γ-聚谷氨酸或其盐类作为添加剂在乳制品中的应用

摘要

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸(H型)或γ-聚谷氨酸钠(Na型)或其与一种或多种矿物离子(如Ca2+，Fe2+，Zn2+，Mg2+，Fe3+，Cu2+)形成的聚氨基酸螯合盐类，或其混合物作为增稠剂、稳定剂、抗冻剂、矿物营养强化剂、矿物吸收促进剂在乳制品(如杀菌乳、灭菌乳、发酵乳，含乳饮料、乳粉、干酪或冰激凌)中作为添加剂的应用。

权利要求

1.γ-聚谷氨酸在牛奶中的应用，其特征在于：所述的γ-聚谷氨酸的分子量为

60-80KDa，其在牛奶中的添加浓度为牛奶总重的2‰。

说明书

γ-聚谷氨酸或其盐类作为添加剂在乳制品中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种γ-聚谷氨酸或其盐类作为添加剂在乳制品中的应用，属于食品添加剂应用技术领域。更具体而言，本发明涉及一种γ-聚谷氨酸(H型)或γ-聚谷氨酸2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+
钠(Na型)或其与一种或多种矿物离子(Ca ，Fe ，Zn ，Mg ，Fe ，Cu )形成的聚氨基酸螯合盐类，或其混合物，作为一种新型添加剂，提高乳制品中矿物营养含量，并在小肠中阻止磷酸盐对矿物离子的沉淀而使其缓慢释放，且能掩蔽因矿物离子的加入导致的对奶制品风味和口感的破坏，同时因大分子聚氨基酸的加入也能赋予乳制品更好的结构特性，起到增稠、提高稳定性、抗冻等效果。

背景技术

[0002] 矿物质营养在人类营养中起到非常重要的作用，钙缺乏会引起佝偻病或骨质疏松症，铁缺乏会引起贫血，明显降低工作和免疫能力。2004年“中国居民营养与健康现状”调查报告显示钙缺乏程度非常严重，骨质疏松症患者总数约在9000万人左右，占全国总人口的近7％。我国居民铁缺乏问题也非常严重，贫血患病率为15.2％，绝大部分是缺铁性贫血。乳品是营养最全面的理想食品，富含人体生长发育所必需的各种氨基酸和矿物元素。近年来，人们消费乳制品的意识不断增强，加之国家积极倡导人们消费乳制品，乳制品成为人们日常生活中一种重要的营养食品，乳品行业也成为我国新兴而又极具发展潜力食品行业，被社会公认为“朝阳产业”。同时，人们购买乳制品不仅注重“口感、口味”，更加关心其营养成分及功能性、安全性，对品质的要求不断提高，具有优质、安全、风味、便捷等特点的产品成为消费热点。目前酪蛋白磷酸肽(CPP)在食品中作为矿物质吸收促进剂的使用比较普遍，但因为其价格高、水溶性差、有不良的苦味，而在应用效果和应用成本上受到一定的限制。研究开发价格低廉、适合大众食品使用的新型矿物质吸收促进剂仍显得十分迫切。

[0003] γ-聚谷氨酸(γ-poly-glutamic acid，简写γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，它具有亲水性，生物可降解性，无毒性，生物可容性，无免疫原性等特征。γ-PGA具有优良的促进矿物质元素吸收效果，并且水溶性好，能够较好地掩盖强化食品中所添加矿物元素的不良口味，并具有增稠和抗冻、降血氨等功效，因而具有广阔的应用前景。除了γ-PGA，其钠、钾、镁或钙盐等也可作为食物营养补充剂。微生物产生的γ-PGA是线性高分子多肽，黏度很大，分子量太大容易造成生物膜屏障，导致矿物质的利用率降低。针对γ-PGA的不同用途，其效果受到其分子量大小影响较大，随着分子量增大，γ-PGA的钙螯合能力先变大，再变小，到一定程度又变大(Konno A，1989)；抗冻活性在一定范围内随γ-PGA的分子量减小而增大(Shih et al.，2003)。食品中常用的分子量范围在150,000到2,000,000，最好在200,000到500,000之间(Konno A，1989)。目前已经有各种制备不同分子量γ-PGA的方法的提出，主要包括热、酸、碱、超声波及特殊的酶和微生物作用下发生降解。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于获得一种γ-聚谷氨酸或其盐类作为添加剂或作为促进剂在乳制品中的新用途。具体而言，本发明的目的获得一种γ-聚谷氨酸(H型)或γ-聚谷氨2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+
酸钠(Na型)或其与一种或多种矿物离子(Ca ，Fe ，Zn ，Mg ，Fe ，Cu )形成的聚氨基酸螯合盐类，或其混合物，作为一种新型添加剂，提高乳制品中矿物营养含量，并在小肠中阻止磷酸盐对矿物离子的沉淀而使其缓慢释放，且能掩蔽因矿物离子的加入导致的对奶制品风味和口感的破坏，同时因大分子聚氨基酸的加入也能赋予乳制品更好的结构特性，起到增稠、提高稳定性、抗冻等效果。

