一种能产丙烯酸的纤维化纤维菌

摘要

本发明公开了一种从奶牛场的排水沟土壤分离筛选出来的能产丙烯酸的CZ-2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209039，该菌株幼龄菌体呈细长不规则杆状，衰老菌体呈球状；革兰氏阳性，不生孢，不抗酸；兼性厌氧；在蛋白胨-酵母膏琼脂上为凸起的黄色菌落，经形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列分析鉴定，该菌株属于纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)，实验室制取丙烯酸得率达到5mmol/L，应用前景广阔。

权利要求

1.一种能产丙烯酸的菌株，其特征在于其分类命名为纤维化纤维菌(Cellulosimicrobiumcellulans)，菌株号CZ-2，从奶牛场排水沟土壤中分离而得，保藏在湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2009年3月16日，保藏编号为CCTCC NO：M209039。

2.权利要求1所述的菌株在制取丙烯酸中的应用。

说明书

一种能产丙烯酸的纤维化纤维菌

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及从自然界污染点筛选、分离、纯化得到能产丙烯酸的纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)。

背景技术

[0002] 丙烯酸是一种重要的平台化合物，是工业生产中重要的不饱和有机酸，可用于生产众多的聚合衍生物，是重要的有机化工原料。主要用途是生产丙烯酸酯类、聚丙烯酸及其盐，被广泛用于粘合剂、涂料、化纤、皮革、造纸、纺织工业和光敏树脂板等。近10年来，我国丙烯酸工业发展很快，但仍不能满足迅速增长的市场需求。国内丙烯酸自给率还存在很大缺口，并且这种缺口仍在不断地扩大。丙烯酸及其酯类的生产方法主要有氰乙醇法、雷普(REPPE)法(羰基合成法)、烯酮法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法，前4种工艺因技术和经济原因已经逐步被淘汰。丙烯氧化法采用丙烯在催化剂作用下被空气氧化成丙烯酸，在丙烯酸及酯的生产方法中占据了主导地位。

[0003] 然而随着价格疯狂上涨的石油资源的日益枯竭，以不可再生资源石油为原料生产丙烯酸显然不是我们的长远之计。因此，在自然界中微生物众多，在其中寻找能够产丙烯酸的微生物是可行的。目前，在Clostridium propionicum和Megaphaera elsdenii两株菌中都发现了该代谢反应途径，它利用乳酸为底物，在胞内乳酰CoA脱水酶的作用下脱去一个水分子，得到丙烯酸盐，并且有少量积累丙烯酸。因而利用微生物法生产丙烯酸适应社会可持续发展的要求，有可能替代目前利用石油化学品生产丙烯酸的方法，有利于能源的合理利用。但是直接由乳酸发酵积累丙烯酸的浓度较低，目前发现极少超过1.3mmol/L。同时，C.propionicum，M.elsdenii的生长代谢均要求严格的厌氧条件，其丙烯酸代谢途径中的关键酶对O2也非常敏感，由此给人们在改造其用以生产丙烯酸的过程中带来了巨大的阻力。

[0004] 因而，寻找能够新的能够产丙烯酸的菌株的微生物就显得非常有意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是从自然环境中分离筛选出一株新的能够产丙烯酸的菌株，为丙烯酸的生产制备提供一种新的可利用的微生物，以缓解利用不可再生资源石油为原料生产丙烯酸的局限。

[0006] 本发明是这样实现的：

[0007] 申请人从位于广西壮族自治区南宁市的广西大学奶牛场的排水沟土壤中分离得到一株能够产丙烯酸的CZ-2菌株；经形态观察、生理生化和16S rDNA鉴定，CZ-2菌株在分类学上属于纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)，申请人于2009年3月16日将该菌株保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO：M 209039。

[0008] CZ-2菌株幼龄菌体呈细长不规则杆状，衰老菌体呈球状；革兰氏阳性，不生孢，不抗酸；兼性厌氧；在蛋白胨-酵母膏琼脂上为凸起的黄色菌落。

[0009] CZ-2菌株为兼性厌氧菌，能够在温度-20℃～50℃、pH值为4.5～9.0的环境中存活，酒精耐受度达到酒精体积比的6-8％，适宜生长温度为20℃～40℃，适宜pH值为6.0～8.0。

