矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物

摘要

本发明提供了基于使用4-苯基-2-丙酰氨基四氢萘(4-P-PDOT)及其类似物、衍生物、前药、前体及其盐的用于治疗骨吸收和骨形成失调的化合物、方法、应用、组合物、试剂盒和包装。

权利要求

1.(i)4-P-PDOT、(ii)(i)的药学上可接受的盐、或(iii)(i)和(ii)的任何组合在制备用于矫正或预防对象骨矿化缺陷的试剂盒或组合物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒或组合物用于矫正对象骨吸收和骨形成失调。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组合物是骨靶向性组合物。

4.如权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒或组合物还包括选自如下一组的另一种药物：二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。

5.如权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物是用于矫正骨吸收和骨形成失调的药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物用于矫正骨质疏松、佩吉特病、溶骨性骨癌或以存在可诱导破骨细胞的炎性细胞因子为特征的关节炎中的骨吸收和骨形成失调。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述骨吸收和骨形成失调的矫正包括如下的至少一种：骨吸收的抑制；破骨细胞分化的抑制；骨矿物质密度(BMD)的增加；骨矿物质含量(BMC)的升高；纯皮质骨密度的增加；总骨平均密度的增加；骨皮质厚度的增加；被称为骨皮质的纯皮质区域的增加；胫骨骨干总骨面积的增加；矿化沉积速率的升高；骨形成率/骨表面指示物的升高；内皮质或骨膜表面的矿化表面的增加；血清碱性磷酸酶的降低；

低矿化类骨质的皮质内区的减少；类骨质厚度的降低和类骨质密度的降低。

说明书

矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 按照35U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求2007年2月15日提交的美国临时专利申请号60/890,100、2007年4月17日提交的美国临时专利申请号60/912,267、2007年5月1日提交的美国临时专利申请号60/915,196和2007年5月15日提交的美国临时专利申请号60/938,025的优先权。本文已将上述文件的内容完整纳入作为参考。发明领域

[0003] 本发明涉及矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物。

[0004] 发明背景

[0005] 骨一直处于持续的重塑过程中，这个过程包括旧骨的破坏和新骨的重建。这种吸收(由破骨细胞执行)和形成(由成骨细胞执行)以几乎相同的速度进行，因而可以维持整个骨骼的强度。骨重塑可使骨实质实现自我更新，骨重塑受多种激素和生长因子的影响。实验证明褪黑素可通过其对成骨细胞的作用来刺激骨的形成。

[0006] 世界卫生组织(WHO)将妇女的骨质疏松定义为骨矿物质密度低于骨峰值(性别相配的20岁健康个体的平均值)2.5个标准差，测量方法为双能量X射线吸收测定术(DXA)；术语“确诊的骨质疏松”包括存在脆性骨折。

[0007] 有两种类型的骨质疏松：(1)原发性骨质疏松-由于正常老化而引起的骨质疏松，最常见于绝经后的女性，以及(2)继发性骨质疏松-由其他因素如慢性疾病、营养不良或某些类型的药物引起的骨质疏松。

[0008] 到目前为止，美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准了几种药物用于预防和治疗骨质疏松，这些药物被作为一线药物。这些药物包括二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂(nasal calcitonin)和特立帕肽。

[0009] 虽然现在已经有了治疗措施(例如二膦酸盐)，但是预防依然被认为是降低骨折最有效的措施。

[0010] 相应的，我们依然需要寻找新的预防和/或治疗骨疾病如骨质疏松的方法。

[0011] 本说明书参考了多个文件，其内容已完整纳入作为参考

[0012] 发明概述

[0013] 本发明涉及矫正骨吸收和骨形成失调的方法及其试剂盒和组合物。

[0014] 更具体地说，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种方法，该方法包括：(a)确定对象患有骨吸收和骨形成失调；以及(b)给予所述对象治疗有效量的(i)4-苯基-2-丙酰氨基四氢萘(4-P-PDOT)；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物(conjugate)或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；或者(iv)(i)到(iii)的任意组合，从而所述对象的骨吸收和骨形成失调被矫正。

[0015] 在一个实施方式中，上述方法包括给予所述对象有效量的(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的药学上可接受的盐；或者(iii)(i)和(ii)的任意组合。

[0016] 在一个实施方式中，上述给药是一次性团注给药。在另一实施方式中，上述给药是每日给药。

[0017] 在一个实施方式中，上述治疗有效量为约0.001-500mg/对象公斤体重/天。

[0018] 在一个实施方式中，上述方法还包括给予选自如下一组的另一种药物：MT2褪黑素受体特异性拮抗剂、二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。

[0019] 在另一方面，本发明提供了一种试剂盒或包装，其中包括(a)选自(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；以及(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐的至少一种化合物；以及(b)有关将所述化合物给予对象以矫正或预防骨矿化缺陷的说明书。

[0020] 在一个实施方式中，上述试剂盒或包装包含(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的药学上可接受的盐；或者(iii)(i)和(ii)的任意组合。

[0021] 在一个实施方式中，上述说明书是有关将所述化合物给予对象以矫正骨吸收和骨形成失调的说明书。

[0022] 在另一个实施方式中，上述试剂盒或包装还包括选自如下一组的另一种药物：MT2褪黑素受体特异性拮抗剂、二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。

