一种脱水穿心莲内酯分离纯化方法，是一种集成溶剂萃取-柱层析-超临界流体抗溶剂结晶的方法对穿心莲浸膏进行加工制备高纯脱水穿心莲内酯。浸膏先用氯仿萃取；柱层析填料(固定相)采用硅胶等，流动相为石油醚与乙酸乙酯的混合溶剂；超临界流体CO2抗溶剂结晶纯化，条件为：压力≤15MPa，温度≤65℃。产品纯度达99％以上。该分离纯化工艺，方法简便、成本低、易于工业生产应用。
(1)称取1kg穿心莲浸膏，脱水穿心莲内酯含量10％以上，按1∶20(W/V)的固液比溶于30℃温水中，再用氯仿萃取2次；
(2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比30％∶70％-60％∶40％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集90％以上的脱水穿心莲内酯流份；
(3)将上述流份合并、浓缩至有微量晶体析出的饱和溶液，冷却到40-50℃，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在9MPa，温度在60℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶；
(4)在超临界状态下结晶70min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在
(5)将上述结晶产物用45℃丙酮溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
(6)试验结束后，取样检测，可得到纯度99％以上高纯脱水穿心莲内酯30.3g。
(1)称取1kg穿心莲浸膏，脱水穿心莲内酯含量10％以上，按1∶15(W/V)的固液比溶于40℃温水中，再用氯仿萃取2次；
(2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比30％∶70％～60％∶40％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集90％以上的脱水穿心莲内酯流份；
(3)将上述流份合并、浓缩至有微量晶体析出的饱和溶液，冷却到45℃，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在15MPa，温度在45℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶；
(4)在超临界状态下结晶60min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在
(5)将上述结晶产物用45℃丙酮溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
(6)试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯脱水穿心莲内酯31.1g。
(1)称取1kg穿心莲浸膏，脱水穿心莲内酯含量10％以上，按1∶10(W/V)的固液比溶于50℃温水中，再用氯仿萃取2次；
(2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯体积比30％∶70％～60％∶40％的流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集90％以上的脱水穿心莲内酯流份；
(3)将上述流分合并、浓缩至有微量晶体析出的饱和溶液，冷却到45℃，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在12MPa，温度在50℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶；
(4)在超临界状态下结晶50min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在
(5)将上述结晶产物用45℃丙酮溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
(6)试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯脱水穿心莲内酯32.0g。
一种脱水穿心莲内酯分离纯化方法
一、技术领域
[0001] 本发明涉及中药有效成分分离纯化方法，确切地说是一种脱水穿心莲内酯分离纯化方法。二、背景技术
[0002] 穿心莲[Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees]为爵床科植物穿心莲的全草或叶。别名：春莲秋柳(《岭南采药录》)、一见喜(《泉州本草》)、榄核莲、苦胆草、斩蛇剑、日行千里、印度草(广东)，苦草(福建)等。原产于印度，我国主产于华南、西南等长江以南温暖、湿润地区。其气味苦、性寒、归大肠、心、肺、膀胱经，具有清热解毒、凉血、消肿。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。
[0003] 穿心莲内酯类化合物主要活性成分有穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯等。还含穿心莲烷，穿心莲酮，穿心莲甾醇，β-谷甾醇-D-葡萄糖甙等。
[0004] 脱水穿心莲内酯(deoxyandrographolide)，别名：穿心莲丁素、14-deoxy-11，12-didehydroandrographolide，为萜类化合物；易溶于乙醇、丙酮，可溶于氯仿，微溶于苯，几乎不溶于水；无色针状结晶(30％或50％乙醇)；熔点：204℃；分子式：C20H28O4；分子量：
332.42。有以下化学结构式：
[0005]
[0006] 脱水穿心莲内酯具有祛热解毒，消炎止痛之功效，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物。抗肿瘤，利胆保肝，抗蛇毒及毒蕈碱样作用；并有终止妊娠等作用。
[0007] 鉴于脱水穿心莲内酯有上述专属性功效，有必要进行分离纯化，为中药新药开发提供优质原料。而国内对穿心莲内酯类化合物提取分离研究比较早，也比较多。早期主要以水浸提、乙醇提取、碱水提取为主，得到的产品为粗提物(穿心莲总内酯含量在30％左右)。
[0008] 关于脱水穿心莲内酯提取分离方法的申请发明专利有2件：