[0010] CZ-2菌株16S rDNA序列具有序列表1所示的核酸序列，与纤维化纤维菌同源性在97％以上。

[0011] 本发明具有的突出的实质性特点和显著的进步是：

[0012] 1、从自然界中成功分离筛选出了一种能生产丙烯酸的新的菌株，拓宽了利用微生物制备丙烯酸的菌种选择种类，有利于推进现有利用不可再生的石化资源制备丙烯酸的技术变革。

[0013] 2、本发明利用实验室手段成功的对CZ-2新菌株制取丙烯酸的技术进行了有益的探索和试验，丙烯酸得率明显高于现有其它菌株的制取得率，技术进步效果显著，应用前景广阔。

附图说明

[0014] 图1为CZ-2的16S rDNA序列系统发育树。

[0015] 图2为丙烯酸标样气相色谱图。丙烯酸标样的出峰时间为6.009分钟。

[0016] 图3为CZ-2细胞提取物的气相色谱图。第三个色谱峰的出峰时间为6.005分钟，与附图2中丙烯酸标样的出峰时间基本一致，这表明CZ-2细胞提取物中可能存在丙烯酸，要判断该峰是丙烯酸需要通过气质色谱进一步加以证明。

[0017] 图4为丙烯酸标样气质色谱图。丙烯酸标样的出峰时间为3.480分钟。

[0018] 图5为丙烯酸标样质谱分析特征谱图。图中横坐标为质荷比(m/z)，纵坐标为信号强度。

[0019] 图6为CZ-2细胞提取物的气质色谱出峰图。第三个色谱峰的出峰时间为3.458分钟，与附图4中丙烯酸标样的出峰时间基本一致。

[0020] 图7为附图6中第三个峰的质谱分析特征谱图。图中横坐标为质荷比(m/z)，纵坐标为信号强度。由图中可以看到图7中的物质特征峰与图5中标样的特征峰一致，这表明CZ-2细胞提取物中确实包含有丙烯酸。

[0021] 保藏信息说明

[0022] 一种纤维化纤维菌Cellulosimicrobium cellulans CZ-2目前保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2009年3月16日，保藏编号为CCTCC NO：M209039。

具体实施方式

[0023] 实施例1：菌株CZ-2的分离、筛选与鉴定

[0024] 第一步：采样

[0025] 从广西大学奶牛场的排水沟采集土样和水样。

[0026] 第二步：初筛

[0027] 配制以丙烯酸为碳源并含多种矿物质的液体合成培养基，将污染土壤加入到合成培养基中，其中能够利用丙烯酸生长的细菌将大量繁殖，将其反复进行传代培养5～10次，依据传代培养的混合菌对丙烯酸的利用能力确定进一步进行菌株分离纯化的对象。具体步骤如下：

[0028] 配制丙烯酸浓度为20mmol/L的液体合成培养基，培养基中矿物盐组成相同，各组分配比为：NH4Cl 1.5g/L，Na2HPO46g/L，KH2PO43g/L，NaCl 1.0g/L，CaCl20.05mmol/L，MgSO410mmol/L，pH7.5-8.0。将从不同污染点采到的土壤样品各取1克，分别加入到50毫升的初筛培养基中，在37℃，200转/分的摇床中培养2-4天，再取菌悬液1毫升，加入到50毫升的初筛培养基中，在相同条件下进行传代培养。传代培养5～10次，其中能够大量繁殖的菌株均能够利用丙烯酸作为碳源。

[0029] 第三步：复筛

[0030] 配制丙烯酸培养基，培养基成分与第二步相同，但丙烯酸的浓度逐步由20mmol/L提高至100mmol/L，且在其中加入10-15g/L的琼脂，使其成为固体培养基并在表面皿中铺成固体平板，将第二步传代后得到的混合菌悬液直接涂布平板，培养温度为37℃，培养时间为3-7天。