[0005] 实现本发明的技术方案如下：

[0006] γ-聚谷氨酸或其盐类作为增稠剂、稳定剂、抗冻剂、矿物营养强化剂、矿物吸收促进剂在乳制品中的应用，所述的应用包括使所述的γ-聚谷氨酸或其盐类为H型γ-聚2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 2+
谷氨酸或Na型γ-聚谷氨酸钠或与一种或多种如Ca ，Fe ，Zn ，Mg ，Fe ，Cu 矿物离子形成的聚氨基酸螯合盐类或其混合物，所述的γ-聚谷氨酸或其盐类的使用分子量为5～
1000KDa，添加浓度为所述乳制品总重的0.001～5％。

[0007] 上述的应用的产品包括：乳制品为杀菌乳、灭菌乳、含乳饮料、乳粉、发酵乳、干酪或冰激凌。

[0008] 本发明的应用方法包括：所述γ-聚谷氨酸或其盐类的添加方式为在乳制品配料时或加工过程中或加工完成后将所述的γ-聚谷氨酸或其盐类以溶液或干粉形式与食品其他组分均匀混合。

[0009] 下列用途是本发明的典型用途举例：

[0010] 所述的γ-聚谷氨酸或其盐类在杀菌乳，灭菌乳，含乳饮料中的用途，其中作为矿物营养强化剂，或作为防止乳清析出和沉淀形成的稳定剂和或增稠剂。

[0011] 所述的γ-聚谷氨酸或其盐类在乳粉中的用途，其中作为矿物吸收促进剂和/或矿物营养强化剂。

[0012] 所述的γ-聚谷氨酸及其盐类在酸乳用途，其中作为延缓酸奶中乳酸菌的衰亡的抗冻剂，作为矿物吸收促进剂和/或矿物营养强化剂。

[0013] 所述的γ-聚谷氨酸或盐类在冰激凌中的用途，其中作为使冰激凌在凝冻和硬化中形成的冰晶更细微的抗冻剂。

[0014] 所述的γ-聚谷氨酸或其盐类在干酪中的用途，其中作为增强干酪可塑性、弹性并掩盖其苦味的形成的稳定剂。

[0015] 本发明所要解决的问题是针对上述乳制品中其它矿物营养强化剂存在的成本高、水溶性差、稳定性差、给食品中带来不良的滋气味等问题而提供一种成本低廉，可大批量生产，多功能乳制品添加剂。

[0016] 本发明为解决上述的问题所采用的技术方案为：通过微生物发酵法大量生产，再通过后处理工艺，得到不同分子量及不同矿物螯合型的γ-PGA系列产品，满足在奶粉，奶酪，冰激凌，酸奶，含乳饮料及其他含乳食品等不同产品的应用需求。

[0017] 按上述方案，本发明中使用的γ-PGA生产菌株为本申请人的农业微生物国家重点实验室筛选的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，该菌株于2008年4月28日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCCNO：M208065，其详细内容已经申请相关发明专利，专利申请号为：
200810055068.4。

[0018] 专利申请号为：200810055068.4相关联的技术方案是：

[0019] 1、菌种的分离与筛选：

[0020] 称取湖北应城盐矿高盐环境土样1g于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞封口，振荡2min，然后放水浴锅中，80℃加热10分钟，再静置30min。冷却后，吸取上清液0.1mL，稀释10-2，10-3，分别取0.2mL，涂布LB平板，37℃培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新鲜液体种子培养基中，37℃摇床培养12h后，按2％的接种量分别接种到装有50mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶中，37℃，190r/min，振荡培养36h结束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇沉淀上清液，轻轻振荡后
12000r/min离心15min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。将筛选到的菌株按照规定方法进行菌种鉴定。鉴定后获得地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，该菌株于2008年4月28日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCCNO：M208065。

[0021] 地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02的菌学特征如下：

[0022] 菌体直杆状，革兰氏染色阳性，芽胞近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，边缘不齐，毛发状，菌苔干燥，不透明，蔓延，灰白色。最适生长温度30-37℃，适宜pH6.8-7.2。接触酶实验阳性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。