[0023] 在另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含(a)(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；
或者(iv)(i)到(iii)的任意组合；以及(b)治疗有效量的选自如下一组的药物：MT2褪黑素受体特异性拮抗剂、二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。

[0024] 在另一方面，本发明提供了一种用于矫正对象的骨吸收和骨形成失调的组合物，该组合物包含(a)(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；或者(iv)(i)到(iii)的任意组合；以及(b)药学上可接受的载体。

[0025] 在另一方面，本发明提供了一种靶向到骨的组合物，该组合物包含(a)(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；或者(iv)(i)到(iii)的任意组合；以及(b)药学上可接受的载体。

[0026] 在一个实施方式中，上述组合物包含(a)(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的药学上可接受的盐；或者(iii)(i)和(ii)的任意组合；以及(b)药学上可接受的载体。

[0027] 在另一方面，本发明提供了治疗有效量的(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；或者(iv)(i)到(iii)的任意组合在制备用于治疗骨吸收和骨形成失调的药物中的应用。

[0028] 在另一方面，本发明提供了治疗有效量的(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐；或者(iv)(i)到(iii)的任意组合在治疗骨吸收和骨形成失调中的应用。

[0029] 在一个实施方式中，上述应用是指(i)4-P-PDOT；(ii)4-P-PDOT的药学上可接受的盐；或者(iii)(i)和(ii)的组合的应用。

[0030] 在一个实施方式中，上述骨吸收和骨形成失调的矫正包括至少一种：骨吸收的抑制；破骨细胞分化的抑制；骨矿物质密度(BMD)的增加；骨矿物质含量(BMC)的升高；纯皮质骨密度的增加；总骨平均密度的增加；骨皮质厚度的增加；被称为骨皮质的纯皮质区域的增加；胫骨骨干总骨面积的增加；矿化沉积速率的升高；骨形成率/骨表面指示物的升高；内皮质或骨膜表面的矿化表面的增加；血清碱性磷酸酶的降低；低矿化(hypo-mineralized)类骨质的皮质内区的减少；类骨质厚度的降低和类骨质密度的降低。

[0031] 在另一实施方式中，上述骨吸收和骨形成失调的矫正包括骨吸收的抑制；在另一实施方式中，上述骨吸收和骨形成失调的矫正包括破骨细胞分化的抑制；在另一实施方式中，上述骨吸收和骨形成失调的矫正包括骨矿物质密度(BMD)的增加；在另一实施方式中，上述骨吸收和骨形成失调的矫正包括骨矿物质含量(BMC)的升高。

[0032] 在一个实施方式中，上述应用还包括选自如下一组的其他药物的应用：MT2褪黑素受体特异性拮抗剂、二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。

[0033] 在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括：(a)确定对象患有骨吸收和骨形成失调；以及(b)给予对象治疗有效量的至少一种MT2褪黑素受体特异性拮抗剂，从而所述对象的骨吸收和骨形成失调被矫正。

[0034] 在另一方面，本发明提供了治疗有效量的至少一种MT2褪黑素受体特异性拮抗剂在制备用于治疗骨吸收和骨形成失调的药物中的应用。

[0035] 在另一方面，本发明提供了治疗有效量的至少一种MT2褪黑素受体特异性拮抗剂在治疗骨吸收和骨形成失调中的应用。

[0036] 本发明还提供了用于治疗骨吸收和骨形成失调的组合物，所述组合物包含至少一种MT2褪黑素受体特异性拮抗剂和一种药学上可接受的载体。

[0037] 本发明还提供了一种试剂盒或包装，其中包括至少一种MT2褪黑素受体特异性拮抗剂和治疗骨吸收和骨形成失调的说明书。

[0038] 在一个实施方式中，上述对象患有骨质疏松。在另一个实施方式中，上述对象患有佩吉特病。在另一个实施方式中，上述对象患有溶骨性骨癌。在另一个实施方式中，上述对象患有以存在诱导破骨细胞的炎性细胞因子为特征的关节炎。

[0039] 在一个实施方式中，上述对象是哺乳动物。在另一实施方式中，上述对象是人。

[0040] 在本文中，术语“对象”是指包括人、小鼠、大鼠、狗、猫、猪、猴、马等在内的任何哺乳动物。在一个特殊实施方式中，对象是指人。

[0041] 冠词“一个”、“一种”和“这”在本文中是指一个或一个以上(即，至少一个)该冠词的语法对象。

[0042] 在本文中，术语“包括”和“包含”意味着术语“包括而不限于”和“包含而不陷于”，前二者与后二者可交互使用。

[0043] 术语“如”用于本文中与术语“例如而不限于”意义相同，二者可交互使用。

[0044] “激动剂”是指配体刺激配体依赖性的受体特征性活性升高到无配体存在时的任意基线水平之上。“拮抗剂”是指配体与受体结合，并作为受体特征性的激动剂活性的竞争性或非竞争性抑制剂而发挥作用。“反相激动剂”或“反面激动剂”是指配体与所述受体结合并将受体的活性抑制到无受体配体时所观察到的活性水平之下。在本文中，术语“MT2褪黑素受体特异性拮抗剂”是指与MT2受体特异性结合的拮抗剂，不同于2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole)等与其他褪黑素受体结合的拮抗剂。