[0031] 第四步：分离纯化

[0032] 从第三步的复筛培养基中获得18个单菌落，有部分单菌落形态一致，分别挑取各个单菌落，使用相同成分的液体培养基分别进行传代培养。通过形态观察以及16S rDNA结果从18株菌株中鉴定获得3株不同种属的细菌，利用气相色谱对这3株细菌的发酵产物进行测定时发现有1株细菌可能代谢产生丙烯酸，该菌株编号为CZ-2，后经质谱确认该菌株确实能够产丙烯酸。

[0033] 第五步：鉴定

[0034] 形态特征：菌株CZ-2幼龄菌体呈细长不规则杆状，衰老菌体呈球状；革兰氏阳性，不生孢，不抗酸；兼性厌氧；在蛋白胨-酵母膏琼脂上为凸起的黄色菌落。

[0035] 生理生化特征：

[0036]L-阿拉伯糖 + 纤维二糖 + 甘油 - 菊糖 +
甘露糖 + 松三糖 - 蜜二糖 - 棉籽糖 +
L-鼠李糖 - 山梨醇 - D-核糖 +
接触酶 + 纤维素分解 + 硝酸盐还原 + 酪素水解 +
运动性 - 脲酶 + 明胶水解 + 35℃生长 +

[0037] (注：表中“+”为阳性，“-”为阴性)

[0038] 序列分析：

[0039] 菌株CZ-2与相关种的16S rDNA序列系统发育树如附图1所示。

[0040] 综 上，该 菌 株 CZ-2形 态 学、生 理 生 化 特 征 符 合 纤 维 微 杆 菌 属(cellulosimicrobium)特征，且最接近纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)，且序列分析表明，菌株CZ-2与纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)同源性在97％以上。由此鉴定，菌株CZ-2属纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)。

[0041] 实施例2菌株CZ-2代谢丙烯酸气相色谱-质谱检测

[0042] 1、气相色谱检测

[0043] 标样制取：将菌株接种于含有10ml培养基(酵母粉1.5g/L，蛋白胨3g/L，NH4Cl 1.0g/L，乳酸60mmol/L，Na2HPO46g/L，KH2PO43g/l，NaCl 1.0g/L，CaCl20.05mmol/L，MgSO410mmol/L，pH7.0)的直型瓶中，于37℃条件下，培养48小时。收集50ml发酵液的菌体沉淀，将沉淀重悬于10ml的发酵液中，置于冰上预冷5分钟，用JY92-II型超声波细胞破碎仪在功率为300W时破胞10分钟，利用高速冷冻离心机在12000r/pm条件下高速离心15分钟，收集上清液作为气相色谱分析的样品。标样是用超纯水稀释的浓度为100mmol/L的丙烯酸(Sigma公司分析纯产品)。

[0044] 色谱仪：Agilent6890+型高效气相色谱仪(美国)；

[0045] 色谱柱：毛细管气相色谱柱，型号为INNOWAX柱，内径 直径0.32mm，长度30.0m.；

[0046] 分析条件：进样量1ul，进样口温度200℃，柱温以10℃/分钟由90℃逐级升温至140℃后恒温4min，检测器温度为250℃，载气为纯度为99.99％的高纯氮气；

[0047] 实验结果：对标样进行气相色谱分析，如附图2、3所示，从CZ-2细胞提取物中检测到丙烯酸，浓度约为1.5～5mmol/L。

[0048] 2、气质色谱检测

[0049] 标样制取：用于气质色谱分析的标样和样品的制备方法与用于气相色谱检测所用的标样和制备方法相同。

[0050] 气质色谱仪：GC-MS/QP5050A型气质色谱仪(日本岛津)；

[0051] 色谱柱：DB-1非极性色谱柱，型号：30米×0.2mm×0.25μm；

[0052] 质谱条件：分析时间10分钟，标准品定量，进样1μL，不分流进样。程序升温，初始柱温为90℃，以10℃/min的速度逐级升温至140℃，进样口和检测器温度分别是200℃和250℃，载气：纯度为99.99％的高纯氦气；