[0023] 遗传特性：该菌株无质粒，聚-γ-谷氨酸合成酶基因位于染色体上。该菌株产生聚-γ-谷氨酸的性能稳定，连续传代20次以上，该菌株合成聚-γ-谷氨酸的能力不变。

[0024] 聚-γ-谷氨酸产生菌Bacillus Licheniformis WX-0216SrDNA基因序列有1263个碱基，Genebank登录号：EU564336，结合16SrDNA分子鉴定与前面的生理生化鉴定结果，鉴定WX-02为芽胞杆菌属地衣芽胞杆菌。

[0025] 菌种培养、传代和保藏：

[0026] 地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02在常用的LB培养基固体斜面上30℃-37℃培养，可于4℃短期保藏，甘油管可于-70℃长期保藏作为原始菌种；生产菌种可从原始菌种中转接。地衣芽胞杆菌菌株WX-02，在实验室条件下的长期保藏按下列步骤：

[0027] A、将地衣芽胞杆菌菌株WX-02在LB培养基固体斜面上30℃-37℃培养；

[0028] B、刮取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中：

[0029] C、于-70℃下冰箱中冷冻保藏。

[0030] 2、利用地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02菌株生产聚-γ-谷氨酸的方法如下：

[0031] 种子液制备：

[0032] A、将冷冻保藏的地衣芽胞杆菌WX-02接种到含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、琼脂15克/升、pH为7.0的LB固体培养基平板上，37℃培养24-36小时，使其活化；

[0033] B、将步骤A上活化的种子(菌种)转接到含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH为7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，于30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期()；

[0034] 发酵生产：

[0035] A、按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基，配方如下：谷氨酸40-100g/L；葡萄糖50-100g/L；柠檬酸10-30g/L；氯化铵3-20g/L；K2HPO4·3H2O 0.1-2g/L；MgSO4·7H2O0.1-2g/L；FeCl3·6H2O 0.01-0.1g/L；CaCl2·2H2O 0.1-2g/L；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前调培养基的pH为7.0-7.5(作为优选方案：该发酵培养基成分(g/L)为：谷氨酸钠70，葡萄糖70，柠檬酸钠8，氯化铵8，MnSO4·H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.8，ZnSO4.7H2O
0.2，CaCl2·2H2O0.2)。

[0036] B、按发酵罐容积的60-80％投入上述发酵培养基，以0.07-0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至30℃-37℃接入种子液；在30℃-37℃条件下培养，通气量1∶0.5-2(v/v)。

[0037] (3)提取与精制

[0038] 将所述的地衣芽胞杆菌菌株WX-02采用常规液体深层发酵方法生产，28-36小时结束发酵；然后离心除菌体，收集上清液，并用95％的乙醇沉淀聚-γ-谷氨酸，回收得到聚-γ-谷氨酸。

[0039] 通过上述方法得到大于1000KDa分子量的γ-PGA。

[0040] 作为本发明主题的应用，对发酵及提取得到的高分子γ-PGA进行酸水解，通过控制pH值(1～3)、温度(50～100℃)和水解时间(0.5～8h)得到不同区间分子量(10～1000KDa)的γ-PGA的产品。

[0041] 按上述方案，本发明中得到不同矿物螯合型的γ-PGA产品有两种方式。方法之一2+ 2+ 2+ 2+ 3+
是：向γ-聚谷氨酸溶液中，加过量的Ca 形式、Fe 形式、Zn 形式、Mg 形式、Fe 形式、
2+
Cu 形式的可溶性盐类(如氯化盐，硫酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐等)，控制条件pH6～8/30～
37℃，震荡混合1～2小时，用去离子水透析除去过量的游离离子，然后再将产物按照常规
2+ 2+ 2+
方法进行冷冻干燥，即得到γ-聚谷氨酸Ca 形式的螯合物、Fe 形式的螯合物、Zn 形式的
2+ 3+ 2+
螯合物、Mg 形式的螯合物、Fe 形式的螯合物、Cu 形式的螯合物。方法之二是：将γ-聚
2+ 2+
谷氨酸溶液的pH调到2.2左右，用去离子水透析除去游离的杂离子，再用Ca 形式、Fe 形
2+ 2+ 3+ 2+
式、Zn 形式、Mg 形式、Fe 形式、Cu 形式的氧化物或氢氧化物澄清溶液中和至pH到6～
2+ 2+ 2+
7，冷冻干燥即得到γ-聚谷氨酸Ca 形式的螯合物、Fe 形式的螯合物、Zn 形式的螯合物、
2+ 3+ 2+
Mg 形式的螯合物、Fe 形式的螯合物、Cu 形式的螯合物。