[0045] 在本文中，术语“破骨细胞前体细胞”是指能够分化成熟成破骨细胞的细胞。作为非限定性的例子，这种细胞包括RAW264.7细胞、脾细胞、能成熟为破骨细胞的造血细胞以+及CD14 单核细胞。

[0046] 目前已知有多种因子可刺激破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞。作为非限定性的例子，它们包括核因子κB配体的受体活化因子(RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及能够刺激破骨细胞活性的各种白细胞介素。

[0047] 目前市场上已经有许多可吸收的骨类似物，例如而不限于BioCoatTM。其他可吸收的骨类似物包括牙本质碎片和羟磷灰石。

[0048] 目前已知有多种骨吸收和骨形成失调的动物模型，其中包括C57BI/6J小鼠，实验证明这种小鼠的骨矿物质密度(BMD)很低，以及骨质疏松动物模型。

[0049] 目前已知有多种骨质疏松动物模型，其中包括卵巢切除小鼠和大鼠。

[0050] 包括在本发明范围内的有4-苯基-2-丙酰氨基四氢萘(4-P-PDOT)的衍生物、类似物、结合物或前药及其盐，如本文所述，这些物质能够治疗对象的骨吸收和骨形成失调。上述的盐包括药学上可接受的盐。4-P-PDOT的各种类似物、衍生物、结合物和前药是已知的，其中包括，例如，8-甲氧基-2-丙酰氨基-四氢萘；2-氯乙酰氨基-四氢萘；8-甲氧基-2-n-丁氨基-四氢萘；8-甲氧基-2-环丙烷羰基氨基-四氢萘；8-甲氧基-2-氯乙酰氨基-四氢萘；4-苯基-2-乙酰氨基-四氢萘(4-P-ADOT)；4-苄基-2-乙酰氨基四氢萘；
4-苯基-2-氯乙酰氨基-四氢萘(4-P-CADOT)；以及4-苯基-2-丙酰氨基-四氢萘，见于美国专利号5,071,875的描述。在一个实施方式中，上述衍生物是4-P-ADOT或4-P-CADOT。

[0051] 试剂盒

[0052] 本发明还提供了用于治疗/预防骨吸收和骨形成失调(例如，用于抑制骨吸收或破骨细胞成熟/分化)的试剂盒或包装，其中包括选自(i)4-苯基-2-丙酰氨基四氢萘(4-P-PDOT)；(ii)4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；以及(iii)(i)或(ii)的药学上可接受的盐的至少一种化合物；以及有关将所述化合物给予对象以抑制骨吸收或破骨细胞成熟/分化的说明书。这种试剂盒还包括组合物(例如，药用组合物)，该组合物包含上述化合物中的至少一种以及药学上可接受的载体。这种试剂盒还包括至少一种能够抑制患有骨质疏松的对象体内骨吸收或破骨细胞成熟/分化的其他活性因子，试剂盒还可以包括至少一种能够预防或矫正骨质疏松的其他有害症状的其他活性因子。这种因子包括而不限于二膦酸盐、雷洛昔芬、降钙素鼻喷剂和特立帕肽。另外，本发明带隔室的试剂盒可包括试剂被装入到不同容器内的任何试剂盒。这种容器包括小玻璃容器、塑料容器或塑料贴或纸贴。这种容器便于将试剂从一个隔室转移到另一个隔室，从而保证试剂不会交叉污染，并且每一个容器内的药物或溶液都能以定量的方式从一个隔室添加到另一个隔室。

[0053] 在本文中，术语“骨吸收和骨形成失调”是指破骨细胞成熟或分化的速度增加、生成更多的成熟破骨细胞以及成熟破骨细胞的吸收活性升高。

[0054] 在本文中，术语“矫正”用于指矫正骨吸收和骨形成失调时意味着骨吸收和骨形成失调的部分或完全改善。这种矫正对应于，但并不限于，骨吸收的抑制；破骨细胞分化的抑制；骨矿物质密度(BMD)的增加；骨矿物质含量(BMC)的升高；纯皮质骨密度的增加；总骨平均密度的增加；骨皮质厚度的增加；被称为骨皮质的纯皮质区域的增加；胫骨骨干总骨面积的增加；矿化沉积速率的升高；骨形成率/骨表面指示物的升高；内皮质或骨膜表面的矿化表面的增加；血清碱性磷酸酶的降低；低矿化类骨质的皮质内区的减少；类骨质厚度的降低和类骨质密度的降低。

[0055] 给药途径

[0056] 本发明的药用组合物可通过如下途径给药，如口服、鼻内、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含服、鞘内注射或皮内注射。给药途径根据多种因素确定，如环境和治疗目的。

[0057] 例如，本发明的药用组合物可以是液体、溶液、玄烨、丸剂、胶囊、片剂、凝胶帽、粉末、凝胶剂、软膏、乳膏、喷雾剂、合剂、雾化蒸气、气溶胶或磷脂复合物(phytosome)的形式。对于口服给药来说，片剂或胶囊可用药学上可接受的赋形剂如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂或湿润剂以常规方式制备。片剂可通过本领域熟知的方法包被。口服液体制剂可采取，例如，溶液、糖浆剂或悬液的形式，或者制备成干燥产品，在使用前用盐水或其他合适的液体赋形剂溶解。本发明的营养保健品还可包含药学上可接受的添加剂如合适的助悬剂、乳化剂、非水性赋形剂、防腐剂、缓冲盐、调味料、着色剂以及甜味剂。口服制剂还可以制备成适于控释活性成分的剂型。

