一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B及其制备方法

摘要

本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B及其制备方法。本发明在前期研究的基础上，从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷B，该成分的结构不同于上述木脂素类成分，为一种新的裂环木脂素类成分，其分子结构式如下：上述的5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B的制备是以三角叶荨麻为原料，5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B对抑制5α-还原酶作用研究发现具有较强活性，是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。

权利要求

1.一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B，其特征在于，其分子结构式如下：。

2.权利要求1所述的一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B的制备方法，其特征在于，该方法是以三角叶荨麻为原料，步骤如下：(1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；

(2)将醇提取物用50-90℃的水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；

(3)正丁醇萃取物经大孔树脂D101分离，采用质量浓度为30％的乙醇洗脱，收集洗脱液；

(4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿∶甲醇＝30∶1、10∶1、

5∶1、3∶1、1∶1的梯度洗脱，收集洗脱液；

(5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇∶水＝3∶7的溶液洗脱，每15-30ml收集成1份，收集第25-30份洗脱液，合并浓缩后得到荨麻裂环木脂素苷B。

说明书

一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B及其制备方

法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B及其制备方法。

背景技术

[0002] 荨麻属植物中含有大量的木脂素类成分，从中鉴定出了13个木脂素类化合物：(+)-新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、异落叶松脂素、松醋醇、3，4-二香草基四氢吠喃、新橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、9-乙酰基-新橄榄树脂素、9-乙酰基-新橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、9，9’-二乙酰基-新橄榄树脂素、9，9’-二乙酰基-新橄揽树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-开环异落叶松脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-开环异落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、新橄榄树脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷。其结构类型主要有新橄榄树脂素及其苷类和开环落叶松脂素、落叶松脂素及其苷类，其中新橄榄树脂素及其苷类结构如下：

[0003]

[0004] 新橄榄树脂素 新橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷

[0005]

[0006] 新橄榄树脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷 9-乙酰基-新橄榄树脂素[0007]

[0008] 9，9`-二乙酰基-新橄榄树脂素、9-乙酰基-新橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷[0009]

[0010] 9，9`-二乙酰基一新橄揽树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷 橄榄脂素[0011] 开环落叶松脂素、落叶松脂素及其苷类结构如下：

[0012]

[0013] (-)-开环异落叶松脂素 (-)-开环异落叶松脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷

[0014]

[0015] (一)-开环异落叶松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷 5-甲氧基开环异落叶松脂素

[0016]

[0017] 异落叶松脂素

[0018] 有研究表明从大荨麻根中分离到(+)-新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、脱氢二松柏醇、异落叶松脂素、松脂醇和3，4-二香草基四氢呋喃，并检验了以上几种物质体外与SBHG的亲和作用，结果除松脂醇外，其余化合物都有亲合力，其中3，4-二香草基四氢呋喃的亲合作用最强，浓度为250μg/ml时抑制率为95％。提示大荨麻根中木脂素类是治疗BPH的活性成分之一。

[0019] 本课题组曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗前列腺增生的生物活性筛选，结果表明滇藏荨麻根的20％和95％乙醇提取物能显著地抑制前列腺增生大鼠的病变组织。

发明内容

[0020] 本发明的目的是在前期研究的基础上，为了进一步研究提取物抗前列腺增生的活性部位和作用机理，选取前列腺组织中一个关键酶-5α-还原酶为作用靶点，采用酶联免疫(Enzyme-linked immunospecific assay ELISA)的方法，建立抑制5α-还原酶体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5α-还原酶，与底物睾酮以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体系，利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量，以DHT的含量来判断荨麻提取物是否有抑制5α-还原酶的活性。

[0021] 本发明从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷B，该成分的结构不同于上述木脂素类成分，为一种新的裂环木脂素类成分，对抑制5α-还原酶作用研究发现具有较强活性，是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。

[0022] 本发明的技术方案是：一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B，其分子结构式如下：

[0023]

[0024] 上述5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷B的制备方法是以三角叶荨麻为原料，制备步骤如下：

