：将冻干浓缩的蛋白酶称取0.01g，溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加入200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)；各处理在30℃反应
72h后，用高效液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先将各样品离心5min，再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机检测条件：流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长350nm，发射波长440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。检测结果：与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为
83.5％，图1为对照组黄曲霉毒素B1的检测图谱，图2为蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的检测图谱。

[0050] 实施例6

[0051] 利用实施例2得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1：将冻干浓缩的蛋白酶称取0.01g，溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加入200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)；各处理在35℃反应
48h后，用高效液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先将各样品离心5min，再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机检测条件：流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长350nm，发射波长440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。检测结果：与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为
81.5％。

[0052] 实施例7

[0053] 利用实施例3得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1：将冻干浓缩的蛋白酶称取0.01g，溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加入200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)；各处理在30℃反应
56h后，用高效液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先将各样品离心5min，再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机检测条件：流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长350nm，发射波长440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。检测结果：与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为
82.0％。

[0054] 实施例8

[0055] 利用实施例4得到的粗酶液降解黄曲霉毒素B1：将冻干浓缩的粗酶液称取0.01g，溶于1ml PBS(0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加入200ul黄曲霉毒素B1(500ppb)；各处理在30℃反应72h后，用高效液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先将各样品离心5min，再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机检测条件：流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长350nm，发射波长440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。检测结果：与对照组相比粗酶液处理组黄曲霉毒素B1的降解率为79.5％。