[0058] 剂量

[0059] 可以给予对象任何剂量的药用组合物。给药剂量要根据多种因素而定，其中包括给药模式和对象年龄。年轻人的骨更新速度很快，因为骨还在生长之中。一般而言，单次剂量所包含的本发明化合物或药物(4-P-PDOT，4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；及其药学上可接受的盐)的量是能有效预防、延迟或矫正需要此药物的对象的骨吸收并且不会诱导明显毒性的量。在本文中，术语“治疗有效量”是指能够有效地达到理想治疗效果的量。治疗有效量也可以是化合物的治疗有益效果超过其不良副作用的量。一般来说，本发明的化合物或药物(例如，4-P-PDOT，4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；或其药学上可接受的盐)可以0.001到500mg/kg/天的剂量给予对象，在更特殊的实施方式中，剂量范围是1mg到5mg/kg/天。利用Mahmood等的比速增长标度法(J.Clin.Pharmacol.2003，
43(7)：692-7)可根据小鼠的给药剂量推算出人的给药剂量。本发明的小分子的药学上可接受的制剂及盐包括在本发明的范围之内，是本领域所熟知的((Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿药物科学)，第16版，Mack编辑)。临床医生可根据常规因素如疾病的严重程度以及患者的不同指标。

[0060] 也可以直接测定本发明的化合物或药物(例如，4-P-PDOT，4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；或其药学上可接受的盐)的治疗有效量。有效量可每日、每周或隔数日给药。一般来说，本发明的药用组合物的给药剂量为约0.001mg到约500mg/公斤体重/天(例如1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、10mg、50mg、100mg或250mg)。药物可以单次给药或多次给药的方式提供。例如，在某些实施方式中，有效量是约1mg到约25g药物/天、约50mg到约10g药物/天、约100mg到约5g药物/天、约1g药物/天、约1mg到约25g药物/周、约50mg到约10g药物/周、约100mg到约5g药物/两天、以及约1g药物/周的剂量。

[0061] 这些仅仅是指导原则，因为实际的给药剂量必须由主治医师根据每一位患者的临床状况来小心选择和确定。最佳每日剂量可通过本领域熟知的方法确定，并且受一些因素如上述的患者年龄和其他临床相关因素的影响。另外，患者也可能正在使用治疗其他疾病或状况的药物。在使用本发明的药物期间其他药物可继续使用，但是在这种情况下特别需要注意的是要以低剂量开始以确定是否会发生不良副作用。

[0062] 载体/赋形剂

[0063] 本发明的化合物或药物(例如，4-P-PDOT，4-P-PDOT的衍生物、类似物、结合物或前药；或其药学上可接受的盐)可与药学制剂中常用的赋形剂混合制成制剂，如滑石粉、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油、石蜡衍生物或甘油。乳化剂，如美国专利号5,434,183所描述的那些乳化剂，也可以使用，其中蔬菜油(例如，大豆油或红花油)、乳化剂(例如，蛋黄磷脂)和水与甘油混合。可用于本发明的药用制剂中的其他非限定性药学上的合适材料包括吸收促进剂、pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、增稠剂、软化剂、分散剂、调味剂、着色剂和湿润剂。制备合适制剂的方法是本领域熟知的(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Science(雷明顿药物科学)，第16版，1980，A.Oslo编辑，Easton，宾夕法尼亚州)。

[0064] 如果选择胃肠外途径作为给药途径，包含药物的制剂可与药学上可接受的无菌水性或非水性溶剂、悬液或乳液混合提供给患者。非水性溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油、鱼油和可注射的有机酯。水性载体包括水、乙醇水溶液、乳液或玄烨，其中包括盐水和缓冲的医用胃肠外赋形剂，如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖氯化钠溶液、含乳糖的林格氏溶液或不挥发油。静脉注射的赋形剂包括流质和营养补充剂、电解质补充剂，如利用林格氏葡萄糖溶液等配制的那些补充剂。

[0065] 在另一实施方式中，本发明的药用组合物可以控释系统的方式给药。在实施方式中，聚合材料如聚乳酸、多正酯、交联的两亲性嵌段聚合物和水凝胶、多羟基丁酸和聚二氢吡喃也可以使用(也可参见Smolen和Ball，Controlled DrugBioavailability(可控药物生物利用度)，Controlled Drug Bioavailability，Drugproduct design and performance(药物产品的设计与效果)，1984，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons)；Ranade和Hollinger，Drug Delivery Systems(药物释放系统)，药理学和毒理学系列，
2003，第2版，CRRC出版社)，在另一实施方式中，可以使用泵(Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。本发明的化合物也可以通过使用靶向性分子和/或部分(例如，单克隆抗体，肽)作为独特载体来转运，其中药物被偶联/连接到载体上。在一个实施方式中，上述靶向性分子/部分可增强和/或促进药物向骨的转运(即，骨靶向性分子/部分)。本发明还包括经修饰后溶解度和/或循环时间升高的化合物，例如聚乙二醇化。

