转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用

摘要

本发明涉及转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用。本发明公开了一种用于制备时空可调性肝脏损伤模型的构建物组合，包括时空可调性表达肝损伤诱导基因的构建物以及表达Cre重组酶的构建物。本发明还公开了含有所述构建物的细胞。本发明还公开了制备时空可调性肝脏损伤模型的方法，所获得的动物模型可随时地、高效地诱导肝损伤，为肝细胞移植、肝脏再殖的研究提供了有效的途径。

权利要求

1.一种用于制备时空可调性肝脏损伤模型的构建物组合，其特征在于，其包括：(1)构建物1，从5至3依次包括以下可操作性相连的元件：启动子，LoxP序列，报告基因序列，终止子1，LoxP序列，tBid基因序列，Bax基因序列，终止子2；和(2)构建物2，从5至3依次包括以下可操作性相连的元件：启动子，突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列，Cre重组酶基因序列，和终止子；

其中所述的突变型雌激素受体配体结合结构域可被雌激素类似物激活进而激活Cre重组酶活性，不被动物体内雌激素激活。

2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，构建物1中，所述的报告基因是β-半乳糖苷酶基因。

3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，构建物1中，所述的启动子是CAG启动子；

或

构建物2中，所述的启动子是白蛋白启动子。

4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，构建物2中，在所述的Cre重组酶基因和终止子之间，还含有一突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列。

5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，构建物1中，所述的tBid基因和Bax基因之间，还含有内部核糖体插入位点序列。

6.一种细胞，其特征在于，所述的细胞的基因组中整合有权利要求1-5任一所述的构建物组合，所述的细胞是肝细胞。

7.一种制备转基因非人哺乳动物受精卵的方法，所述的受精卵用于制备时空可调性肝脏损伤模型，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的构建物1引入非人哺乳动物的受精卵，获得转入了所述构建物1的受精卵；或将权利要求1所述的构建物2引入非人哺乳动物的受精卵，获得转入了所述构建物2的受精卵。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠。

说明书

转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应

用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用。

背景技术

[0002] 肝器官移植是目前临床治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病以及代谢性肝病的主要手段。然而由于供体肝的短缺，肝器官移植的临床应用受到了严重限制。美国每年约有14000人等待肝移植，其中50％等待超过1年，每年约1300人由于等不到肝移植而死亡。我国要求行器官移植的等待名单也不断增多。因此，临床急需其他方法来改善肝功能，延长患者的生存时间来等待肝移植，或取代肝移植。

[0003] 肝细胞具有较强的增殖能力。1988年Bumgardner等率先提出了肝细胞移植的概念，1993年由Mito等在世界上开展了第一例人体肝细胞移植技术，当时实行的是自体同源性肝细胞移植。随后肝细胞移植技术迅速发展，并成为生物医学研究的热点领域之一。通过实验动物的临床前期试验显示，肝细胞移植在肝脏、脾脏和其他一些部位后，仍能维持其正常光镜和电镜结构，并且能表达多种肝细胞功能，如血清白蛋白分泌、糖原储存和酵解、胆红素结合、氨代谢以及细胞色素P450酶基因表达等。有望通过肝细胞移植治疗的疾病包括肝脏本身的疾病和肝相关性疾病，如急、慢性肝功能衰竭、慢性病毒性肝炎和肝硬化等。

[0004] 我国首例肝细胞移植于2004年获得成功。目前肝细胞移植已经积累了丰富的临床经验，并能部分或全部代替肝移植而应用于临床。但是，肝细胞移植研究的核心仍然是肝细胞的来源问题。临床研究表明，自体成熟的肝细胞最适合临床移植，但这本身就是一个矛盾，为此，人们急于寻求其它来源。

[0005] ES细胞向肝细胞的定向分化，体细胞重编程后向肝细胞的定向分化似乎成为解决这一问题的有效手段。然而，定向分化产生的“肝细胞”功能是否正常，需要有好的肝损伤模型来检测，该模型最好是时空可调节的，可随时地且高效地诱导形成肝损伤。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种可用于制备时空可调性肝脏损伤模型的转基因构建物。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种时空可调性肝脏损伤模型及其制备方法。

[0008] 在本发明的第一方面，提供一种用于制备时空可调性肝脏损伤模型的构建物组合，其包括：

[0009] (1)构建物1，从5’至3’依次包括以下可操作性相连的元件：

[0010] 启动子，LoxP序列，报告基因序列，终止子1，LoxP序列，tBid基因序列，Bax基因序列，终止子2；和

[0011] (2)构建物2，从5’至3’依次包括以下可操作性相连的元件：

[0012] 启动子，突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列，Cre重组酶基因序列，和终止子；其中所述的突变型雌激素受体配体结合结构域可被雌激素类似物激活进而激活Cre重组酶活性，不被动物体内雌激素激活。

[0013] 在另一优选例中，所述的雌激素类似物选自：它莫西芬(Tamoxifen)，或4-羟它莫西芬(4-OH Tamoxifen，4-OHT)。

[0014] 在另一优选例中，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于小鼠雌激素受体；较佳的是小鼠雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号：NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)。