[0042] 按上述方案，可将不同分子量的、不同矿物螯合型的γ-PGA粉剂或配成一定浓度的溶液，在乳制品配料时或加工过程中或加工完成后将γ-聚谷氨酸及其盐类以溶液或干粉形式与食品其他组分均匀混合，可经过乳品加工过程中60～140℃的热处理、-40～4℃的冷处理、采用常规喷雾干燥及均质等加工处理方法而对效果影响不大。

[0043] 按上述方案，奶粉，奶酪，冰激凌，酸奶，含奶饮料中螯合型的γ-PGA的使用量占食品重量的0.001wt.％至5wt.％，使用γ-PGA的分子量范围为5～1000KDa。

[0044] 更详细的技术方案参见《具体实施方式》所描述的内容。

附图说明

[0045] 图1：显示不同分子量γ-PGA及其矿物螯合物的制备流程图

[0046] 图2：显示γ-PGA不同分子量标准品通过凝胶分子筛的色谱图，按出峰时间从先到后依次对应的分子量为800KDa，600KDa，200KDa，100KDa，80KDa，50KDa

[0047] 图3：显示在pH＝1，80℃条件下水解制备的不同分子量γ-PGA的凝胶分子筛的色谱图，按出峰时间从先到后对应的水解时间为0h，0.5h，1h，2h，3h，4h.由于微生物发酵过程中自身酶系会对γ-PGA部分酶解，产生100KDa大小的片段，因此开始水解的样品会出现两个峰，而随着水解进行，分子量分布范围变窄逐渐融合为一个峰。

具体实施方式

[0048] 实施例1：聚-γ-谷氨酸产生菌地衣芽胞杆菌WX-02的分离、鉴定

[0049] 称取湖北应城盐矿高盐环境土样1g于灭菌试管中，加无菌水9mL，用棉塞封口，振荡2min，然后放水浴锅中，80℃加热10分钟，再静置30min。冷却后，吸取上清液0.1mL，稀释10-2，10-3，分别取0.2mL，涂布LB平板，37℃培养48h观察结果，挑选在LB培养基上呈乳液状能拉丝的单菌落，接入新鲜液体种子培养基中，37℃摇床培养12h后，按2％的接种量分别接种到装有50mL灭菌基本发酵培养基的250mL摇瓶中，37℃，190r/min，振荡培养36h结束发酵。对发酵产物分别取样离心除去菌体，用3倍乙醇在沉淀上清液，轻轻振荡后
12000r/min离心15min，收集沉淀物，冷冻干燥，再加入蒸馏水溶解沉淀物，透析去除离子，利用HPLC检测产物。将筛选到的候选菌株按农业微生物鉴定的常规方法进行，确定该菌株为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)，将其编号为：WX-02，该菌株于2008年4月28日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M208065。

[0050] 实施例2：聚-γ-谷氨酸的HPLC分析方法

[0051] 聚-γ-谷氨酸的定量分析由HPLC完成，色谱柱Agilent 1100，流动相为100mM KH2PO4加5.0％甲醇(用磷酸调pH值至2.5)过滤，超声波除气，紫外检测波长为210nm，流速为lml/min，谷氨酸作为定量的标准物。分子量的分析由美国Waters液相色谱仪，配备日本产TSK Gel G6000PWXL(7.8mm×300mm)凝胶渗透色谱柱和Waters 2487紫外检测器。流动相为25mmol/LNa2SO4∶乙腈＝8∶1(v/v)，流速为0.5ml/min，检测波长210nm，提纯的γ-PGA作为定量的标准物。

[0052] 聚-γ-谷氨酸的产量测定步骤如下：

[0053] 取5毫升发酵离心上清液，加3倍体积酒精沉淀PGA，溶解产物，加等体积浓盐酸水解12小时，水解后把水解液加10M NaOH中和定容，经0.22μm膜过滤，测定谷氨酸的含量，再折算成聚-γ-谷氨酸的产量。

[0054] 聚-γ-谷氨酸分子量的测定步骤：

[0055] 发酵液定量稀释后，PGA的水解液调PH中偏酸性，稀释一定倍数(浓度大约为1-5g/L)，经0.22μm膜过滤。

[0056] 实施例3：聚-γ-谷氨酸的液体分批发酵生产

[0057] 1、用冷冻保藏的菌种地衣芽胞杆菌WX-02为原始菌种

[0058] 2、斜面菌种

[0059] 将冷冻保藏的菌种地衣芽胞杆菌WX-02接种到LB固体斜面(成分：蛋白胨10g/L、酵母浸出物5克/L、NaCl 10g/L、琼脂15克/L、灭菌前调培养基的pH为7.0)，30℃-37℃培养24-36小时。