[0066] 在本文中，“对象”或“有此需要的对象”是指动物，如人，其中希望的是预防、延迟或治疗其体内的骨吸收缺陷。在特殊实施方式中，患有疾病或状况如骨质疏松、佩吉特病和溶骨性骨癌的对象将受益于本发明的化合物、组合物、方法和应用。

[0067] 通过阅读下面特殊实施方式的非限定性描述，即使只参考附图的实施例，也能更清楚地了解本发明的其他目的、优点和特征。

[0068] 附图简述

[0069] 在附图中：

[0070] 图1显示的是RT-PCR结果，显示Mel1b(MT2)只在RAW264.7细胞内表达。脑组织作为阳性对照(+对照)；

[0071] 图2显示的是分化的RAW264.7细胞为MT2受体阳性染色。图A：无一抗的阴性对照。图C：MT2抗体染色的细胞，显示了蛋白质的膜定位。图B和D：阴性对照和MT2阳性细胞的DAPI细胞核染色。图E和F：阴性对照(在存在抗体可识别的并且与MT2受体竞争的肽的条件下孵育)以及这种阴性对照的DAPI细胞核染色；

[0072] 图3显示的是TRAP阳性RAW264.7细胞的数量。细胞与RANKL培养2.5天(图A)-6或6天(图B)，其中添加(白色柱)和不添加(黑色柱)10 M 4-P-PDOT。图中显示的是原始计数(上图)和占对照细胞的％(下图)。这些结果代表了三次独立试验的平均值；

[0073] 图4显示的是骨吸收结果。图A显示的是吸收凹点的数目，图B显示的是吸收的面2 2
积(μm*1000)，图C显示的是总吸收面积(凹点数X吸收的面积(μm*1000))。RAW264.7-6
细胞与RANKL培养10天，其中不添加(黑色柱)和添加10 M 4-P-PDOT 4天(白色柱)或
10天(阴影柱)。图中显示的是两份8个显微视野的计数结果。结果2个独立的试验；

[0074] 图5显示的是褪黑素对破骨细胞分化的效应。RAW264.7细胞与RANKL培养2.5天-9(图A)或6天(图B)，其中不添加(黑色柱)和添加10 M褪黑素(白色柱)以及添加褪-6
黑素加10 M 4-P-PDOT(灰色柱)。图中显示的是原始计数(上图)和占对照细胞的％(下图)。这些结果代表了4次独立试验的平均值；

[0075] 图6比较了与RANKL共培养6天后RAW264.7细胞的分化情况，其中添加10-9M褪-9 -6 -6黑素、10 M褪黑素+10 M 4-P-PDOT、或者10 M 4-P-PDOT，比较的内容是TRAP阳性细胞占对照细胞(只用RANKL处理的细胞)的百分数。图的上半部分显示的是每一种处理后显示细胞的显微视野。这些结果代表了3到6次独立试验的平均值；

[0076] 图7显示的是褪黑素对破骨细胞功能的效应。RAW264.7细胞与RANKL培养10-9 -9 -6天，其中不添加(黑色柱)和添加10 M褪黑素(白色柱)以及添加10 M褪黑素加10 M
4-P-PDOT(灰色柱)培养4天或10天。图中显示的是双份计数的8个显微视野内的吸收凹点
2* 2*
(pit)(图A)、吸收面积(μm 1000)(图B)和总吸收面积(凹点数×吸收面积(μm 1000)(图C)。这些结果是总结了两次独立的实验得到的；

[0077] 图8比较了与RANKL共培养10天后RAW264.7细胞的分化情况，其中添加10-9M褪-9 -6 -6黑素、10 M褪黑素+10 M 4-P-PDOT、或者10 M 4-P-PDOT，比较的内容是与对照细胞(只用RANKL处理的细胞)相比吸收凹点数(中图)或总吸收面积(下图)的百分数。图的上半部分显示的是每一种处理后显示细胞的显微视野。这些结果是总结了两次独立的实验得到的；

[0078] 图9显示的是浓度不断增加的褪黑素(图A)、4-P-PDOT(图B)或二者(图C)对福斯高林刺激的RAW 264.7细胞腺苷酸环化酶活性的效应；

[0079] 图10显示的是经过浓度不断增加的褪黑素(上图，A)、4-P-PDOT(中图，B)或二者(下图，C)的处理后福斯高林刺激的RAW 264.7细胞内标准化的cAMP值；

[0080] 图11显示的是分化的RAW 264.7细胞凋亡的比较。无一抗的为阴性对照(图A)。DNA酶处理的细胞作为凋亡的阳性对照(图B)。细胞分别经过如下处理：只有RANKL(图-6 -9 -9 -6
C)、4-P-PDOT 10 M(图D)、褪黑素10 M(图E)以及褪黑素10 M+4-P-PDOT 10 M(图F)；

[0081] 图12显示的是经过如下处理的RAW264.7细胞内氚化胸腺嘧啶核苷的掺入：只有-7 -9 -6 -6RANKL、10 M(+mel-7)或10 M(+mel-9)褪黑素、10 M 2-苯基-N-乙酰色胺(Luz-6)、10 M -9 -8 -9
4-P-PDOT(PP-6)、10 M褪黑素+10 M 2-苯基-N-乙酰色胺(+mel-9+Luz-8)或10 M褪黑-6
素+10 M 4-P-PDOT(+mel-9+PP-6)；