[0015] 在另一优选例中，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于人雌激素受体；较佳的是人的雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号：NM_000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突变为缬氨酸(V)、第543位甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、第544位亮氨酸(L)变为丙氨酸(A)。

[0016] 在另一优选例中，构建物1中，所述的报告基因是β-半乳糖苷酶基因。

[0017] 在另一优选例中，所述的报告基因3’端还连接有抗性基因序列；较佳的，所述的抗性基因是新霉素(Neomycin，Neo)抗性基因。

[0018] 在另一优选例中，构建物1中，所述的启动子是CAG(巨细胞病毒增强子，鸡β肌动蛋白和兔β球蛋白联合启动子)启动子；或构建物2中，所述的启动子是白蛋白(Alb)启动子。

[0019] 在另一优选例中，构建物1中，所述的终止子1是3×多聚A(3个PA串联而成)，或所述的终止子2是兔β球蛋白多聚A。

[0020] 在另一优选例中，构建物2中，所述的终止子是SV40多聚A。

[0021] 在另一优选例中，构建物2中，在所述的Cre重组酶基因和终止子之间，还含有一突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列。

[0022] 在另一优选例中，构建物1中，所述的tBid基因和Bax基因之间，还含有内部核糖体插入位点(IRES)序列。

[0023] 在本发明的第二方面，提供一种细胞(非生殖细胞)，所述的细胞的基因组中整合有所述的构建物1和构建物2。

[0024] 在另一优选例中，所述的细胞是肝细胞。

[0025] 在另一优选例中，正常情况下，所述的细胞表达报告基因编码的蛋白；当用雌激素类似物处理后，所述的细胞表达tBid蛋白和Bax蛋白。

[0026] 在本发明的第三方面，提供一种制备转基因非人哺乳动物受精卵的方法，所述的受精卵用于制备时空可调性肝脏损伤模型，所述方法包括：

[0027] 将所述的构建物1引入非人哺乳动物的受精卵，获得转入了所述构建物1的受精卵；或

[0028] 将所述的构建物2引入非人哺乳动物的受精卵，获得转入了所述构建物2的受精卵。

[0029] 在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠。

[0030] 在本发明的第四方面，提供一种制备时空可调性肝脏损伤模型的方法，所述方法包括：

[0031] (1)将所述的构建物1引入非人哺乳动物的受精卵，将转入了所述构建物的受精卵移入假孕非人哺乳动物的输卵管内，使之继续发育，生成基因组中整合有所述的构建物1的非人哺乳动物；

[0032] (2)将所述的构建物2引入非人哺乳动物的受精卵，将转入了所述构建物的受精卵移入假孕非人哺乳动物的输卵管内，使之继续发育，生成基因组中整合有所述的构建物2的非人哺乳动物；和

[0033] (3)使(1)和(2)获得的非人哺乳动物进行交配，获得基因组中整合有所述的构建物1和构建物2的非人哺乳动物。

[0034] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0035] 图1.利用FACS分析Caspase8，Bax，tBid基因或它们的组合诱导肝细胞凋亡的能力。

[0036] 图2.构建获得的转基因质粒pCALL2-tIB的结构示意图。

[0037] 图3.将携带Bax-IRES-tBid(tIB)、Bax-IRES-tBid(BIt)、tBid-IRES-EGFP(tIE)、Bax-IRES-EGFP(BIE)、IRES-EGFP(IE)或阴性对照的质粒分别与pAlbCreSVPA共转入LEPC中，通过观察浮于培养液中死亡的细胞检测细胞的凋亡情况。

[0038] 图4.PCR鉴定阳性的F1代小鼠。

[0039] 它们分别来自于7个首建者小鼠，M39：141-149；M40：151；F41：159-162；F42：163-168，248-250；F43：230-235；F44：237-245；F46：179-183。M即分子量标记D2000(天根公司)，NC为阴性对照。

[0040] 图5.9个小鼠品系肝脏组织RT-PCR结果。

[0041] wt是野生型阴性对照；Rosa26是Rosa26-βgal小鼠的阳性对照。29，149，161，168，183，234，238分别是7个首建者小鼠的F1代。首建者F41的161号和首建者F42的
168号后代显示出转基因的表达。GAPDH是内参，阳性对照。

[0042] 图6.首建者F42的后代250号转基因分别在肝脏、肾脏和小肠中的表达情况。通过X-gal染色可见转基因βgeo有表达。

[0043] 图7.pAlbMerCreMerSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共转入Hepal-6中，24小时后用4-OHT诱导。绿色荧光表达，说明MerCreMer发挥了活性，将共转入的质粒loxP中间的mRFP切掉，使下游的EGFP表达。

[0044] 图8.pAlbCreERSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共转入Hepal-6中，24小时后用4-OHT诱导。绿色荧光表达，说明CreER发挥了活性，将共转入的质粒loxP中间的mRFP切掉，使下游的EGFP表达。

[0045] 图9.PCR鉴定阳性的F0代小鼠。

[0046] 61个经过原核注射发育而来的小鼠中，通过针对Alb启动子和Cre酶的引物扩增，鉴定出有6只小鼠基因组整合有打靶序列，分别是2、3、6、8、31、37。

