一种双歧杆菌新菌株及其发酵制备方法与应用

摘要

本发明涉及一种分离自健康肉仔鸡消化道的、可产细菌素或抑菌物质的双歧杆菌BB2，保藏号为CGMCC No.3200。该菌株具有抗逆性强、生长快、发酵液酸度高、生物量大、有抑菌或抗菌活性等优点。本发明还涉及该菌株的大规模发酵培养方法，将发酵液离心回收菌泥，加入保护剂冻干后能够得到活菌数为120～150亿/g的菌剂。本发明的双歧杆菌亚种BB2制剂可以部分替代抗生素，消除药物残留，提高畜禽产品品质；可以提高动物生产性能、提高免疫力或抗病力、降低动物死淘率、减少腹泻率；还可以净化畜舍环境。本发明具有很高的社会效益、经济效益和生态效益。

权利要求

1.双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)BB2，保藏号为CGMCC No.3200。

2.权利要求1所述双歧杆菌BB2的发酵培养方法，其特征在于，按1.5～3.5％的接种量向发酵培养基中接入15～30h菌龄的所述双歧杆菌种子液，发酵条件为：温度25～

40℃，每间隔2～3h搅拌5～10min，转速为100～130rpm，培养10～15h；所述发酵培养基的配制为：葡萄糖0.7～2.1％、大豆蛋白胨0.2～1.0％、胰蛋白胨0.2～1.0％、大豆肽0.3～1.0％、玉米渣0.5～1.5％、柠檬酸铵0.3～1.2％、混合盐溶液0.4％、消泡剂M

0.05～0.1％，pH为6.2～7.4；其中，所述消泡剂M为北京化工集团，型号2118的产品。

3.含有权利要求1所述双歧杆菌BB2的菌剂。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，该菌剂通过如下方法制得：按照权利要求2所述的方法对双歧杆菌BB2进行发酵培养得到发酵菌液，离心收集菌泥，加入保护剂冻干得菌剂。

5.含有权利要求1所述双歧杆菌BB2的饲料添加剂。

6.含有权利要求1所述双歧杆菌BB2的饲料。

7.含有权利要求1所述双歧杆菌BB2的生物兽药。

8.权利要求1所述双歧杆菌BB2、权利要求3所述菌剂、权利要求5所述的饲料添加剂或权利要求6所述的饲料在家禽、牲畜和水产饲养中的应用。

说明书

一种双歧杆菌新菌株及其发酵制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一株新的、可产细菌素或抑菌物质的双歧杆菌亚种菌株，本发明还涉及该菌株的发酵制备方法以及和应用。

背景技术

[0002] 近年来，由于食品安全的需要，微生态制剂的研究和开发得以较快发展，但目前使用的菌种大都为乳酸杆菌、酵母菌和芽胞杆菌，却很少使用双歧杆菌。原因在于：通常双歧杆菌营养要求非常高，生长条件须严格厌氧，高昂的培养成本和严格的生产条件使目前大部分双歧杆菌不能符合研发乃至实际生产的要求。

[0003] 但双歧杆菌在微生态制剂的研究方面仍备受亲睐，除了它具有常见益生菌的生理功能如：促进营养物质吸收利用、生物屏障和生物拮抗作用、免疫调节作用外，还具有一般益生菌所没有的优良特性。国内外有研究表明：双歧杆菌能产生结合胆酸水解酶、抑制内毒素产生(解毒)、产生细菌素和广谱抗菌作用；双歧杆菌具有提高机体抗体水平，促进巨嗜细胞的吞噬能力和消化能力，提高机体抗感染力和预防、杀伤肿瘤细胞的作用；双歧杆菌能通过降低肠道pH值或通过双歧杆菌对有害菌在空间、营养上的屏蔽竞争作用，抑制其在肠道的定植和生长；促进各种矿物质如Ca、Fe、Mg、Zn的吸收利用，降低血清胆固醇和甘油三酯的水平；双歧杆菌还具有消除自由基、羟自由基、过氧脂质以及腐败细菌产生的吲哚、胺、酚类，降低肠道气味等作用，进而可显著改善饲养环境；双歧杆菌能合成维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸和叶酸等多种维生素，补充营养，并能控制内毒素血症；还可以降低亚硝酸盐等有害物质的形成进而改善动物产品品质。以上种种优良特性使其在替代和减少抗生素使用、减少动物疫病的发病率和死亡率、保证畜产品安全绿色和公共健康等方面具有独特的优势。