[0082] 图13显示的是经过如下处理的RAW264.7细胞核数的频率：只有RANKL、10-9M褪黑-6 -9 -6素(+mel-9)、10 M 4-P-PDOT(PP-6)或10 M褪黑素+10 M

[0083] 4-P-PDOT(+mel-9+PP-6)；

[0084] 图14显示的是RAW264.7细胞与RANKL共培养10天后RANK cDNA的表达水平，其-9 -9 -6 -6中添加10 M褪黑素、10 M褪黑素+10 M 4-P-PDOT、或者10 M

[0085] 4-P-PDOT，比较的内容是与对照细胞(下图)相比表达水平(经过β肌动蛋白表达水平标准化)的百分数。图的上半部分代表琼脂糖凝胶上所显示细胞经过不同处理后的RANK cDNA表达水平(RT-PCR)。这些结果是总结了3次独立的实验得到的；

[0086] 图15显示的是对照小鼠和处理小鼠0天到35天期间体重增长的变化；

[0087] 图16显示的是对照小鼠和处理小鼠0天到35天期间全身骨矿物质含量(BMC)、骨面积和骨矿物质密度(BMD)的变化；

[0088] 图17显示的是对照小鼠和处理小鼠0天到35天期间脊柱BMC、骨面积和BMD的变化；

[0089] 图18显示的是对照小鼠和处理小鼠0天到35天期间左、右股骨BMC、骨面积和BMD的变化；

[0090] 图19显示的是雄性C57BI6/j小鼠右股骨部分的TRAP染色。图A代表对照小鼠(未处理)的右股骨部分。图B代表用10mg/公斤体重的4-P-PDOT处理的小鼠的右股骨部分。用4-P-PDOT处理的小鼠的破骨细胞数明显减少。放大倍数20×；

[0091] 图20显示的是雄性C57BI/6j小鼠右股骨部分的Goldner染色。上图(A、B和C)代表未处理小鼠(n＝3，对照)的组织学切片，而下图(D、E和F)代表4-P-PDOT处理小鼠(n＝3)的组织学切片。用4-P-PDOT处理(10mg/公斤体重，静脉注射，每周三次)的动物的骨小梁增加；以及

[0092] 图21显示的是4-P-PDOT对破骨细胞总数及活性破骨细胞数的效应。破骨细胞总+数通过Goldner染色的切片确定，而活性破骨细胞数根据TRAP 细胞数来计算。

[0093] 说明性实施方式的描述

[0094] 通过下面非限制性的实施例对本发明作进一步的详细描述。

[0095] 细胞模型RAW264.7(小鼠巨噬细胞系，ATCC#TIB-71)。当加入细胞核因子κB配体的受体活化因子(RANKL)时，这些细胞可分化成破骨细胞样细胞。细胞的分化通常发生在两天之内。在加入RANKL后2.5天(早期)、6天和10天(晚期)对细胞进行研究。

[0096] 试验处理方法：在某些试验中，在加入RANKL的同时加入10-6M的4-P-PDOT。以只用RANKL处理的细胞为对照。

[0097] 实施例1

[0098] RAW264.7细胞上褪黑素受体的基因和蛋白质表达

[0099] 未确定RAW 264.7细胞上是否存在褪黑素受体，进行基因和蛋白表达的检测。TM
RAW264.7细胞培养6天，其中添加或不添加RANKL。按照厂家的说明书利用Trizol 试剂TM
提取RNA。利用Thermoscript RT-PCR系统(因维曲根公司(InVitrogen))反转录2μg总RNA。扩增褪黑素受体1a(MT1)和1b(MT2)的PCR反应使用跨越内含子的引物。MT2正向引物：

[0100] 5′-GCAGGTAATTTGTTTGTGGT-3′(SEQ ID NO：1)；MT2反向引物：

[0101] 5′-AGATGCGTGGATCATACTCT-3′(SEQ ID NO：2)；MT 1正向引物：

[0102] 5′-TGTACCGCAACAAGAAGCTCAGGA-3’(SEQ ID NO：3)；MT1反向引物：

[0103] 5′-TGGCGATGAGTGTCAGCATCCATA-3′(SEQ ID NO：4)。将RAW264.7样品与两种受体都是阳性的脑组织样品进行比较。结果显示在图1中。结果显示检测到了MT2但未检测到MT1。

[0104] 然后利用免疫荧光检测MT2受体的定位。RAW 264.7细胞在LabTekTM培养箱中培TM养3天，其中添加或不添加RANKL。细胞用3.7％的多聚甲醛固定，用0.1％Triton -X-100进行渗透化处理。然后将细胞置于添加1％牛白蛋白的PBS(PBSA)中孵育30分钟，再与
1∶25稀释于PBSA中的抗褪黑素1b在37℃孵育2小时。阴性对照只与PBSA孵育。用PBSTM
漂洗4次以后，细胞与1∶500稀释的偶联于Alexa 594荧光染料的驴抗羊抗体在37℃孵育1小时。将细胞固定，利用带荧光的显微镜以40×物镜拍照。在所有条件下每种颜色的曝光时间相同。结果显示在图2中。