具体实施方式

[0047] 本发明人经过广泛的研究，找到了特别适合于高效诱导肝细胞凋亡的基因，构建了可选择性表达凋亡基因的构建物，从而建立了一种时空可调性的肝脏损伤非人动物模型。所述的非人动物模型在没有诱导的情况下不表达凋亡基因，而在诱导的情况下可异常高效地表达凋亡基因，从而可高效地、实时地诱导发生肝损伤(如肝功能衰竭)。

[0048] tBid基因和Bax基因

[0049] Bid蛋白即BH3interacting domain death agonist，是Bcl-2家族中的成员之一，含有一个BH3结构域，其分子质量(Mr)为22000Da。

[0050] tBid蛋白是截短的Bid蛋白，是Bid蛋白切去其N端约60个氨基酸而形成的Bid蛋白片段。tBid是一种细胞凋亡相关的蛋白，可诱导例如Hela细胞等一些细胞发生凋亡。

[0051] 本发明可用tBid的全长蛋白或其生物活性片段。任何一种tBid蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，tBid蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白片段，其仍然能保持完整的tBid蛋白的全部或部分功能(如至少80％的活性，更佳的至少90％的活性)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的tBid的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的tBid蛋白也具有与Bax协同促进肝细胞凋亡的功能。本发明也可采用经修饰或改良的tBid蛋白，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性而改良的tBid蛋白。

[0052] tBid的来源没有特别限制，可以是人、小鼠、大鼠、猪或其他哺乳动物的tBid。作为本发明的一种优选方式，所述的tBid的氨基酸序列可以与GenBank登录号为NM_007544所示的序列第319-729位基本上相同。优选的，可采用重组的tBid蛋白。在获得蛋白的序列后，本领域人员很容易得知编码所述tBid蛋白的DNA序列。

[0053] Bax基因广泛存在于哺乳动物的多种组织和细胞中，属于Bcl-2家族的成员，其参与一些肿瘤细胞的促凋亡作用。

[0054] 本发明可用Bax的全长蛋白或其生物活性片段。任何一种Bax蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Bax蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白片段，其仍然能保持完整的Bax蛋白的全部或部分功能(如至少80％的活性，更佳的至少90％的活性)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Bax的氨基酸序列也包括在本发明中。所述的经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Bax蛋白也具有与tBid协同促进肝细胞凋亡的功能。本发明也可采用经修饰或改良的Bax蛋白，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性而改良的Bax蛋白。

[0055] Bax的来源没有特别限制，可以是人、小鼠、大鼠、猪或其他哺乳动物的Bax。作为本发明的一种优选方式，所述的Bax的氨基酸序列可以与GenBank登录号为NM_007527所示的序列第124-702位基本上相同。优选的，可采用重组的Bax蛋白。在获得蛋白的序列后，本领域人员很容易得知编码所述Bax蛋白的DNA序列。

[0056] 转基因构建物

[0057] 一个好的动物肝损伤模型必须具备如下4个方面的特性：时空可诱导性，操作简单，肝损伤诱导效率高，容易保存和扩展。为了满足这些要求，最终获得适合的转基因构建物，本发明人构建了一对构建物。所述的构建物1从5’至3’依次包括以下可操作性相连的元件：启动子，LoxP序列，报告基因，终止子1，LoxP序列，tBid基因，Bax基因，终止子2；所述的构建物2包括以下可操作性相连的元件：启动子，突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列，Cre重组酶基因序列，和终止子；其中所述的突变型雌激素受体配体结合结构域可被雌激素类似物激活进而激活Cre重组酶活性，且不被动物体内雌激素激活。

[0058] 当两种构建物同时处于一个细胞系统中，在特定诱导条件下可激活Cre重组酶，从而进一步诱导LoxP位点之间发生重组，使得tBid和Bax基因表达，诱导细胞发生凋亡。

[0059] 时空可调性的实现基于Cre/loxP系统。本发明人使用了一种双标记表达框架，该框架的两端各包含一个同向LoxP序列，两个LoxP位点之间是可独立表达的报告基因和/或抗性筛选标记基因。当系统中存在Cre重组酶后，Cre重组酶能够识别LoxP位点而发生位点专一的重组，将两个LoxP位点之间的序列切除，从而下游tBid基因和Bax基因表达。

[0060] 而细胞中Cre重组酶的活性是通过突变型雌激素受体的配体结合结构域来调控。将突变型雌激素受体的配体结合结构域与Cre融合之后，Cre的活性受到突变型雌激素受体的配体结合结构域的调节。由于该结构域是经过突变改造的，它不响应小鼠自身激素的诱导，而对它莫西芬(Tamoxifen)等物质较为敏感(参见Logie and Stewart，1995，Ligand-regulated site-speific recombination.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：
5940-5944)。这样，突变型雌激素受体的配体结合结构域与Cre融合蛋白便受到Tamoxifen等的调节。

[0061] 可诱导突变型雌激素受体的配体结合结构域进而调节Cre活性的雌激素类似物包括：4-OHT、Tamoxifen。

[0062] 所述的突变型雌激素受体的配体结合结构域可以是来源于多种哺乳动物的。作为一种优选方式，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于小鼠雌激素受体；较佳的是小鼠雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号：NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)。