[0004] 在益生菌的选育方面，国内外众多学者均指出，益生菌必需具备耐酸、耐胆盐及对肠上皮细胞具有粘附性等特点，且菌株最好来源于本种动物，这样更有利于其在肠道中的定植。目前，大多数研究者热衷于动物源的益生菌菌种的筛选工作，但是很少有系统研究已得菌株抗逆性(耐酸、耐胆盐等)、生物学特性(抑菌活性、粘附特性等)、发酵特性和后加工工艺(即制剂)。

[0005] 在畜禽生产中，应用微生物饲料添加剂已有很多研究，也有很好的应用效果，但目前使用菌种主要是乳酸杆菌、芽胞杆菌和酵母等微生物。如张日俊等(2005)给1～6周龄肉仔鸡日粮添加乳酸杆菌、芽胞杆菌和酵母组成的复合微生物饲料添加剂可显著降低鸡空肠和直肠中大肠杆菌数量(p＜0.05)，能显著提高日增重和饲料转化效率(p＜0.05)。国内对双歧杆菌制剂的研究起步较晚，在动物上的应用较少，仅见到一些试验研究报告，特别是在动物科学领域中关于其抗逆性、发酵特性、产品制剂的应用效果以及对畜产品品质的影响报道较少。

发明内容

[0006] 本发明的第一个目的在于提供一株短双歧杆菌新菌株BB2。

[0007] 本发明的第二个目的在于提供短双歧杆菌BB2的发酵方法。

[0008] 本发明的第三个目的在于提供短双歧杆菌冻干制剂在畜禽生产上的用途。

[0009] 为实现上述目的，本发明首先提供一株短双歧杆菌新菌株BB2，其具有对逆环境耐受性强、粘附性强、生长快、发酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等优点。

[0010] 本发明从鸡肠道中分离、经定向初筛和复筛得到一株双歧杆菌。其细胞形状呈短棒状，在改良PTYG培养基上，菌落为针尖大小浅乳白色圆形凸起，革兰氏染色阳性；不生孢子，无鞭毛，不运动；兼性厌氧；不需要营养极其丰富的培养基；发酵分解糖代谢，乙酸、乳酸物质的量之比近3∶2；接触酶阴性，生长温度25-39℃。菌株BB2通过法国生物梅里埃公司API 20A微生物鉴定系统鉴定97.1％(该系统中，待鉴定的菌种特征与某已知菌种的符合率＞95％时为高鉴别准确率)为短双歧杆菌BifidobacteriumBreve2。BB2生化特征和形态特征以及API 20A鉴定结果分别见表1和表2。

[0011] 表1BB2生化特征及形态特征

[0012]

[0013] 表2BB2的API 20A鉴定结果

[0014]

[0015] 利用改良PTYG液体培养基(具体配方见后部分的发酵方法)，用通用常规方法对鸡源短双歧杆菌BB2进行了耐酸、耐胆汁酸盐、耐胃蛋白酶试验、发酵试验和抑菌活性测定[1，2，3，4]。BB2对不同酸度耐受存活率及多重比较结果见表3，BB2耐胆酸盐、耐胃蛋白酶及其生长曲线和发酵特性分别见图1～4。

[0016] 表3BB2对不同酸度耐受存活率、活菌数及多重比较

[0017]

[0018]

[0019] 注：数据右侧含有不同小写字母(a，b，c，d，e，f)的表示差异显著(p＜0.05)，含有不同大写字母(A，B，C，D，E，F)的数据表示差异极显著(p＜0.01)

[0020] 从表3可见，酸度越低，BB2活菌数下降越大。在pH2.5～pH3.5环境下，处理8
120min，存活率在80％左右(处理前活菌数5.65×10CFU/mL)，表明BB2具有良好的耐酸[5]
性。该结果好于王建业等(2000) pH3.5条件下保温2h其存活率在40％以上的结果。即使
8
在pH1.5条件下，处理120min，BB2的存活率降低到42.22％，其活菌数仍高达2.4×10CFU/
8
mL(处理前活菌数5.65×10CFU/mL)，因而仍然能够保证有足够多的BB2活菌通过胃部进入肠道。

[0021] 胆酸盐耐受试验中，接种后培养基中的初始活菌数是6.8×106CFU/mL。从图1可见，培养基中的活菌数随着胆酸盐浓度的增加而逐渐降低。当牛胆酸盐浓度在0～2.0mg/mL时，BB2活菌数较初始值均有不同程度的增加，1mg/mL时的活菌数增加了12倍多。可见，BB2具有良好的耐胆盐特性。