[0060] 3、种子液培养

[0061] 将LB固体斜面活化的种子转接到含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl10克/升、pH 7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期；

[0062] 4、发酵罐培养

[0063] 按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸40-100克；葡萄糖50-100克；柠檬酸10-30克；氯化铵3-20克；K2HPO4·3H2O 0.1-2克；MgSO4·7H2O 0.1-2克；FeCl3·6H2O0.01-0.1克；CaCl2·2H2O 0.1-2克；补充蒸馏水至1000ml，pH 7.0-7.5，配置7L发酵液投入10L发酵罐，以0.07-0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照2％的接种量接入种子液，发酵罐转速400-800rpm，发酵温度30℃-37℃，通气量1∶0.5-2(v/v)，发酵至28-36小时结束发酵，检测分析所得到的聚-γ-谷氨酸的浓度为38g/L。

[0064] 5、聚-γ-谷氨酸发酵液后处理

[0065] 取上述发酵液7L，调节PH值3.0以下，在12000rpm转速下，离心15分钟，收集上清液，超滤浓缩至2L，向浓缩发酵液中加入6L 95％的乙醇，沉淀聚-γ-谷氨酸。在10000rpm下离心收集沉淀，真空干燥得到252.7克干燥产品，在本实施例中，聚-γ-谷氨酸的提取回收率为95％。

[0066] 实施例1

[0067] 挑取本申请人保藏的斜面地衣芽胞杆菌菌种WX-02(本发明中使用的γ-PGA生产菌株为本申请人的农业微生物国家重点实验室筛选的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，该菌株于2008年4月28日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M208065)接入常规的LB培养基中37℃活化10-12h后得到种子液，按3％(v/w)接种量将该种子液接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，发酵培养基成分(g/L)为：谷氨酸钠70，葡萄糖70，柠檬酸钠8，氯化铵8，MnSO4·H2O0.01，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.8，ZnSO4.7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.2；
灭菌前调培养基的pH至7.0；在115℃高压蒸汽下灭菌30min后使用。将所述的种子液在转速为200r/min，37℃的恒温摇床上发酵36h。发酵结束后，将发酵液在转速为12000r/min的条件下离心20min去菌体，用2-4倍体积的95％的乙醇进行沉淀，然后再将产物用常规的冷冻干燥方法，得到γ-PGA粗产品。

[0068] 用上述制备的γ-PGA配制成3％(w/w)的溶液，在pH＝1，80℃条件下水解0.5～4小时，再用NaOH调pH至中性，接着用去离子水透析去盐，然后再将产物进行冷冻干燥，得到不同分子量的γ-PGA产品。用高压液相凝胶排阻色谱测定所得样品的分子量，结果如表
1表1不同分子量γ-PGA的制备

[0069]样品编号 1# 2# 3# 4# 5# 6#
水解时间 0h 0.5h 1h 2h 3h 4h
出峰时间/min 15.23 16.82 17.80 18.75 19.27 19.60
分子量范围/KDa 1000以上 800左右 600左右 400左右 200～300 60～80[0070] 实施例2

[0071] 取实施例1制备的各种分子量的γ-PGA样品配成10g/L的溶液，用2mol/L的NaOH调节该溶液的pH至7，加入等体积的100mmol/L的CaCl2，37℃下震荡1h后，用去离子水2+
进行透析过夜，然后再将产物进行冷冻干燥，即得到γ-聚谷氨酸Ca 形式的螯合物。将PGA-Ca干物质，再配成10g/L溶液，用100mmol/L的EDTA滴定螯合钙浓度，结果见表2。

[0072] 表2不同分子量PGA螯合钙能力比较

[0073]样品编号 1# 2# 3# 4# 5# 6#
螯合钙浓度(％) 11.1 11.3 11.7 12.5 11.8 11.7

[0074] 注：表2的样品编号同表1。

[0075] 由以上数据可知，适当水解后的γ-PGA对钙离子的螯合能力更强，分子量位于400KDa之间的γ-PGA可作为较理想的钙离子螯合剂使用。

[0076] 实施例3应用实施例(1)

[0077] 向鲜牛奶中加入实施例2中的4#PGA-Ca高速搅拌混合均匀后，在同一水平的钙离子强化浓度下比较其与对照(用的CaCl2代替PGA-Ca)在115℃，15分钟处理后的稳定性效果。比较了五个钙离子强化浓度下，两者的热稳定性效果差异。结果如表3：