[0063] 作为另一种优选方式，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于人雌激素受体；较佳的是人的雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号：NM_000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突变为缬氨酸(V)、第543位甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、第544位亮氨酸(Leu)变为丙氨酸(A)。

[0064] 可用于本发明的启动子没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：MMTV LTR启动子、CMV启动子、唾液淀粉酶基因启动子等。作为本发明的优选方式，采用CAG(巨细胞病毒增强子，鸡β肌动蛋白和兔β球蛋白联合启动子)启动子作为构建物1的启动子，该启动子是一种泛表达的强启动子，能够驱动它的下游基因广泛表达，经验证具有良好的调控基因表达的作用。作为本发明的优选方式，使用Alb启动子指导突变型雌激素受体的配体结合结构域与Cre融合基因的表达，这样有利于使得该融合基因在肝脏中特异性表达。当所述融合基因发生表达，Cre重组酶发挥活性，从而诱导凋亡基因tBid和Bax的表达，引起组织损伤。

[0065] 作为本发明的优选方式，在融合表达时，在Cre重组酶基因的5’端和3’端分别与一个突变型雌激素受体的配体结合结构域基因相连接，即构成MER-Cre-MER的结构。经过本发明人的实验比较发现，MER-Cre-MER型的融合基因具有以下特点：在没有诱导的情况下活性关闭更严，在有诱导的情况下诱导效率更高。

[0066] 可用于本发明的终止子没有特别限制，任何适合的具有可终止基因表达功能的终止子均是可用的。作为本发明的一种方式，构建物1中，所述的终止子1是3×多聚A，所述的终止子2是兔β球蛋白多聚A；构建物2中，所述的终止子是SV40多聚A。

[0067] 本发明所述的各元件之间是可操作性相连的，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

[0068] 所述的各元件之间可具有适当的间隔序列，例如具有0-1000bp，较佳的0-500bp的间隔序列。

[0069] 如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

[0070] 动物模型的制备

[0071] 在获得了所述的转基因构建物之后，可用常规方法将线性化的构建物转入受精卵中。待子代动物出生后可用本领域已知的多种方法(包括但不限于PCR检测、Southern印迹法等方法)鉴定转基因构建物是否整合入其基因组，从而获得转基因的动物。

[0072] 因此，本发明还提供了一种制备时空可调性肝脏损伤模型的方法，所述方法包括：(1)将权利要求1所述的构建物1引入非人哺乳动物的受精卵，将转入了所述构建物的受精卵移入假孕非人哺乳动物的输卵管内，使之继续发育，生成基因组中整合有权利要求1所述的构建物1的非人哺乳动物；(2)将权利要求1所述的构建物2引入非人哺乳动物的受精卵，将转入了所述构建物的受精卵移入假孕非人哺乳动物的输卵管内，使之继续发育，生成基因组中整合有权利要求1所述的构建物2的非人哺乳动物；和(3)使(1)和(2)获得的非人哺乳动物进行交配，获得基因组中整合有权利要求1所述的构建物1和构建物2的非人哺乳动物。

[0073] 为了得到遗传稳定的后代，作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：(4)将(3)获得的转基因非人哺乳动物与(3)获得的非人哺乳动物交配，获得基因组中整合有所述的构建物的后代非人哺乳动物。

[0074] 本发明所述的非人哺乳动物可以为鼠、羊、牛、猪、兔等。优选的是鼠，包括小鼠、大鼠或其它类型的鼠。

[0075] 本发明的时空可调性肝脏损伤模型的主要用途包括但不限于：肝损伤的预防研究，肝细胞移植的效果分析，肝脏再殖的效果分析等。

[0076] 一种利用本发明的时空可调性肝脏损伤模型来分析待测肝细胞移植效果的方法是：(1)将雌激素类似物(如Tamoxifen或4-OHT)给予前述获得的基因组中整合有权利要求1所述的构建物1和构建物2的非人哺乳动物，激活Cre重组酶，Cre重组酶进一步诱导构建物1的LoxP位点之间发生重组，使得loxP之间的序列被切掉，导致tBid和Bax基因表达，诱导细胞发生凋亡，从而形成动物肝损伤模型；(2)将待测肝细胞移植到动物的肝脏，观察移植后肝脏的情况，从而得知待测肝细胞移植效果。

[0077] 分析待测肝细胞移植效果或肝脏再殖效果的方法是本领域已知的技术，例如可通过免疫组织化学的方法。

[0078] 本发明的主要优点在于：

[0079] (1)本发明人找到了特别适合于诱导肝细胞凋亡的基因组合，其可发挥高效的诱导肝细胞凋亡作用。

[0080] (2)本发明人构建了可选择性表达凋亡基因的时空可控性构建物，从而建立了时空可调性的肝脏损伤非人动物模型。所述动物模型可随时地、高效地诱导肝损伤，为肝细胞移植、肝脏再殖的研究提供了有效的途径。因此，本发明人建立了一种新的方法来诱导组织损伤。

