一种长枝木霉真菌菌株

摘要

一种长枝木霉真菌菌株，属于微生物技术领域，将其命名为长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum Rifai)T05号菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2009年1月19日，保藏号：CGMCC No.2888，其分生孢子阶段(无性态)属于半知菌门(Deuteromycota)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)；有形态属于子囊菌门子囊菌纲(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)。本发明的长枝木霉真菌菌株产孢量多、高效且具有广谱抑制树木皮部病害和多种植物病害生防能力、能促进植物生长并适于工业化生产。

权利要求

1.一种长枝木霉真菌菌株，其特征在于，命名为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)菌株T05，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2009年1月19日，保藏号：CGMCC No.2888，其无性态分生孢子阶段属于半知菌门(Deuteromycota)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)；有形态属于子囊菌门子囊菌纲(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)。

说明书

一种长枝木霉真菌菌株

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，主要是一种具有广谱抑制树木皮部病害和植物病害及促进植物生长的长枝木霉真菌菌株。

背景技术

[0002] 自工业革命以来，尤其是20世纪的后50年全球环境遭到空前破坏和污染，相继出现了十大全球性环境问题。林业和生态环境建设，日益受到全社会的高度重视，建设生态文明成为人类文明的必然选择。1992年联合国环境与发展大会通过了《21世纪议程》，确立了可持续发展在全球经济和社会中的战略地位，由此推动了无公害农林业、无公害防治的快速发展，也对森林病虫害防治工作提出了更高的要求。无公害防治是保护人类生存环境的迫切需要，也是我国农林产品走向国际市场的通行证，更是实现农林业可持续发展的重要途径。随着我国加入WTO进程的加快，森防工作面临着新的挑战，要履行巴西环发大会国际公约，承担相应的国际义务，逐步减少化学农药的使用，加大生防力度，以实现对森林病虫害的可持续控制。为此，国家林业局有计划、有重点地扶持一批具有高科技含量的生物制剂厂，以推动林用微生物制剂的商品化，为生产防治提供优质高效的生物制剂，为我国林业和生态环境建设的持续、快速、健康发展发挥积极促进作用。在这种情况下，研究不利用化学方法、不会造成污染的植物生防技术，筛选出优质、高效、经济、适用并符合环保要求的林用药，就势在必行了。木霉资源丰富、分布范围广泛，是在植物病害生防中应用最为广泛的一类拮抗真菌，各地都有适应当地环境的优势菌株。已有多种木霉菌用于农业上真菌病害的生物防治研究，都取得了相当不错的防治效果。许多植病学者在研究木霉菌对植物病原菌的生物防治时还发现，木霉菌还可以明显地促进植物的生长。由于木霉菌拮抗作用明显且适应性广，已有许多菌株及剂型被正式商业注册登记，木霉菌制剂正处在日新月异的发展中。但是适合于东北、西北地区等高寒气候特点，能够应用在树木、果树上的木霉虽有一些研究，但不深入，商品制剂还不多见。

发明内容

[0003] 本发明的目的正是为了克服上述现有技术的不足而提供一种产孢量多、高效且具有广谱抑制树木皮部病害和植物病害生防能力、能促进植物生长和适于工业化生产的长枝木霉真菌菌株。

[0004] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

[0005] 本发明的长枝木霉真菌菌株命名为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum Rifai)菌株T05，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日：2009年1月19日，保藏号：CGMCC No.2888，其分生孢子阶段(无性态)属于半知菌门(Deuteromycota)，丝孢纲(Hyphomycetidae)，丝孢目(Hyphomycetales)，淡色孢科(Moniliaceae)；有形态属于子囊菌门子囊菌纲(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，肉座菌科(Hypocreaceae)。 [0006] 本发明长枝木霉真菌菌株的宏观培养特性：