[0078] 表3添加γ-PGA螯合钙和离子钙对牛奶热稳定性影响的比较

[0079]钙离子强化 0 0.1‰ 0.2‰ 0.3‰ 0.4‰ 0.5‰
方式
4#PGA-Ca 均一，稳定 均一，稳定 均一，稳定 均一，稳定 有较细颗 有较粗颗
粒 粒
CaCl2 均一，稳定 均一，稳定 均一，稳定 有颗粒出 凝结成大 成较硬的
现 块 凝胶

[0080] 注：所用牛奶原始钙含量为1‰

[0081] 由以上结果可以得出，添加PGA-Ca对牛奶的热稳定性破环比添加离子钙要小，可使牛奶(原始钙含量1‰)中的钙离子强化后水平达到1.3～1.4‰。

[0082] 实施例4

[0083] 将三种分子量范围，实施例l中的2#、4#、6#PGA-Na以一系列浓度加入到鲜牛奶中，高速搅拌混合均匀后，用NDJ-1型旋转式粘度计测定其粘度，结果如表4：

[0084] 表4添加γ-PGA对牛奶的增稠效果

[0085]

[0086] 注：粘度测定条件为：室温，1#转子，60r/min，定时1min后读数。

[0087] 由以上数据可以得出，300KDa以上的γ-PGA的对牛奶都有较强的增稠效果，而小分子量的(100KDa以下)的γ-PGA在浓度不高时对牛奶的粘度影响不大。

[0088] 实施例5

[0089] 向牛奶中添加2‰(w/w)的γ-PGA(实施例1中的3#和6#)和0.4‰(w/w)的金2+ 2+ 2+
属离子(如Ca ，Fe ，Zn )，添加之前先做如下处理：按添加量将γ-PGA和金属氯化物配成混合液，调节pH至7～8，在37℃下震荡1小时，再加入到鲜牛奶中，均匀混合，115℃/10min灭菌，常温存放一周后做品尝实验，以只添加0.2‰的金属氯化物的牛奶做对照。实验对象为任意挑选的20人(男，女各10人)，采用双盲实验法，受试者对牛奶中的辛辣味、收敛味及其他不良味道打分，感觉强烈的打4分，有明显感觉的打3分，稍微有感觉的打2分，感觉不到的打1分。20人打分的平均结果如表5。

[0090] 表5添加γ-PGA对牛奶中矿物强化后不良口感的掩盖效果

[0091]样品 0.4‰ZnCl2 0.4‰FeCl2 0.4‰CaCl2
不含γ-PGA的牛奶 4 4 3.8
含2‰γ-PGA(6#)的牛奶 2.4 2.5 1.8
含2‰γ-PGA(3#)的牛奶 2.2 2.4 1.5

[0092] 结果显示，在金属螯合能力相当情况下(如实施例2所示)，分子量相对大的3#γ-PGA对不良口感的掩盖能力较好。

[0093] 实施例6

[0094] γ-PGA在全脂奶粉的添加：

[0095] 300～400KDa(实施例1中的4#)的γ-聚谷氨酸钠(γ-聚谷氨酸，或γ-聚谷氨酸矿物螯合物)以乳中干物质重量的2‰的量计，在奶粉加工的配料过程中与预热到60℃的牛乳高速搅拌混合，再经过均质(15MPa)，杀菌(85℃/7min)，真空浓缩(至原料乳体积的1/4左右)，喷雾干燥(进风温度160℃，干燥室温度75℃，排风温度75℃)，冷却，筛粉等工序，制得营养强化全脂奶粉成品。同样也可以将γ-聚谷氨酸钠在喷雾干燥后在以细干粉形式混入奶粉中混匀。营养强化奶粉成品，呈均匀一致的乳黄色，组织状态干燥均匀，在水中溶解迅速不结块。

[0096] 实施例7

[0097] 用实施例6制得的营养强化奶进行铁吸收实验，方法如下：试验用3周龄Wistar大鼠30只，购自湖北省疾病控制防疫中心。饲喂缺铁的普通商购饲料(要求该饲料中铁含量设定为4ppm)28天，耗竭Wistar大鼠体内铁的贮存。正式试验期间，对照组饲喂普通全脂奶粉(商购)与其普通商购饲料(同上，其中总铁含量设定为70ppm)，实验组用含0.2％γ-聚谷氨酸钠的全脂奶粉代普通全脂奶粉，总铁含量与对照相同。不锈钢饲养笼个体饲养(避免大鼠和其排泄物接触)，自由采食和饮用去离子水，其它按试验动物饲养操作规范进行。四周后称重(各组大鼠生长良好，体重无显著差异)，宰杀测定血液指标及组织器官中的铁含量，结果如表6和表7。