[0022] 耐胃蛋白酶试验结果如图2。在含胃蛋白酶2.5，5，7.5mg/mL的改良PTYG液体培养基中作用2h后，存活率分别为81.82％，72.12％和43.64％；当浓度为10mg/mL时，骤降至7 8
3.03％，但是各试验组活菌数均在10CFU/mL(处理前活菌数4.13×10CFU/mL)以上，5mg/
8
mL胃蛋白酶作用2h后，BB2的活菌数仍高达2.975×10CFU/mL，说明BB2具有良好的耐胃蛋白酶特性。

[0023] 图3为BB2的生长曲线图。550nm和600nm波长下的吸光值(该指标反映了BB2发酵时的生物量或总菌量)以及活菌数是双歧杆菌生长情况常用检测指标。由图3可见，BB2生长没有明显的迟滞期，从接种开始便有一定幅度的增长，从2h即进入对数生长期，直8
到4h达到最大生长量，然后进入平台期，最大活菌数达到5×10CFU/mL(对数值为8.7)，与其他种属双歧杆菌相比表现出生长快和生物量大的优点。

[0024] 在改良PTYG液体培养基中发酵0～15h的pH、葡萄糖消耗量、乳酸产量和对白痢沙门抑菌活性的变化规律见图4。可见，发酵液pH在2h后迅速下降，在6h末已由初始的6.76下降为4.09，之后略有下降，9h后稳定在3.6～3.7之间；乳酸的产量从2h～10h有较大幅度增加，之后稳定在18.6mmol/L，因此具有发酵液酸度高的优点；BB2对鸡白痢沙门耐药菌株的抑菌效果0～5h略有增加，5h后迅速增加直到9h末，之后进入平稳期，其最大抑菌圈直径为15.9mm，具有强抑菌能力。

[0025] 抑菌特性研究表明，BB2的抑菌活性与菌体生物量成正相关，相关系数R2为2
0.6635，乳酸产量和抑菌活性存在很强的相关性(相关系数R 为0.9505)。使用150μl的发酵上清液(乳酸含量为18.64mmol/L)以及150μlpH3.5的乳酸(生理盐水稀释)进行抑菌实验，指示菌为白痢沙门氏菌[(S.pullorum CVCC79301)G-，中国兽医药品监察所菌种保藏中心]。结果如图5和图6所示，BB2的上清液能产生(15.90±0.36mm)的抑菌圈，而乳酸仅能产生较小而模糊的抑菌圈。这表明，BB2抑菌活性主要是抗菌活性物质作用的结果，而不是乳酸。

[0026] BB2对于常见病原菌及动物肠道常见菌的抑菌范围测试结果见表4，结果显示，BB2对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌等有抑菌表现，是一具有广谱抑菌活性的优秀菌株。

[0027] 表4BB2的抑菌谱

[0028]

[0029]

[0030] 由上述可见，本发明短双歧杆菌BB2具有对逆环境耐受性强、生长快、发酵液酸度高、生物量大、有良好的抑菌活性等众多优点。

[0031] BB2的粘附特性是通过以下途径实现的：

[0032] 取间歇搅拌培养10-15h的短双歧杆菌发酵液分别作稀释或浓缩等不同处理，以植物乳杆菌、粪肠球菌和乳酸乳球菌为对照进行培养和粘附试验。

[0033] 细胞培养：采用人结肠癌细胞Caco-2细胞(人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞株，ATCC HTB-37，美国ATCC全球生物资源中心)，Caco-2细胞具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接。使用DMEM高糖细胞培养液(商用培养基)，在37℃、5％CO2～95％空气的二氧化碳细胞培养箱中恒温孵育，待细胞生长至铺满板面约80％用0.25％Trypsin/6
EDTA消化液消化，以10/mL传代，每2d更换培养液。

[0034] 在6孔细胞培养板(corning)中放入洗净无菌的盖玻片，每孔接入1mL调整好浓度的细胞悬液，每2～4d更换培养液，以无菌PBS洗涤3次，每孔加入1～2mL的BB2各种处理液与1～2mL的DMEM细胞培养液(商用培养基)的混合液，37～40℃，5％CO2～95％空气中孵育30～180min。取出盖玻片用无菌PBS洗涤三次，再用甲醇固定8～13min，革兰氏染色，显微镜下随机挑选20个视野，计数50个细胞上粘附的细菌数，每个处理作3个重复。BB2疏水性及时间、浓度对BB2粘附的影响见表5～7。