[0007] 在PDA培养基上菌落生长快，2～3d内覆盖平板(直径9cm)，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状，边缘均匀，毡状。菌落初为白色，1d以后产生分生孢子簇的绿色同心环，间距1.0cm，非常清晰。生长新区的产孢簇为白色，靠近老区的产孢簇一部分由白色渐变为绿色，接种点周围全部被绿色孢子覆盖。菌落最终大部分变为绿色。反面变黄。在MEA培养基上气生菌丝体稀疏，菌落边缘均匀，紧贴生。菌落初为白色，后变绿色，具较清晰的窄细的产孢簇同心环纹，间距0.5cm。

[0008] 本发明长枝木霉真菌菌株的显微形态特征：

[0009] 在PDA培养基上生长新区的菌丝简单分隔，分枝，直径1.0～4.5μm。分生孢子梗具有简单的分枝系统，主轴宽2.0～3.0μm，二次分枝有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布，时常单生，安瓿形或柱形，略呈弯曲状，基部常收缩。分生孢子单细胞、椭圆形、绿色、光滑，大小为2.0～3.0μm×2.0～6.0μm。生长新区的厚垣孢子顶生或间生，圆形或椭圆形，大小为4.0～6.5μm×4.0～12.5μm。

[0010] 本发明长枝木霉真菌菌株的系统发育学鉴定：

[0011] 通过PCR扩增出一段含有ITS1、5.8s rRNA和ITS2的639bp的rRNA基因(NCBI登录号EU769111)，与NCBI GenBank中所有的ITS1和ITS2寡核苷酸条形码比对鉴定的结果表明，这一序列和其中的木霉属100个菌株达到92％以上的相似性，和其中的58个长枝木霉菌株(T.longibrachia tum/Hypocrea orientalis)达到94％以上的相似性；与TrichOKey v.2.0(www.isth.info/tools/molkey/)中模式的ITS1和ITS2寡核苷酸条形码比对鉴定的结果表明，这一菌株为长枝木霉(T.longibrachiatum/Hypocrea orientalis)。 [0012] 639bp的ITS序列如下：CCCGATTGGGGACGCGGATGGACATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAATAA。其中1～26碱基为18S rDNA序列的一部分，27～249为ITS1序列，250～407为5.8S rDNA序列，408～576为ITS2序列，577～639为28S rDNA序列的一部分。

[0013] 通过PCR扩增出一段228bp的tef1序列(NCBI登录号EU839839)，通过TrichoMARK鉴定出其中含有tef1第5内含子，TrichoBLAST比对的结果表明有19条序列与其有相似性，但与菌株T.longibrachiatum CBS816.68有最高的分值(236)和最小的E-64值(5e )。

[0014] 228bp的tef1序列如下：CTAGGGGAGTTCGAGACTACCAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTGATCCCTTGCACTCACTGCATCATCGCCACAACAACATACTAATGCCCTCTGACAGACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGACTGCGCTATTCTCATCATCGCCGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTCTCCAAGGATGGCAA，是含有tef1第5内含子及其左右一部分外显子的基因片断，其中1～43为第五外显子序列的一部分，44～107为第五内含子序列，108～228为第六外显子序列的一部分。

[0015] 本发明长枝木霉真菌菌株的培养条件为：在PDA培养基上，于25℃下菌丝生长最快。在PDB培养液内，于30℃下分生孢子的产生量最大。

[0016] 本发明长枝木霉真菌菌株，其孢子的培养方法可采用平板法，即将菌株的分生孢7
子稀释成浓度为10cfu/mL的孢子悬浮液，吸取500μ1涂布在一个9cm的PDA平板上，置于
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30℃下，培养至第5天便可收获大量的分生孢子(2.8×10 个/mL)；也可采用液体培养法，将在9cm PDA平板上生长5d的长枝木霉菌孢子，用无菌水。10mL洗下，用血球计数器调制
7
成浓度为10cfu/mL的孢子悬浮液，每250mL三角瓶中加40、80mL PDB培养液，每瓶接种孢子悬浮液1mL，在30℃、150r/min下振荡培养，第5天便可收获大量分生孢子，其中40mLPDB
7 7
培养液中获得2.59×10 个/mL孢子、80mL PDB培养液中获得1.72×10 个/mL孢子；也可
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采用半液体半固体法，即是将10cfu/mL的孢子悬浮液，按1∶5比例与灭菌的木屑麦麸培养基(木屑50g+麦麸100g，加水300ml)混匀，覆盖两层高压灭菌后的纱布，置于30℃消过
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毒的培养箱内培养10天，取1g培养料溶于20ml无菌水中测得分生孢子数为1.59×10 个/g，将培养料收起晾干，包装好后贮藏在冷凉处备用。