[0081] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0082] I.材料

[0083] 1.质粒与菌株

[0084] 转基因载体pCALL2获自加拿大Samuel Lunenfeld研究所；

[0085] pIRES2-EGFP质粒和pEGFP-N2购自Clontech公司；

[0086] pMD18T-simple质粒购自Takara公司；

[0087] pET28a质粒购自Novagen；

[0088] pcDNA3和pcDNA3.1/Hygro(-)购自Invitrogen公司。

[0089] 2.工具酶与试剂

[0090] 限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；

[0091] dNTP、Hifi Taq Platinum、Trizol、RT-PCR kit购自Invitrogen；

[0092] Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、X-gal购自天根公司；

[0093] DNA小量快速抽提试剂盒购自博大泰克公司；

[0094] 胶回收试剂盒购自捷瑞公司；

[0095] QIAprep Maxprep Kit购自Qiagen公司。

[0096] Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I购自BD Biosciences公司。

[0097] 转染试剂Effectene购自Qiagen公司。

[0098] II.实施例

[0099] 实施例1.确定最适合于诱导肝细胞凋亡的基因

[0100] 已知有多种基因可诱导细胞凋亡，本实施例中首先选择最适合于诱导肝细胞凋亡的基因。

[0101] 用常规的FACS的方法，对三个基因Caspase8，Bax，tBid诱导肝细胞凋亡能力进行比较，确定最适合的基因。将Caspase8，Bax，和tBid分别克隆到载体pcDNA3.1(购自Invitrogen)中。以小鼠肝脏cDNA作为模板，引物序列分别是(上游引物设置Eco RI位点，下游引物设置XhoI位点)：

[0102] Caspase8F(SEQ ID NO：2)：

[0103] CTCTGAATTCCCATGGATTTCCAGAGTTGTCTTTATGC；

[0104] Caspase8R(SEQ ID NO：3)：

[0105] GCACCTCGAGTTAGGGAGGGAAGAAGAGCTTCTT；

[0106] Bax F(SEQ ID NO：4)：

[0107] GCAGGAATTCCCATGGACGGGTCCGGGGAG；

[0108] Bax R(SEQ ID NO：5)：

[0109] GTGGCTCGAGTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGG；

[0110] tBid F(SEQ ID NO：6)：

[0111] ATATGAATTCGCATGGGCAGCCAGGCCAGCC；

[0112] tBid R(SEQ ID NO：7)：

[0113] GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG；

[0114] 将携带Caspase8，Bax或tBid的载体单独转染入LEPC细胞(小鼠成体双能肝干细胞；来自上海第二军医大学；可参见Li WL等，2006，Isolation andcharacterization of bipotent liver progenitor cells from adult mouse.Stem Cells.24：322-332)中，或者将携带Bax的载体和携带tBid的载体。FACS检测结果见图1，由结果可见，单独转染中，tBid促凋亡的能力最强，Bax次之，Caspase最弱。而共转Bax和tBid时，促凋亡的能力最强。

[0115] 可见，对于肝细胞而言，Bax和tBid共同表达的促凋亡作用最强。

[0116] 实施例2.转基因载体构建

[0117] 用PCR的方法从小鼠肝脏cDNA中扩增tBid和Bax基因，并将它们连接到pMD18T-simple载体中。

[0118] 引物序列如下：

[0119] tBid F(SEQ ID NO：8)：

[0120] 5’-ATATAGATCTACCATGGGCAGCCAGGCCA-3’；

[0121] tBid R(SEQ ID NO：7)：

[0122] 5’-GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG-3’；

[0123] Bax F(SEQ ID NO：9)：

[0124] 5’-ATATAGATCTACCATGGACGGGTCCGGG-3’；

[0125] Bax R(SEQ ID NO：5)：

[0126] 5’-GTGGCTCGAGTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGG-3’。

[0127] PCR扩增条件分别如下：

[0128] tBid：首先94℃，5min；然后94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；30个循环；最后72℃，10min。

[0129] Bax：首先94℃，5min；然后94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环；最后72℃，10min。

[0130] 用BglII和NcoI将IRES序列从pIRES2-EGFP中切下来，连接到pET28a中相应的位点，得到pET28a-IRES；接着用PCR的方法，从肝脏cDNA中扩增出Bax和tBid并分别插入pMD18T-simple载体中，得到pMD18T-Bax和pMD18T-tBid，测序结果正确后，用NcoI和XhoI将Bax从pMD18T-Bax中切下来，连接到pET28a-IRES相应位点，得到pET28a-IRES-Bax；再用BglII和XhoI将tBid从pMD18T-tBid中切下来，连接到pET28a-IRES-Bax的BglII和SalI之间，得到pET28a-tBid-IRES-Bax，简称pET28a-tIB。接下来用BglII和XhoI将tIB切下来，连接到pCALL2中相应位点，得到质粒pCALL2-tIB。PCR产物回收、DNA片段回收、质粒抽提按博大泰克说明书操作，酶切与连接按NEB酶的操作说明进行。

[0131] 转基因质粒pCALL2-tIB构建完成后，其共包含7个关键部分：能够驱动基因广泛表达的强启动子CAG，loxP序列，βgeo基因的编码框，3×polyA(终止子)，与前一个loxP同向的loxP序列，基因tIB，兔β球蛋白polyA，共9.5kb，其结构如图2所示。测序表明完全正确。pCALL2-tIB质粒的全长序列如SEQ IDNO：1所示。