[0053] 实验结果：对相应的色谱峰进行质谱分析，如附图4、5、6、7所示，CZ-2菌株的细胞提取物中有丙烯酸存在。

[0054] 检测结论：经气相色谱-质谱检测发现菌株CZ-2具有产丙烯酸的能力。

[0055] 序列表

[0056] <110>广西科学院

[0057] <120>一种能产丙烯酸的纤维化纤维菌

[0058] <160>1

[0059] <210>1

[0060] <211>1463

[0061] <212>DNA

[0062] <213>纤维化纤维菌(Cellulosimicrobium cellulans)

[0063] <400>

[0064] CGGGGGGGGG GCGCGCAAAA CACGTTAAAG TCGAACGATG ATAGCCCAGC 50[0065] TTGCTGGGCG GTTTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG AGTAACCTGC 100[0066] CCTTGACTTC GGGATAACTC CGGGAAACCG GGGCTAATAC CGGATATGAG 150[0067] CCGTCCTCGC ATGGGGGTGG TTGGAAAGTT TTTCGGTCAG GGATGGGCTC 200[0068] GCGGCCTATC AGCTTGTTGG TGGGGTGATG GCCTACCAAG GCGACGACGG 250[0069] GTAGCCGGCC TGAGAGGGCG ACCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC 300[0070] AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGAAAGC 350[0071] CTGATGCAGC GACGCCGCGT GAGGGATGAA GGCCTTCGGG TTGTAAACCT 400[0072] CTTTCAGCAG GGAAGAAGCG CAAGTGACGG TACCTGCAGA AGAAGCGCCG 450[0073] GCTAACTACG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGTAGGGCGC AAGCGTTGTC 500[0074] CGGAATTATT GGGCGTAAAG AGCTCGTAGG CGGTTTGTCG CGTCTGGTGT 550[0075] GAAAACTCGA GGCTCAACCT CGAGCTTGCA TCGGGTACGG GCAGACTAGA 600[0076] GTGCGGTAGG GGAGACTGGA ATTCCTGGTG TAGCGGTGGA ATGCGCAGAT 650[0077] ATCAGGAGGA ACACCGATGG CGAAGGCAGG TCTCTGGGCC GCAACTGACG 700[0078] CTGAGGAGCG AAAGCATGGG GAGCGAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC 750[0079] CATGCCGTAA ACGTTGGGCA CTAGGTGTGG GGCTCATTCC ACGAGTTCCG 800[0080] TGCCGCAGCA AACGCATTAA GTGCCCCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG 850[0081] CTAAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGC GGAGCATGCG 900[0082] GATTAATTCG ATGCAACGCG AAGAACCTTA CCAAGGCTTG ACATGCACGA 950[0083] GAAGCCACCA GAGATGGTGG TCTCTTTGGA CACTCGTGCA CAGGTGGTGC 1000[0084] ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG 1050[0085] AGCGCAACCC TCGTCCCATG TTGCCAGCGG GTTATGCCGG GGACTCATGG 1100[0086] GAGACTGCCG GGGTCAACTC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC 1150[0087] ATGCCCCTTA TGTCTTGGGC TTCACGCATG CTACAATGGC CGGTACAAAG 1200[0088] GGCTGCGATA CCGTAAGGTG GAGCGAATCC CAAAAAGCCG GTCTCAGTTC 1250[0089] GGATTGGGGT CTGCAACTCG ACCCCATGAA GTCGGAGTCG CTAGTAATCG 1300[0090] CAGATCAGCA ACGCTGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC 1350[0091] CCGTCAAGTC ACGAAAGTCG GTAACACCCG AAGCCCATGG CCCAACCGTT 1400[0092] CGCGGGGGGA GTGGTCGATG GTGGGACTGG CGATTGGACT AAGTCGAACA 1450[0093] ACGAGCCCCC GCC 1463