附图说明

[0017] 说明书附图1：长枝木霉T05菌株在PDA培养基上生长3d的菌落形态。 [0018] 说明书附图2：长枝木霉T05菌株在MEA培养基上生长5d的菌落形态。 [0019] 说明书附图3：长枝木霉T05菌株的分生孢子梗、安瓶状瓶梗。

[0020] 说明书附图4：长枝木霉T05菌株的分生孢子(600×)。

具体实施方式

[0021] 1)首先从黑龙江省大庆市林业局红旗林场20年生的小黑杨树林下的枯枝落叶中分离到供试的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum Rifai)菌株T05，在PDA平板培养基上，于25℃下培养该真菌菌株，可观察到菌株生长很快。该真菌菌株可采用3种方法培养，一种为平板法，即将菌株的分生孢子稀释成100倍显微镜视野下50～100个分生孢子，涂布在PDA平板上，置于30℃下，培养至第5天便可收获大量分生孢子；另一种为液体培养7
法，即将菌株的分生孢子调制成浓度为10cfu/mL的孢子悬浮液，每250mL三角瓶中加40～
80mL PDB培养液，每瓶接种孢子悬浮液1mL，在30℃、150r/min下振荡培养，第5天便可收
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获大量分生孢子；第3种为半液体半固体法，即将10cfu/mL的孢子悬浮液，按1∶5～8比例与灭菌的麦麸混匀，覆盖以70％酒精消过毒的塑料膜，置于30℃消过毒的室内培养3～
4天，打开塑料膜，产孢3～5天；连同培养料收起，晾干，包装好后贮藏在冷凉处备用。该真菌菌株的宏观培养特性为：在PDA培养基上菌落生长快，2～3d内覆盖平板(直径9cm)，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状，边缘均匀，毡状。菌落初为白色，1d以后产生分生孢子簇的绿色同心环，间距1.0cm，非常清晰。生长新区的产孢簇为白色，靠近老区的产孢簇一部分由白色渐变为绿色，接种点周围全部被绿色孢子覆盖。菌落最终大部分变为绿色。反面变黄。在MEA培养基上气生菌丝体稀疏，菌落边缘均匀，紧贴生。菌落初为白色，后变绿色，具较清晰的窄细的产孢簇同心环纹，间距0.5cm。该真菌菌株在光学显微镜下的显微形态特征为：在PDA培养基上分生孢子梗具有简单的分枝系统，主轴宽2.0～3.0μm，二次分枝有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布，时常单生，安瓿形或柱形，略呈弯曲状，基部常收缩。分生孢子单细胞、椭圆形、绿色、光滑，大小为2.0～3.0μm×2.0～6.0μm。厚垣孢子顶生或间生，圆形或椭圆形，大小为4.0～6.5μm×4.0～12.5μm。通过PCR扩增出该菌株的ITS序列(NCBI登录号EU769111)和tef1序列(NCBI登录号EU839839)，TrichOKey v.2.0、TrichoMARK和TrichoBLAST的鉴定结果都表明该菌株为长枝木霉(T.longibrachiatum)，系统发育学的鉴定结果与形态学的鉴定结果相同。