[0035] 表5不同菌株疏水性测定结果的比较

[0036]

[0037] 注：数字右侧标不同字母(a、b)表示差异显著(P＜0.05)

[0038] 表5说明，BB2和植物乳杆菌的疏水性显著好于粪肠球菌和乳酸乳球菌。

[0039] 表6BB与Caco-2细胞作用不同时间的粘附性

[0040]

[0041] 注：数字右侧标不同字母(A、B、C)表示差异极显著(P＜0.01)

[0042] 表6说明，BB2菌的随着与Caco-2细胞作用时间的增加，其粘附性极显著增加，表明其具有极好的粘附性。

[0043] 表7不同浓度BB2发酵液对Caco-2细胞粘附的影响

[0044]

[0045] 注：数字右侧标不同字母(A、B、C、D)表示差异极显著(P＜0.01)

[0046] 表7说明，随着BB2菌浓度的增加，BB2菌对Caco-2细胞的粘附性极显著增加，表明其具有极好的粘附性，且与浓度相关。

[0047] 疏水性是决定细菌非特异性粘附到各种生物和非生物表面及界面的最重要动力之一。一般而言，疏水性强的菌株对肠上皮细胞有着较强的粘附力。从表5可看出，BB2与植物乳杆菌的疏水性较高且无显著差异，而显著高于粪肠球菌和乳酸乳球菌，表明BB2的粘附力最强，其次为植物乳杆菌。从表6和表7可看出，BB2的粘附特性对孵育时间和菌液浓度有依赖性。

[0048] 传统观点认为只有活菌才有粘附能力，但BB2菌于100℃水浴10min后粘附数与不处理组相比没有显著差异，而65℃水浴30min后粘附数与100℃水浴10min在统计学上也没有显著差异，这说明100℃灭活的BB2虽无活性，但菌体上的粘附位点活性仍然存在。BB2经紫外线照射30min后对Caco-2细胞的粘附数与未照射相比无显著差异，说明紫外线照射灭活对BB2的粘附性能无明显影响，也说明在其发酵液中可能存在着一种粘附物质。

[0049] 由此可见，BB2具有很强的肠道粘附特性，并且这种粘附性能不受高温和紫外线影响。

[0050] BB2的安全性是通过以下途径实现的：

[0051] 用小鼠和AA肉鸡作为模型动物，来试验BB2的安全性。准备18～22g小鼠40只，公母各半，随机分为四个处理组，每组10只，驯养7天后，采用腹腔注射的方式进行攻毒试验，试验期21天。试验分为4个处理组，对照组注射生理盐水1ml，B组注射BB2发酵液8 7
(10CFU/mL)1mL，C组注射大肠杆菌(10/mL)1mL，D组注射0.5mL的BB2的发酵液和0.5mL的大肠杆菌。灌服后观察其中毒症状，看是否出现呼吸困难、抽搐、肢体麻痹等。准备80只AA肉鸡，随机分为四组，每组20只，育雏一周后在饲料中拌入BB2发酵液和/或大肠杆菌发酵液，浓度和各组处理同上。小鼠和肉鸡安全性试验结果见表8和表9。

[0052] 表8BB2对小鼠的安全性试验结果

[0053]

[0054]

[0055] 表9BB2对肉鸡的安全性试验结果

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[0057] 从表8和表9可明显看出，BB2对于小鼠和肉鸡是安全的，所有受试小鼠和肉鸡均健活；D组的情况总体好于C组。从各组随机选取5只小鼠、5只肉鸡进行解剖，B组与对照组相比，各脏器未见异样，D组脏器病变明显弱于C组。由此可见BB2能缓解大肠杆菌给小鼠和肉鸡带来的不良影响，一定程度上减少了死亡率。

[0058] 综上所述，一系列试验证明BB2具有对逆性环境(不良生存环境)耐受性强、粘附性强、生长快、发酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等众多优点，并且对小鼠、肉鸡等无任何毒害作用，有极高的应用价值。该鸡源短双歧杆菌BB2已于2009年7月22日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，其建议分类命名为双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)，保藏号为CGMCC No.3200。