[0105] 实施例2

[0106] 通过测定酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP)活性来确定4-P-PDOT对破骨细胞分化的效应

[0107] 为了评价破骨发生(osteoclastogenesis)情况，RAW264.7细胞与RANKL共培养-62.5或6天，其中添加或不添加10 M 4-P-PDOT。RAW264.7细胞用多聚甲醛固定，在分化2.5和6天时进行TRAP活性(活性破骨细胞标志物)染色。计数四份样品的8个不同视野中具有3个以上细胞核的染色阳性的细胞数。结果显示在图3中，图3A和B分别代表2.5或
6天的试验结果。这些数据说明在RAW264.7细胞分化过程中添加4-P-PDOT可降低TRAP+细胞数。

[0108] 实施例3

[0109] 破骨细胞功能：骨吸收试验

[0110] 利用可吸收的骨类似物(BioCoatTM OsteologicTM盘，BD生物科技公司(BD Biosciences))来确定破骨细胞活性。RAW 264.7接种到包被有这种类似物的16孔板中。-6
接种后24小时，细胞用单独的RANKL处理或者用RANKL+10 M 4-PPDOT处理10天。在另-6
一组试验中，在细胞与RANKL共培养6天后再添加10 M 4-P-PDOT，然后再培养4天以确定
4-P-PDOT对更成熟的细胞的效应。在培养结束时，细胞用漂白剂分离下来，按照厂家的说明TM
书用5％硝酸银对骨类似物染色以显示吸收的骨面积(吸收凹点)的存在。用Bioquant软件定量测定两份样品中8个显微视野内的凹点数和吸收的骨面积。结果显示在图4中。
其他结果显示在图8中。

[0111] 实施例4

[0112] 比较褪黑素和4-P-PDOT对破骨细胞分化和功能的效应

[0113] 按照上述实施例2和3的方法评价褪黑素对破骨形成和破骨细胞功能的效应，只-9 -6是在培养细胞时添加的是10 M褪黑素加RANKL。在某些试验中，添加的是褪黑素加10 M
4-P-PDOT。单独用RANKL处理的细胞为对照。添加褪黑素对破骨形成没有明显影响(图5A和5B以及图6)，但是却能显著抑制骨吸收(图7)。

[0114] 实施例5

[0115] 比较褪黑素和4-P-PDOT诱导的cAMP产生

[0116] RAW264.7细胞在不含RANKL的培养基中生长直到细胞汇合(7天)。然后细胞用-410 M福斯高林处理，培养基中还存在各种浓度的褪黑素(图9，图A)、4-P-PDOT(图9，图B)-11 -5
或二者都存在(图9，图C)。褪黑素的浓度范围为10 到10 M，4-P-PDOT的浓度范围为-10 -4 -11 -5 -6
10 到10 M。在双因子处理组中，细胞用升高浓度的(10 到10 M)添加了10 M 4-P-PDOT的褪黑素处理。37℃孵育30分钟以后，用添加蛋白酶和磷酸二酯酶抑制剂的TRIS-EDTA缓冲液在4℃裂解细胞。利用酶联免疫分析试剂盒测定200μL上清中的cAMP含量，样品设双份。

[0117] 图10显示的是分别用褪黑素、4-P-PDOT或褪黑素+4-P-PDOT处理的RAW264.7细胞内的标准化的cAMP活性值，其中在图A、B、和C中，剂量1相对应于单独添加福斯高林时-11 -10 -11 -6的cAMP值；剂量2相对应于10 褪黑素、10 4-P-PDOT或10 褪黑素+10 4-P-PDOT；剂-9 -8 -9 -6
量3相对应于10 褪黑素、10 4-P-PDOT或10 褪黑素+10 4-P-PDOT；剂量4相对应于-7 -6 -7 -6 -5
10 褪黑素、10 4-P-PDOT或10 褪黑素+10 4-P-PDOT；以及剂量5相对应于10 褪黑素、-4 -5 -6
10 4-P-PDOT或10 褪黑素+10 4-P-PDOT。cAMP值用总蛋白浓度进行标准化，后者是利用Bradford蛋白分析试验确定的。

[0118] 从图9和图10可以看出，cAMP生成的数值显示这些细胞对褪黑素和4-P-PDOT的反应是不同的。在4-P-PDOT的剂量不断增加时，cAMP生成增多，而褪黑素的剂量增加时cAMP生成被抑制。

[0119] 然后RAW 264.7细胞在LabTekTM培养箱内培养6天，其中单独添加RANKL-9 -9 -6或 者 添 加RANKL+ 褪 黑 素(10 M)、RANKL+ 褪 黑 素(10 M)+4-P-PDOT(10 M) 或 者-6 TM
RANKL+4-P-PDOT(10 M)。细胞用3.7％的多聚甲醛固定，用0.1％Triton -X-100进行渗透化处理。然后将细胞置于添加1％牛血清白蛋白的PBS(PBSA)中孵育30分钟，再与1∶40稀释的溶于PBSA中的抗抗次毒蕈环肽抗体在37℃共孵育30分钟。用PBS漂洗4次以后，细胞用含DAPI的介质固定，利用带荧光的显微镜以63×物镜拍照。图像采集自10个独立的显微视野，计数多核细胞(两个以上的细胞核)的细胞核。图13显示的是细胞核数的频度，表示为占多核细胞总数的％。