[0132] 基于与前述类似的方法，本发明人还构建了携带Bax-IRES-tBid(BIt)的pCALL2-BIt质粒，该质粒中Bax和tBid的串联方式不同于pCALL2-tIB质粒。

[0133] 本发明人同时还构建含有IRES-EGFP(IE)的质粒，以及基于单独的凋亡基因构建分别含有Bax-IRES-EGFP(BIE)和tBid-IRES-EGFP(tIE)的质粒。具体的构建方法如下：

[0134] 对于pCALL2-BIt，用NcoI和XhoI将tBid从pMD18T-tBid中切下来，连接到pET28a-IRES相应位点，得到pET28a-IRES-tBid；再用Bgl II和Xho I将Bax从pMD18T-Bax中切下来，连接到pET28a-IRES-tBid的Bgl II和Sal I之间，得到pET28a-Bax-IRES-tBid，简称pET28a-BIt。接下来用Bgl II和Xho I将BIt切下来，连接到pCALL2中相应位点，得到质粒pCALL2-BIt。

[0135] 对于pCALL2-tIE，用Bgl II和Xho I将tBid从pMD18T-tBid中切下来，连接到pIRES2-EGFP载体中Bgl II和Sal I之间，得到ptBid-IRES-EGFP，简称ptIE，然后用Bgl II和Not I将tIE切下来，连接到pCALL2相应的位点，即得到pCALL2-tIE。

[0136] 对于pCALL2-BIE，用Bgl II和Xho I将Bax从pMD18T-Bax中切下来，连接到pIRES2-EGFP载体中Bgl II和Sal I之间，得到pBax-IRES-EGFP，简称pBIE，然后用Bgl II和Not I将BIE切下来，连接到pCALL2相应的位点，即得到pCALL2-BIE。

[0137] 对于pCALL2-IE，则直接用Bgl II和Not I将IRES-EGFP从pIRES2-EGFP中切下来，连接到pCALL2相应的位点，得到pCALL2-IE。

[0138] 将这些质粒分别与pAlbCreSVPA共转入LEPC中，通过观察死亡细胞悬浮来检测细胞的凋亡情况。结果发现，pCALL2-tIB促凋亡的能力显著比pCALL2-BIt强；同时表达两个凋亡基因的比表达一个基因的促凋亡能力强；表达凋亡基因的比不表达凋亡基因的促凋亡能力强，如图3所示。pCALL2-tIB质粒的全序列如SEQ ID NO：1所示，共11323bp。

[0139] 因此，本发明人选用了pCALL2-tIB质粒，将其线性化，注射到小鼠受精卵中，制备了tIB转基因小鼠，用于条件诱导组织细胞凋亡。

[0140] 实施例3.受精卵显微注射和转基因小鼠鉴定

[0141] 用ScaI和SfiI将前述构建的质粒pCALL2-tIB切开，回收包含上述7个元件的9.5kb的条带，去除无关片段，最后将该片段稀释至2-5ng/μL，按常规进行受精卵显微注射。然后将接受DNA的受精卵移植到受体假孕母鼠输卵管内，使之继续发育，最后分娩获得子代小鼠。

[0142] 通过PCR的方法对出生的后代作基因型鉴定，取出生后约30天的小鼠0.5-1cm尾尖置于1.5mL离心管中，加入260μL组织裂解液[50μL10％SDS，10μL20mg/mL蛋白酶K，200μL NLB(10mM Tris-HCl，pH8.2；400mM NaCl；1mM EDTA，pH8.0)]于55℃过夜裂解。向裂解完全的样品中加入50μL饱和NaCl，颠倒混匀，8000rpm于4℃离心15min。上清与200μL异丙醇混合，室温13200rpm离心15min，沉淀用70％乙醇洗涤一次，风干，最后用100μL的TE溶解。

[0143] 基因型鉴定的引物如下：

[0144] βgal-F(SEQ ID NO：10)：

[0145] 5’-GTGACGTCTCGTTGCTGCATAAAC-3’；

[0146] βgal-F(SEQ ID NO：11)：

[0147] 5’-CACGGCGTTAAAGTTGTTCTGCT-3’；

[0148] Bax-F(SEQ ID NO：12)：

[0149] 5’-GAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCC-3’；

[0150] Bax-R(SEQ ID NO：13)：

[0151] 5’-TTTGGCAGAGGGAAAAAGATCG-3’；

[0152] CD34enh-F(SEQ ID NO：14)：

[0153] 5’-ACGCGTGAGTGGTCTGGATCCAAACTGAGTG-3’；

[0154] CD34enh-R(SEQ ID NO：15)：

[0155] 5’-AAGCTTAGCTATAATGCAACCAGAATATAAAGCAT-3’。

[0156] PCR扩增条件分别如下：

[0157] βgal：首先94℃，2min；然后94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；进行28个循环；最后72℃，10min。

[0158] Bax：首先94℃，2min；然后94℃，30s；57℃，30s；72℃，35s；进行28个循环；最后72℃，10min。

[0159] CD34enhancer：首先94℃，2min；然后94℃，30s；58℃，30s；72℃，50s；进行28个循环；最后72℃，10min。

[0160] 结果，共得到11个转基因首建者(F0代)，初步鉴定它们的基因组上有整合的阳性小鼠。将这些首建者小鼠分别与野生型小鼠交配，后代F1携带转基因(图4)。