[0059] 本发明还提供短双歧杆菌BB2的发酵方法。

[0060] 发酵培养基配制为：葡萄糖0.7～2.1％、大豆蛋白胨0.2～1.0％、胰蛋白胨0.2～1.0％、大豆肽0.3～1.0％、玉米渣0.5～1.5％、柠檬酸铵0.3～1.2％、混合盐溶液0.4％(无水CaCl2 0.2g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.48g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g，蒸馏水1000mL。)、消泡剂M 0.05～0.1％，pH为6.2～7.4。经121℃高温蒸汽消毒20～30min，降温至25～40℃时，向其中接种菌龄15～30h的种子液1.5～3.5％
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(v/v，种子液含菌量为10CFU/mL)，在25～40℃温度下，每间隔2～3h进行100～130rpm搅拌，持续5～10min。接种10～15h为发酵终点，可放罐。

[0061] 将BB2发酵液，经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂。

[0062] 将本发明短双歧杆菌BB2应用于肉鸡蛋鸡生产，结果表明，其能明显促进和刺激胃肠道中有益菌的生长；并能显著抑制大肠杆菌和其他一些好氧菌(如沙门氏菌)的生长繁殖，极显著降低了腹泻率、同时它的使用显著提高了动物生产性能、改善了畜舍环境和水产动物水质，提高了动物免疫力或抗病力。因此可将本发明菌株或其发酵液制成菌剂用于家禽、牲畜以及水产的饲养，例如单独或与适当的其它成分制成饲料添加剂，或者是直接添加到饲料中制成含有该成分的饲料，来提高生产能力。也可以将本发明菌株或其发酵液制成生物兽药部分代替抗生素提高动物的抗病力。因此本发明具有很高的社会效益、经济效益和生态效益。

[0063] 本申请中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100mL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃(常温)时容量的比例。

[0064] 本发明提供的短双歧杆菌BB2，具有对逆环境耐受性强、生长快、发酵液酸度高、生物量大、有抑菌活性等优点。本发明提供的发酵方法适合BB2的大规模培养。本发明短双歧杆菌制剂可以部分替代抗生素，消除药物残留，提高畜禽产品品质；可以提高动物生产性能、提高免疫力或抗病力、降低动物死淘率、减少腹泻率；还可以净化畜舍环境。本发明具有很高的社会效益、经济效益和生态效益。

[0065] 说明书附图

[0066] 图1显示的是不同浓度胆盐对BB2的影响；

[0067] 图2显示的是不同浓度胃蛋白酶对BB2的影响；

[0068] 图3显示的是BB2生长曲线；

[0069] 图4显示的是BB20～15h发酵特性变化曲线；

[0070] 图5显示的是BB2发酵液上清液对鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用；

[0071] 图6显示的pH乳酸对鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用。

具体实施方式

[0072] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0073] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0074] 实施例1 发酵方法A1

[0075] 用葡萄糖0.7％、大豆蛋白胨0.6％、胰蛋白胨0.4％、大豆肽0.3％、玉米渣1.2％、柠檬酸铵0.5％(以上均为质量体积比m/V)、混合盐溶液0.4％(V/V)、消泡剂M 0.05％(V/V)(北京化工集团，型号2118)按比例配制成发酵培养剂。经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至37℃时，向其中接种菌龄15h的种子液1.5％，在35℃温度下，每间隔2～3h进行100rpm搅拌，持续10min。接种15h为发酵终点，可放罐，得到短双歧杆菌BB2活菌数为
8
4.76×10CFU/mL。

[0076] 经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂，活菌数约为125亿/g。

[0077] 其中，所述的混合盐溶液的成分为：CaCl2 0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g，加蒸馏水定容至1000mL，混匀。

[0078] 实施例2 发酵方法A2

[0079] 用葡萄糖1.2％、大豆蛋白胨0.3％、胰蛋白胨0.7％、大豆肽0.5％、玉米渣1.0％、柠檬酸铵0.6％(以上均为质量体积比m/V)、加入实施例1所用的混合盐溶液0.5％(V/V)、消泡剂M 0.05％(V/V)按比例配制成发酵培养剂。经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至37℃时，向其中接种菌龄25h的种子液2.5％，在35℃温度下，每间隔2～3h进行100rpm搅
8
拌，持续10min。接种15h为发酵终点，可放罐，得到短双歧杆菌BB2活菌数为5.19×10CFU/mL。