[0009] (1)CN1962650A(申请号200610032546.0，《一种高纯度脱水穿心莲内酯的制备方法》)：该发明是一穿心莲全草为原料，采用乙醇进行热浸提，再上大孔树脂进行吸附分离，用不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，再上硅胶柱色谱分离，采用氯仿与甲醇的混合液进行洗脱，收集目标物质，再采用乙醇进行重结晶。该方法涉及两次不同的层析分离，存在脱除产品中树脂残留物和有害溶剂的难题。
[0010] (2)CN101168537A(申请号200710142800.7，《同时制备穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的方法》)：该发明是一穿心莲全草为原料，采用醇溶剂进行提取，再上大孔树脂进行吸附分离，用不同浓度乙醇溶液梯度洗脱，分别获得较高纯度的目标物质，再进行溶剂重结晶，可获得97％的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯。
[0011] 目前制备高纯度萜类化合物大都采用有机溶剂反复重结晶方法，其耗时长、得率低，且纯度也难于达到98％以上。三、发明内容
[0012] 要发明旨在为开发I类中药新药提供高纯度的原料药脱水穿心莲内酯，所要解决的技术问题是对现有的纯化方法进行改进。
[0013] 本发明的技术方案是以穿心莲浸膏(穿心莲总内酯含量≥30％)为起始原料，浸膏先经过氯仿进行萃取，脱溶后得到浅黄色的粗晶体，再上色谱柱，接收含量70％以上的脱水穿心莲内酯单体组分，浓缩为饱和溶液后，再进行超临界流体抗溶剂结晶。
[0014] 所谓的超临界流体抗溶剂结晶，就是以超临界流体为逆溶剂，其与溶质、溶剂形成的溶液相混合，快速带走溶剂和部分杂质使溶液在较短的时间内形成较高的过饱和度，溶质结晶析出，得到纯度高，粒径分布均匀的微粒。一般选CO2为超临界流体。
[0015] 具体技术方案是：
[0016] 将穿心莲浸膏溶解于温水中，用氯仿进行萃取，萃取液脱溶后上色谱柱，并用混合溶剂洗脱，接收含量90％以上的脱水穿心莲内酯组分，再进行超临界CO2结晶，通过控制压力、温度、时间进行抗溶剂结晶，经2次抗溶剂结晶后，可制得99％上的脱水穿心莲内酯高纯品。
[0017] 具体操作步骤是：
[0018] (1)首先将穿心莲浸膏溶解到10-20倍体积的30～50℃的温水中，选择氯仿进行溶剂萃取至少2次；
[0019] (2)将萃取液合并、脱溶后，进行色谱柱层析分离，分离介质(固定相)选自硅胶等，流动相选自石油醚与乙酸乙酯的混合液，进行分段收集流份，主要收集含量90％以上的目标物质流份；
[0020] (3)将上述收集到的流分浓缩成饱和溶液后，进行超临界CO2抗溶剂结晶，控制在压力8～15MPa，温度在40～65℃，时间在45～90min；
[0021] (4)停机后收集首次抗溶剂结晶产物，产品纯度达97％左右；
[0022] (5)上述结晶产物再配成饱和丙酮溶液，抗溶剂结晶1次，可制得纯度99％以上脱水穿心莲内酯。
[0023] 本发明为相关企业提供一种集成溶剂萃取-柱层析分离-超临界流体(CO2)抗溶剂结晶纯化的方法，制备纯度达99％以上的脱水穿心莲内酯。超临界CO2抗溶剂结晶不但具有传统的细化微粒的效果，同时具有脱除溶剂和萃取微量杂质等功能，从而达到结晶纯化效果；结晶析出脱水穿心莲内酯的结晶条件要求低，一般压力小于15MPa，温度65℃以下，所析晶体纯度高，可达到99％以上，适合高纯物质的制备。本法工艺简单，无需冷冻干燥或喷雾干燥等复杂耗能工艺。同时其得率也较传统工艺高，脱水穿心莲内酯纯度超过99％，收率≥30％(以浸膏中脱水穿心莲内酯计)，适合批量生产。穿心莲浸膏产品目前市场饱和，价格便宜，运输方便。既可提高分离纯化生产效率，又可降低层析柱的污染。四、具体实施方式
[0024] 实施例1：
[0025] (1)称取1kg穿心莲浸膏(脱水穿心莲内酯含量10％以上)，按1∶20(W/V)的固液比溶于30℃温水中，再用氯仿萃取2次；
[0026] (2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(30％∶70％～60％∶40％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集90％以上的脱水穿心莲内酯流份；
[0027] (3)将上述流份合并、浓缩成饱和溶液(至有微量晶体析出)，冷却到40～50℃左右，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在9MPa，温度在60℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶；
[0028] (4)在超临界状态下结晶70min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
[0029] (5)将上述结晶产物用45℃左右丙酮溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
[0030] (6)试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯脱水穿心莲内酯30.3g。
[0031] 实施例2：
[0032] (1)称取1kg穿心莲浸膏(脱水穿心莲内酯含量10％以上)，按1∶15(W/V)的固液比溶于40℃温水中，再用氯仿萃取2次；
[0033] (2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(30％∶70％～60％∶40％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检测定位，收集90％以上的脱水穿心莲内酯流份；
[0034] (3)将上述流份合并、浓缩成饱和溶液(至有微量晶体析出)，冷却到45℃左右，再放置于超临界CO2结晶釜中，结晶压力控制在15MPa，温度在45℃，进行超临界CO2抗溶剂结晶；
[0035] (4)在超临界状态下结晶60min，停机后取出结晶产物，进行含量检测，产品纯度在97％以上；
[0036] (5)将上述结晶产物用45℃左右丙酮溶剂配成饱和溶液，再进行超临界状态下抗溶剂结晶；
[0037] (6)试验结束后，取样检测，可得到99％以上高纯脱水穿心莲内酯31.1g。
[0038] 实施例3：
[0039] (1)称取1kg穿心莲浸膏(脱水穿心莲内酯含量10％以上)，按1∶10(W/V)的固液比溶于50℃温水中，再用氯仿萃取2次；
[0040] (2)将氯仿萃取溶液合并、真空脱溶得到固体粉末，将粉末转移到硅胶色谱柱中，用石油醚与乙酸乙酯(30％∶70％～60％∶40％，V/V)流动相洗脱，以紫外检测器在线检