[0161] 实施例4.转基因小鼠肝脏表达RT-PCR检测

[0162] 11个首建者小鼠分别与野生型小鼠交配建系。继续通过PCR的方法鉴定基因组上携带转基因的F1代小鼠。

[0163] 选取其中7个首建者后代，加上野生型的阴性对照和Rosa26-βgal阳性对照共9只小鼠，取其肝脏，液氮速冻小鼠新鲜肝脏，研磨成粉末，立即用Trizol裂解细胞RNA的提取，RNA的提取，RT-PCR过程按照Invitrogen相应的说明书进行。同时取其尾尖用于抽基因组DNA。βgal的扩增与前相同。

[0164] 9个小鼠品系肝脏组织RT-PCR结果如图5所示，RT-PCR结果显示其中两个首建者后代有转基因的表达，分别是首建者F41的161号和首建者F42的168号后代。

[0165] 实施例5.X-gal检测组织转基因表达

[0166] 取经过RT-PCR表明转基因有表达的首建者后代(F42的后代250号)，对其肝脏、肾脏和小肠进行X-gal染色。将器官置于固定液中(1％甲醛，0.2％戊二醛，0.02％NP-40于PBS中)4℃固定4小时，然后用PBS室温洗涤2次，每次20分钟，接着将器官至于染色液中(5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，0.01％过氧胆酸钠，0.02％NP-40，2mM氯化镁，1mg/mL X-gal于PBS中)，室温染色过夜。

[0167] X-gal染色结果见图6，可以看到这些器官都有转基因的表达，因此可以确定该转基因小鼠有转基因的正常表达，本发明人将该小鼠称为tIB小鼠，能够用于后续实验。

[0168] 实施例6.肝脏特异表达的可诱导Cre酶小鼠的构建

[0169] 对于在肝脏里面特异表达的可诱导Cre酶小鼠的构建，用Xho I和Afl II将pIRES2-EGFP(Clontech)和pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)切开，并将前者中约1.6kb含polyA的片段插入后者中，得到pcDNA3.1-SVPA/Hygro(-)。接着，用Mlu I和Xho I将Alb启动子从pGEMAlbSVPA(参见Goshi Shiota等，1990，Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：5940-5944.89：373-377)中切下来，插入pcDNA3.1-SVPA/Hygro(-)中相应的位点，得到pAlb(Old)-SVPA/Hygro(-)。为了将Alb启动子后面的ATG去掉，用常规PCR的方法，扩增启动子最后0.5kb片断，PCR产物用Bam HI和Xho I酶切后，替换掉pAlb(Old)-SVPA/Hygro(-)中相应片断，得到pAlbSVPA/Hygro(-)。然后，用常规PCR的方法从pANMerCreMer(Zhang等，1996；Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stemcells.Nucleic Acids Research.24：543-548)中将Cre的序列扩增出来(以Cre F1和Cre R作为引物)，连接到pMD-18T simple vector中，测序正确之后，用XhoI和NotI将Cre连接到pAlb-SVPA/Hygro(-)中相应位点，得到pAlbCreSVPA。用Asc I和Sac I将CreER从pBS-CreLBD(购自中国科学院上海模式动物中心)切下来，在相同的位点把pAlbCreSVPA中的Cre替换下来，得到pAlbCreERSVPA。

[0170] 此外，本发明 人还构建了 pAlbMerCreMerSVPA，用PCR的方法将 Cre从pANMerCreMer中扩增出来(以Cre F2和Cre R作为引物)，连接到pMD-18T simplevector，得到T-Cre。接下来，将pANMerCreMer用SacI酶切，回收4.4kb的片段，然后将这4.4kb的片段用NcoI部分酶切的方法酶切，回收约3kb的片段，并将其插入T-Cre相应位点，得到T-MerCreMer。用AscI和SacI将MerCreMer从T-MerCreMer切下来，在相同位点替换掉pAlbCreSVPA中的Cre，得到pAlbMerCreMerSVPA。

[0171] 由于pAlbCreERSVPA和pAlbMerCreMerSVPA中都含有可诱导的Cre，本发明人比较了一下CreER和MerCreMer，看哪一个在没有诱导的条件下本底活性低，而经受诱导的效率更高。

[0172] 本 发 明 人 将 pAlbCreERSVPA 和 pAlbMerCreMerSVPA 分 别 和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共转入肝癌细胞系Hepal-6(购自中科院生化细胞所细胞库)中，转染24小时后，分别用1μM的4-OHT诱导。从绿色荧光表达来看，在没有诱导的情况下，MerCreMer活性关闭的更严，而用4-OHT诱导后，MerCreMer诱导效率更高，见图7和图
8。因此本发明人选择了pAlbMerCreMerSVPA质粒去制备转基因小鼠。