[0080] 经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂，活菌数约为131亿/g。

[0081] 实施例3 发酵方法A3

[0082] 用葡萄糖1.5％、大豆蛋白胨0.5％、胰蛋白胨0.7％、大豆肽0.4％、玉米渣0.6％、柠檬酸铵0.8％(以上均为质量体积比m/V)、加入实施例1所用的混合盐溶液0.3％(V/V)、消泡剂M0.05％(V/V)按比例配制成发酵培养剂。经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至37℃时，向其中接种菌龄12h的种子液2.0％，在35℃温度下，每间隔2～3h进行120rpm搅
8
拌，持续10min。接种14h为发酵终点，可放罐，得到短双歧杆菌BB2活菌数为6.47×10CFU/mL。

[0083] 经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂，活菌数约为150亿/g。

[0084] 实施例4 发酵方法A4

[0085] 用葡萄糖2.1％、大豆蛋白胨0.2％、胰蛋白胨1.0％、大豆肽1.0％、玉米渣0.5％、柠檬酸铵0.3％(以上均为质量体积比m/V)、加入实施例1所用的混合盐溶液0.45％(V/V)、消泡剂M 0.05％(V/V)按比例配制成发酵培养剂。经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至37℃时，向其中接种菌龄12h的种子液2.0％，在35℃温度下，每间隔2～3h进行130rpm搅
8
拌，持续5min。接种14h为发酵终点，可放罐，得到短双歧杆菌BB2活菌数为6.23×10CFU/mL。

[0086] 经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂，活菌数约为146亿/g。

[0087] 实施例5 发酵方法A5

[0088] 用葡萄糖1.8％、大豆蛋白胨1.0％、胰蛋白胨0.2％、大豆肽0.5％、玉米渣1.5％、柠檬酸铵1.2％(以上均为质量体积比m/V)、加入实施例1所用的混合盐溶液0.35％(V/V)、消泡剂M 0.05％(V/V)按比例配制成发酵培养剂。经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至37℃时，向其中接种菌龄12h的种子液2.0％，在35℃温度下，每间隔2～3h进行110rpm搅
8
拌，持续10min。接种14h为发酵终点，可放罐，得到短双歧杆菌BB2活菌数为5.81×10CFU/mL。

[0089] 经离心收集菌泥加入冷冻干燥保护剂(水苏糖1.8％、谷氨酸钠0.3％、半乳糖0.6％、脱脂奶粉12％)，再经冷冻干燥即得短双歧杆菌BB2菌剂，活菌数约为139亿/g。

[0090] 实施例6 双歧杆菌制剂在蛋鸡生产中的应用

[0091] 选用349～377日龄的海兰灰蛋鸡600羽，分为两个处理组：空白对照组不添加任何成分；试验组添加0.1％的本发明实施例2短双歧杆菌BB2制剂。每个处理6个重复，每个重复50只鸡。饲养后屠宰，观察分析蛋鸡肠道不同肠段双歧杆菌和乳酸菌总量、大肠杆菌和总好氧菌的变化情况。试验结果列于表12。

[0092] 表12蛋鸡肠道菌群分离计数结果[log10(菌数CFU/g内容物)]

[0093]

[0094] 注：同行样品间凡标有不同大写字母者为差异极显著(p＜0.01)；同行样品间凡标有不同小写字母者为差异达显著水平(p＜0.05)。

[0095] 从表12可以看出：添加0.1％活性双歧杆菌制剂，嗉囊中的双歧和乳酸数量总和比空白对照组增加了10倍以上，其他部位的双歧杆菌和乳酸菌数量总和也显著高于空白对照组，大肠杆菌和总好氧菌数量也显著下降而得到抑制。

[0096] 实施例7 双歧杆菌制剂在肉鸡生产中的应用

[0097] 选用1～28日龄公母混养的AA肉鸡300只，随机分成3个处理，即空白对照组、抗生素对照组(金霉素100g/t)和0.15％本发明实施例3双歧杆菌制剂，每个处理100只。育雏1周后，每个处理分成5个重复，每个重复20只。饲养后屠宰，观察分析肉鸡肠道内不同肠段双歧、乳酸总和、大肠杆菌、沙门氏菌和好氧菌总数的变化情况(即菌相变化)。试验结果列于表13。

[0098] 表13肉鸡肠道菌群分离计数结果[log10(菌数CFU/g内容物)]

[0099]

[0100]