[0098] 表6奶粉中添加γ-PGA对大鼠血液指标的影响

[0099]组别 血清总铁结合 血清铁* 红细胞数量* 血红蛋白 红细胞压积
(umol/L) (umol/L) (1012/L) (g/L) 数(L/L)
对照组 39.43±7.17 12.53±3.92 7.89±0.67 132.25±6.46a 0.42±0.02a
实验组 51.17±9.82 26.30±8.64 8.54±0.41 145.87±4.94b 0.47±0.02b[0100] 注：*代表无显著性差异，a、b代表差异显著(P＜0.05)，下同

[0101] 表7奶粉中添加γ-PGA对大鼠组织器官铁含量的影响

[0102]组别 脾脏铁浓度 肝脏铁浓度* 股骨铁浓度
(mg/g，干物质) (mg/g，干物质) (mg/g，干物质)
对照组 0.550±0.100a 0.190±0.048 0.067±0.009a
实验组 0.740±0.095b 0.210±0.056 0.110±0.021b

[0103] 由以上数据可以得出，含γ-聚谷氨酸钠的营养强化奶中铁的吸收效果较普通奶粉好。

[0104] 实施例8

[0105] γ-PGA钙强化酸奶的制作，配料及工艺过程如下(见表8所示)：

[0106] 表8γ-PGA钙强化酸奶的配料成分及用量

[0107]配料 对照组(g) 实验组(g)
鲜牛乳(购自武汉市东西湖 1000 1000
农场)
脱脂奶粉(西安银桥乳业集 20 20
团)
蔗糖(市售) 60 60
4#PGA-Ca 0 2
活化的商品化发酵剂(罗地 20 20
亚MY105)

[0108] 说明：活化的商品化发酵剂罗地亚MY105，购自罗地亚无锡制药有限公司[0109] 1.把牛乳加热到60℃，加入脱脂奶粉，搅拌均匀，水合20～30min。

[0110] 2.将PGA-Ca和蔗糖均匀混和，在高速搅拌下缓慢加入到牛乳中。

[0111] 3.将牛乳均质两次，均质压力分别为20MPa和5MPa；然后在90℃下灭菌10min。

[0112] 4.迅速冷却至43～45℃，接种商品化发酵剂(罗地亚MY105)，42～45℃下发酵4h，冷却，冷藏后熟(2～7℃)。

[0113] 添加PGA-Ca可以强化酸奶中的钙含量。同时发现冷藏过程中，对照组中乳酸菌总活菌数从第三天开始下降，添加本发明制备的PGA-Ca的样品中菌数较稳定，到第七天以后8 8
实验组的乳酸菌总活菌数明显高于对照组，七天时分别为9.1×10CFU/ml和6.6×10CFU/
8 8
mL，到第十四天时分别为7.25×10CFU/ml和5.83×10CFU/ml。冷藏到9天时，实验组和对照组样品均无乳清析出，滴定酸度差异不显著，另外色泽、滋气味等无差异，但前者口感更稠。

[0114] 实施例9

[0115] γ-PGA在干酪制作中的添加应用。

[0116] 表9γ-PGA在干酪制作中的添加应用设计

[0117]配料 对照(g) 实验组(g)
鲜牛乳(购自湖北省武汉市东 1000 1000
西湖国营农场)
4#PGA-Na(自己制备) 0 3
活化的商品化发酵剂(购自 15 15
CHOOZITTMlacticoffer，Danisco
公司
氯化钙 0.2 0.2
凝乳酶(科汉森公司，酶活力 0.083 0.083
1∶12000)

[0118] 1.将PGA-Na溶于少量水中(10％w/w)，再与牛乳混合均匀，加热到60℃，维持温度，灭菌30min。

[0119] 3.待牛乳冷却到39℃，加入发酵剂，充分搅拌均匀，39℃发酵30～40min，最后酸度控制在0.18％～0.22％。

[0120] 4.将CaCl2配成10％的溶液加入到酸化的牛乳中，用1M的盐酸调整牛乳酸度至0.21％，把凝乳酶用1％的食盐水配成2％的溶液后加入到牛乳中，充分搅拌，在30℃下保温30min，使乳凝固。

[0121] 5.用干酪刀将凝块切割为0.7～1cm3的小立方体后，用干酪搅拌器轻轻搅拌，15min后搅拌速度稍加快，搅拌过程中控制好温度，从开始每3min升高1℃，升温至53℃，保温45min。在搅拌升温的后期，当乳清的酸度在0.17％～0.18％时，凝乳块收缩至原来的一半大小，排出乳清。