[0173] 引物序列：

[0174] Cre F1(SEQ ID NO：16)：

[0175] TATACTCGAGGCGCGCCACCATGCCCAAGAAGAAGAGG

[0176] Cre F2(SEQ ID NO：17)：

[0177] TATACTCGAGGCGCGCCACCATGGCCAAGAAGAAGAGG

[0178] Cre R(SEQ ID NO：18)：

[0179] ATATGCGGCCGCGAGCTCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG

[0180] Alb pro F(SEQ ID NO：19)：

[0181] ATATGGATCCATGGGGTTGATTTGGATGTAG

[0182] Alb pro R(SEQ ID NO：20)：

[0183] CAGTCTCGAGGGAAAGGTGATCTGTGTGCA

[0184] PCR扩增条件分别如下：

[0185] Cre：首先，94℃，2min；然后，94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；20个循环；最后，72℃，10min。

[0186] Alb启动子：首先，94℃，2min，然后，94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；20个循环；最后，72℃，10min。

[0187] pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP的构建方法如下：

[0188] 用 常 规 PCR 的 方 法 从 pDB587( 参 见 M.Fischer et al.，2004，A brilliantmonomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics inDictyostelium.FEBS Letters.577：227-232)中将mRFP扩增出来，PCR产物用ClaI和BclI酶切，并替换掉pCALL2的Cla I和Bcl I之间的序列，得到pCAG-loxP-mRFP-loxP。然后用Bam HI和Not I将pEGFP-N2中的EGFP序列切下来，并插入pCAG-loxP-mRFP-loxP中Bgl II和Not I之间，得到pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP。

[0189] 引物序列：

[0190] mRFP F(SEQ ID NO：21)：

[0191] ATCGATACCATGGCCAGCTCCGAG

[0192] mRFP R(SEQ ID NO：22)：

[0193] TGATCATTAGCTTCCAGCGCCTGTGC

[0194] PCR扩增条件如下：

[0195] 首先，94℃，2min；然后，94℃，30s；55℃，30s；72℃，45s；20个循环；最后，72℃，10min。

[0196] 本发明人将pAlbMerCreMerSVPA用Mlu I和Pme I切开，回收含有Alb启动子，MerCreMer基因和SV40polyA的6.1kb的片段，用于对受精卵进行原核注射。将注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宫内，以完成胚胎发育。F0代小鼠出生后一个月，抽鼠尾DNA进行基因组鉴定，选择基因组上整合了片段的阳性小鼠。

[0197] 鉴定所用的引物序列如下：

[0198] Alb Enh/Pro GT-F(SEQ ID NO：23)：

[0199] GCTGATGCAGAGTGAAGAGTGTGTGA；

[0200] Alb Enh/Pro GT-R(SEQ ID NO：24)：

[0201] GGCATGGAAGCATGCCACATT；

[0202] Cre GT-F(SEQ ID NO：25)：

[0203] GAGCATACCTGGAAAATGCTTCTGT；

[0204] Cre GT-R(SEQ ID NO：26)：

[0205] CCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACA；

[0206] CD34enh-F(SEQ ID NO：14)：

[0207] 5’-ACGCGTGAGTGGTCTGGATCCAAACTGAGTG-3’；

[0208] CD34enh-R(SEQ ID NO：15)：

[0209] 5’-AAGCTTAGCTATAATGCAACCAGAATATAAAGCAT-3’。

[0210] PCR扩增条件如下：

[0211] Alb Enh/Pro，94℃，2min；94℃，30s；59℃，30s；72℃，30s；35个循环；72℃，10min。Cre，94℃，2min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；28个循环；72℃，10min。

[0212] CD34enhancer，94℃，2min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，50s；28个循环；72℃，10min。

[0213] 结果如图9，结果共得到7个阳性首建系(F0代)。

[0214] 接下来，将7个首建系分别与C57野生型小鼠杂交，获得了F1代小鼠。在F1代小鼠中，通过抽鼠尾DNA鉴定基因组整合为阳性的子代。

[0215] 选择阳性的子代小鼠，通过Western blot和RT-PCR的方法，选择表达水平较高的首建系，培育出纯合的MerCreMer转基因小鼠，称为MCM小鼠，与前述制备的纯合的tIB小鼠杂交，以得到双转基因小鼠MCM/tIB。

[0216] 6-8周左右的MCM/tIB小鼠通过腹部注射4-OHT，1mg/天，连续注射5天。从第6天开始连续取5天肝组织，通过TUNEL检测肝脏发生凋亡的情况。确定时空可调地诱导肝脏细胞凋亡，有效地引发了肝损伤。

[0217] 本发明人从所得到的小鼠的肝中提取肝细胞，该种肝细胞的基因组中含有MerCreMer构建物以及tIB构建物，该细胞可体外培养和繁殖。

[0218] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0219] 序列表

[0220] <110>中国科学院上海生命科学研究院

[0221] <120>转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用

[0222] <130>085115

[0223] <160>26

[0224] <170>PatentIn version3.3

[0225] <210>1

[0226] <211>11323

[0227] <212>DNA

[0228] <213>人工序列

[0229] <221>misc_feature

[0230] <223>重组载体

[0231] <400>1

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[0423] <211>25

[0424] <212>DNA

[0425] <213>人工序列

[0426] <221>misc_feature

[0427] <223>引物

[0428] <400>25

[0429]

[0430] <210>26

[0431] <211>24

[0432] <212>DNA

[0433] <213>人工序列

[0434] <221>misc_feature

[0435] <223>引物

[0436] <400>26

[0437]