[0120] 实施例6

[0121] 处理和未处理细胞凋亡情况的比较

[0122] RAW264.7细胞在添加RANKL的培养基中培养6天，培养基中添加或不添加10-6M TM4-P-PDOT。细胞用多聚甲醛固定，用0.1％ Triton -X-100进行渗透化处理。一部分细胞TM
在室温下用DNA酶处理10分钟作为阳性对照。利用DeadEnd 荧光TUNEL系统测定凋亡水平。该方法通过在DNA中掺入荧光标记的d-UTP来测定片段化的DNA。渗透化的细胞在含核苷酸混合物和能催化反应的酶的平衡缓冲液中37℃孵育1小时。阴性对照不与酶共孵育。用SSC和PBS漂洗几次以后，固定细胞并在荧光显微镜下观察。结果显示在图11中。

[0123] 实施例7

[0124] 处理和未处理细胞增殖情况的比较

[0125] 经过24小时贴壁以后，RAW264.7细胞进行血清饥饿处理，过夜，然后在含RANKL+-7 -9 -9褪黑素(10 或10 M)、或褪黑素(10 M)+褪黑素受体非特异性拮抗剂2-苯基-N-乙酰-8 -9 -6 -6
色胺(10 M)、或褪黑素(10 M)+4-P-PDOT(10 M)、或单独的2-苯基-N-乙酰色胺(10 M)-6
或4-P-PDOT(10 M)的培养基中培养2.5天。在细胞饥饿前8小时通过在培养基中添加
0.02μCi/μL氚化胸腺嘧啶核苷来测定胸腺嘧啶的掺入水平。然后用冰预冷的PBS洗涤细胞2次，再用冷的5％三氯乙酸洗涤三次。细胞在0.5N NaOH和0.5％SDS中裂解，利用β计数仪测定裂解物的放射活性。结果显示在图12中。

[0126] 图11和12显示4-P-PDOT对破骨细胞功能/骨吸收的效应不能被凋亡水平升高或细胞增殖下降解释，因为这些参数的比较是在4-P-PDOT处理细胞和未处理细胞之间进行的。

[0127] 实施例8

[0128] 破骨细胞标志物的表达

[0129] 在处理后6天，通过RT-PCR来分析褪黑素和4-P-PDOT对参与破骨细胞分化和活性的各种基因表达水平的影响。图14说明褪黑素和4-P-PDOT可诱导RAW264.7来源的破骨细胞明显降低RANK的表达。

[0130] 实施例9

[0131] 4-P-PDOT对动物模型骨吸收和骨形成失调的效应

[0132] 已知3周龄的雄性C57BI/6j小鼠的骨矿物质密度(BMD)很低，这是因为有抑制褪黑素产生的天然突变发生，这种小鼠腹膜内注射10mg/kg 4-P-PDOT，每周3次，持续1个月。作为平行对照，对照动物注射水和乙醇(20％)配置的溶液。

[0133] 在此期间，利用PixiMusTM II骨密度测定仪每周测定动物的骨密度测量值(BMD)和骨矿物质含量(BMC))，并采集血样和尿样。扫描每个个体的脊柱、长骨(股骨)。还扫描胫骨、桡骨和颚骨。

[0134] 为了监测骨形成速率，在开始注射后的10天和20天注射25mg/kg盐酸四环素。还要测定骨形成的骨组织计量学值和骨吸收的静态和动态参数。骨形成使用的生化标志物是碱性磷酸酶，骨吸收使用的标志物是尿脱氧吡啶诺林。

[0135] 在试验的前35天，与注射载体的动物相比，处理组小鼠的体重增加，脊柱和全身的骨矿物质堆积增多(参见如16-18)。

[0136] 分析持续进行12个月以上，6个月或12个月以后，处死小鼠，利用TM
microCT (SkyScan CT分析仪)扫描每个动物的骨和脊柱，然后固定并用间丙烯酸甲酯包埋以便于组织形态分析(其中包括骨细胞：类骨质(ostoid)、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞的表面和体积、骨皮质和骨小梁的厚度)。

[0137] 另外还用了断奶后的4周龄雄性C57BL/6小鼠来检测4-P-PDOT对骨形成的效应。小鼠腹膜内注射10mg/kg 4-P-PDOT，每周3次，持续4周(28天)。然后进行股骨切片染色以定量测定酒石酸耐性酸性磷酸酶(TRAP-)阳性的破骨细胞(即，“活跃的”破骨细胞)。图
19显示，用4-P-PDOT处理的小鼠与对照小鼠相比活跃的破骨细胞数明显减少。还进行了股骨*切片的Goldner染色以定量测定破骨细胞总数。如图20所示，4-P-PDOT处理还可以使破骨细胞总数和小梁骨增多。另外，图21的结果清楚地说明4-P-PDOT处理小鼠与载体处理小鼠相比其体内的活跃破骨细胞相对数明显降低(尽管总的破骨细胞相对数升高)。

[0138] 虽然在上文通过特殊实施方式对本发明作了描述，但是本发明是可以修改的，只要不脱离如附属权利要求所定义的本发明的精神和性质就行。