[0122] 6.将凝块到入模具中压榨成型，脱模后将干酪置于盐水中腌渍，盐水的浓度前两天为17％～18％，以后保持盐水浓度为20％～23％，温度控制在8℃，腌渍4天左右。将干酪沥干，然后真空包装，8℃放置成熟。

[0123] 添加有PGA-Na的干酪滋味和气味正常，香味良好，质地均匀，软硬适中，组织极细腻，可塑性和弹性较对照强，不易碎，有正常的纹理图案，黄色有光泽，表皮均匀细致，没有对照中的苦味，具体感官评分如表10。

[0124] 表10添加γ-PGA对干酪感官指标的影响

[0125]项目 滋味和 组织状 纹理图 色泽 外形 包装 感官总
气味 态 案 评分
对照组 38.4 20.6 6.7 4 3 4 76.7
实验组 46.1 24.2 8.2 4 4.2 4 90.7

[0126] 注：以上为20人打分的平均结果，采用双盲实验法，打分细则参考曾寿瀛主编《现代乳与乳制品加工技术》，P 185～186：硬质干酪感官指标及评分。

[0127] 实施例10

[0128] γ-PGA在巧克力奶中的添加应用试验，结果见表11

[0129] 表11γ-PGA在巧克力奶制作中的添加应用设计

[0130]配料 对照(g) 试验组(g)
全脂奶粉(西安银桥乳业集团) 100 100
蔗糖(市售) 30 30
可可粉(市售) 50 50
4#PGA-Ca 0 2
K-卡拉胶(长沙思齐) 2 0
水 900 900

[0131] 1.用50～60℃的热水溶解乳粉，搅拌均匀，水合20～30min

[0132] 2.将蔗糖溶于水，煮沸15～20min，冷却至80℃，缓慢加入PGA-Ca或卡拉胶，高速搅拌(2500～3000r/min)混匀。可可粉单独用热水溶解，制成可可浆，在85～95℃/20～30min热处理后，冷却。

[0133] 3.将所有的原辅料混合，搅拌15～25min，保证所有的物料混合均匀，加热至60℃均质，采用二级均质工艺，压力分别为20MPa和5Mpa。

[0134] 4.装瓶后在115℃高压蒸汽下灭菌15～20min，冷却至25℃，常温储存。

[0135] 存储14天后，观察钙强化巧克力奶(实验组)和对照组中无脂肪上浮，无颗粒沉淀，无任何不良的滋味和气味，口感柔和。离心(3000r/min，10min)测得实验组和对照组中的沉淀率分别为4.67％和4.58％，按实验实例4方法测得两组的粘度分别为9.8mps和9.4mps.

[0136] 实施例11

[0137] γ-PGA在冰激凌制作中的添加应用，参考一般冰激凌的成分要求：乳脂肪8％～14％，非脂肪乳固体8％～12％，糖类13％～16％，乳化稳定剂0.3％～0.5％，总固形物
32％～40％，计算得到的具体配料及工艺过程如表12的设计：

[0138] 表12γ-PGA在冰激凌制作中的添加应用设计

[0139]配料 对照样(g) 本发明的试验组(g)
稀奶油(市售) 150 150
鲜牛乳(购自武汉东西湖农场) 520 520
甜炼乳(市售) 300 300
蔗糖(市售) 25 25
6#PGA-Ca 0 3
CMC(羧甲基纤维素钠，河南 3 0
省郑州世纪美添食品工贸有限公
司)
单甘脂(市售) 2 2

[0140] 1.将牛乳加热至50℃，维持温度，在搅拌条件下依次加入蔗糖、PGA-Ca(或CMC，配10％w/w溶液加入)，单甘脂，稀奶油和甜炼乳，混料完毕后控制酸度在0.18％～0.2％。

[0141] 2.将混合料加热到65℃左右，均质，压力控制在20MPa。

[0142] 3.在83℃保持30s灭菌后，迅速冷却至5℃，再将温度控制在2～4℃老化4h。

[0143] 4.冷却到-2～-5℃在凝冻搅拌器中凝冻，灌装成型，放入-35℃的低温冷柜中硬化后，于-25℃冷藏。

[0144] 实验组与对照相比冰晶形成更细微，且组织持久性更好，采用蒸馏水定容法(SB/T10012-1992)测定得到实验组与对照组的膨胀率分别为69％和62％，另采用文献(M R Muse，R W Hartel.Ice cream structural elements that affect melt ing rate and Hardness[J].Dairy Sci，2004，87：1-10)提供的方法测的实验组与对照组熔化率分别为1.12％/min和1.67％/min，可见γ-PGA(聚-γ-谷氨酸盐类)对冰激凌的组织结构改善效果较CMC(羧甲基纤维素钠)更强。