[0101] 注：同行样品间凡标有不同大写字母者为差异极显著(p＜0.01)；同行样品间凡标有不同小写字母者为差异达显著水平(p＜0.05)。

[0102] 从表13可以看出，添加本发明的双歧杆菌制剂可以使回肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量比空白对照组增加10倍以上，并降低了大肠杆菌和沙门氏菌的浓度10倍以上，其他部位也有类似结果。同时，添加0.15％双歧杆菌制剂组的腹泻率极显著低于空白对照组和抗生素对照组(p＜0.01)。

[0103] 试验结果表明，本发明提供的双歧杆菌制剂应用于肉鸡蛋鸡生产时能明显促进和刺激胃肠道中有益菌的生长；并能显著抑制大肠杆菌和其他一些好氧菌(如沙门氏菌)的生长繁殖，调节肠道菌群平衡，提高肉鸡抗病力，腹泻率极显著下降。

[0104] 实施例8 双歧杆菌制剂对蛋鸡生产性能、蛋品质、死淘率和抗体水平的影响[0105] 用日龄相同的产蛋后期海兰蛋鸡9000只，分三组，每幢一组3000只，分3个重复，每个重复1000只。分组情况如下：

[0106] A组，空白对照组，饲喂蛋鸡基础日粮；B组，在蛋鸡基础日粮中添加抗生素，80g/t；C组，在蛋鸡基础日粮中添加双歧杆菌制剂0.18％。

[0107] 前7天为预试期，后28天为试验期，并按上述分组重复试验3次，测定鸡舍内NH3、H2S浓度、鸡蛋破损率、哈夫单位、产蛋率、蛋重、死淘率、蛋壳光洁度、抗体水平等指标。结果列于表14。

[0108] 表14对蛋鸡生产性能、蛋品质、死淘率的影响

[0109]

[0110] 注：蛋壳光洁度用+的多少表示，越多代表光洁度越好。

[0111] 从表14可以看出，虽然添加了双歧杆菌制剂一组的蛋重、产蛋率等指标不如抗生素组好，但却显著降低了鸡舍的氨气、硫化氢等有害气体、降低死淘率、抗体水平也得到了较大的提高，有着良好的经济效益和生态效益，同时解决了药物残留问题，提高了食品的安全性。

[0112] 实施例9 双歧杆菌制剂在仔猪、肉仔鸡和草鱼养殖中的应用效果

[0113] 使用实施例4中的菌剂，分别应用于仔猪、肉仔鸡以及草鱼的养殖，均设为空白对照组、抗生素组和BB2实验组，每组3个重复。其中，空白对照组饲喂基础日粮；抗生素组在基础日粮中添加金霉素(80g/t)；BB2实验组添加实施例4的菌剂，具体添加量如表15所示。

[0114] 表15双歧杆菌制剂在仔猪、肉仔鸡和草鱼养殖中的应用效果

[0115]

[0116]

[0117] 从表15可以看出，在仔猪，肉仔鸡和育成期草鱼日粮中添加本发明的双歧杆菌制剂，各项指标均明显好于抗生素对照组和空白对照组。说明本发明提供的双歧杆菌制剂能有效防治畜禽和水产动物疾病、显著提高生产性能、改善畜舍环境和水产动物水质，说明其具有良好的经济效益和生态效益。

[0118] 实施例10 双歧杆菌制剂对肉仔鸡免疫力(包括细胞免疫和体液免疫)的影响[0119] 试验选用AA肉鸡1日龄300羽，分3组，每组100只肉鸡，分5个重复，每个重复20只鸡，喂以3种不同的日粮，即A组为空白对照组，B组为抗生素组，C组为添加双歧杆菌制剂0.15％组。分别在7日龄和14日龄注射牛血清白蛋白抗原，以备检测免疫学指标。试验期7周，3周龄时检测淋巴细胞增殖活力、牛血清白蛋白抗体水平，结果见表16和表17。

[0120] 表16双歧杆菌制剂对鸡血淋巴细胞增殖活力(细胞免疫)的影响

[0121]

[0122] 表17双歧杆菌制剂对鸡血牛血清白蛋白抗体滴度(体液免疫)的影响

[0123]

[0124] 从表16、表17可以看出，本发明提供的双歧杆菌制剂添加到饲料中可以明显增强T细胞活力，也可以明显增强抗体滴度水平。说明本发明提供的双歧杆菌制剂可明显提高动物的细胞免疫功能和体液免疫功能。

[0125] 参考文献：

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