[0025] (1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；

[0026] (2)将醇提取物用50-90℃的水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；

[0027] (3)正丁醇萃取物经大孔树脂D101分离，采用质量浓度为30％的乙醇洗脱，收集洗脱液；

[0028] (4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿∶甲醇＝30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1的梯度洗脱，收集洗脱液；

[0029] (5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇∶水＝3∶7的溶液洗脱，每15-30ml收集成1份，收集第25-30份洗脱液，合并浓缩后得到荨麻裂环木脂素苷B。

[0030] 采用核磁共振(NMR)等波谱技术测定其结构，荨麻裂环木脂素苷B的波谱数据见表1。

[0031] 表1.荨麻裂环木脂素苷B的1HNMR和13CNMR

[0032]

[0033] 荨麻裂环木脂素苷B可以用于制备抗前列腺增生药物，将有效剂量的荨麻裂环木脂素苷B与药用载体混合并制成适当剂型的药物。

[0034] 本发明的有益效果是：原料为纯天然植物根，安全易得，方法简单易操作，不引入有毒物质，成本低廉，在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。

具体实施方式

[0035] 下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。

[0036] 实施例1

[0037] 三角叶荨麻药材采集自四川省阿巴州。

[0038] 从三角叶荨麻中制备荨麻裂环木脂苷B方法步骤如下：

[0039] (1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，料液比(kg/l)＝1∶8，提取温度90℃，提取时间3h，提取次数3次，合并提取液，过滤后减压浓缩至无醇味；

[0040] (2)将醇提物200g用2L温度为70℃的热水混悬，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次。

[0041] (3)正丁醇萃取物30g经D101大孔树脂(1kg)分离，采用质量浓度为30％的乙醇洗脱，收集洗脱液10L；

[0042] (4)乙醇洗脱物浓缩至干得5g，用硅胶柱色谱(硅胶150g)分离纯化，采用体积比为氯仿∶甲醇＝30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1梯度洗脱，收集每个比例洗脱液1L；

[0043] (5)步骤(4)的洗脱液浓缩至干得1g，然后经反相硅胶柱色谱(反相硅胶30g)分离纯化，采用体积比为甲醇∶水＝3∶7的溶液洗脱，每25ml收集成1份，合并第25-30份洗脱液，浓缩后得到荨麻裂环木脂素苷B90mg。

[0044] 实施例2

[0045] 5-α还原酶抑制作用实验步骤如下：

[0046] (1)5-α还原酶的制备：

[0047] 雄性SD大鼠3只，体重200±10g，大连医科大学实验动物中心提供，禁食不禁水过-1夜处死，迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73mol·L ，-1
氯化钙1.91mmol·L )在玻璃匀浆器中匀浆，在4℃下以10000rpm低温高速离心20min，取上清液再以16000rpm低温高速离心30min，即为5α-还原酶提取物。采用lowry法测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5α-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70℃下保存，备用。

[0048] (2)5α-还原酶抑制活性测定：

[0049] 操作分两部分完成，即①将反应成分37℃恒温缓冲液、睾酮、实施例1制备的荨麻裂环木脂苷B样品、阳性对照药、NADPH及酶组织液依次加入96孔板内，使之微量化，设置不同反应孔和对照孔板。反应温度为37℃(相对饱和湿度)，反应时间为60min；

[0050] ②采用EL ISA法定量测定产物DHT，以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时，则视为具有抑制5α-还原酶的活性。检测方法及计算参照睾酮试剂盒(购于Adlitteram Diagnostic Laboratories公司)使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上，辅酶NADPH浓-1 -1
度为1mmol·L ，睾酮浓度为0.5μmol·L ，结合睾酮试剂盒微量测定的特点，将整个反应体系的总量定为200μl。

[0051] 酶反应体系中各组分的原始浓度分别为：缓冲溶液(PBS 20mmol·L-1，蔗糖-1 -1 -1 -10.2mol·L ，EDTANa21mmol·L ，pH6.8)；NADPH浓度(20mmol·L )；粗酶浓度(4.3mg·ml )；
-1 -1
睾酮浓度(20μmol·L )；非那雄胺(1.3mmol·L )。