[0022] 2)野外对树木皮部病害的施药方式：①将菌袋培养的木霉作为菌剂的主要成分，辅以少量助剂，并以水为溶剂制成木霉菌的水浮颗粒剂。用这种制剂对杨树烂皮病等皮部病害进行刮皮涂药，用刀刮除发病的腐烂皮部，将死皮刮净，直到露出健康树皮为止。将配8
制好的菌剂加水稀释到孢子浓度为1×10 个/mL，混匀后用涂料刷蘸取菌剂涂抹在整个刮除的表面。从春季树液开始活动、菌丝开始扩展到病害症状大发生之间的一段时间连续施药防治2～3次，在北方可在3月末和4月初开始～5月初这段时间进行。②对于树皮上有许多小病斑的皮部病害，采用林间喷雾的方式，将配制好的菌剂加水稀释到孢子浓度为
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1×10 个/mL，用高效喷雾器向整个树干、树冠、林内和林下喷雾。

[0023] 3)对杨树烂皮病的大田防治：用这种木霉制剂对5年生杨树人工林烂皮病刮皮涂药的大田防治结果表明，防治后80％的烂皮病斑几乎全部愈合，新生的树皮逐渐包围了原来露出的木质部，其余20％的烂皮病斑也正在愈合，树木生长旺盛，长势很好，生长量明显增加。绝大部分原来烂皮的部分没有再出现病原菌的子座，表明病害已被抑制住。 [0024] 4)对杨树水泡溃疡病的大田防治：用这种木霉制剂对15～20年生杨树人工林水泡溃疡病进行树干喷雾的大田防治结果表明，绝大多数溃疡病斑消失和缩小了，树木的生长势得到了恢复，制剂对杨树水泡溃疡病具有很好的治疗作用，

[0025] 5)进行长枝木霉菌株T05与杨树烂皮病菌(Cytosprora chrysosperma)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、杨树灰斑病菌(Coryneum populinum)的平板对峙培养：将2
木霉菌株和病菌菌株用打孔器打成直径5mm 的菌丝饼，分别接入9cm的PDA培养皿的两端，以只接病原菌不接木霉为对照。将培养皿置于25℃下培养，每24h测量菌落相向半径并观察木霉菌对病原菌的覆盖情况。每处理设3组重复。抑菌率的计算式为：抑菌率(％)＝〔(对照病菌菌落平均半径-处理病菌菌落平均半径)/对照病菌菌落平均半径」×100％ [0026] T05号长枝木霉菌株对3种供试病菌显示了很强的对峙能力和竞争力与抑制作用，分别经过10d和144h将杨树烂皮病菌和水稻稻瘟病菌全部覆盖，随着时间的推移，对病菌的抑菌率增加(见表1)。

[0027] 6)其他的拮抗机制研究表明，长枝木霉菌株T05的发酵液和挥发性物质对杨树烂皮病菌和水稻稻瘟病菌都有抑制作用。

[0028] 表1木霉T05菌株对杨烂皮病菌、水稻稻瘟病菌、杨树灰斑病菌的抑菌率 [0029]

[0030] 长枝木霉菌株T05ITS和tef序列表

[0031] <110>东北林业大学

[0032] <120>一种长枝木霉真菌菌株

[0033] <140>200910072978.8

[0034] <141>2009-12-10

[0035] <160>2

[0036] <170>PatentIn version 3.3

[0037] <210>1

[0038] <211>639

[0039] <212>DNA

[0040] <213>长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)

[0041] <220>

[0042] <221>18S rRNA

[0043] <222>(1)..(26)

[0044] <220>

[0045] <221>ITS1

[0046] <222>(27)..(249)

[0047] <220>

[0048] <221>5.8S rRNA

[0049] <222>(250)..(407)

[0050] <220>

[0051] <221>ITS2

[0052] <222>(408)..(576)

[0053] <220>

[0054] <221>28S rRNA

[0055] <222>(577)..(639)

[0056] <400>1

[0057] cccgattggg gacgcggatg gacattaccg agtttacaac tcccaaaccc caatgtgaac 60 [0058] gttaccaatc tgttgcctcg gcgggattct cttgccccgg gcgcgtcgca gccccggatc 120 [0059] ccatggcgcc cgccggagga ccaactccaa actctttttt ctctccgtcg cggctcccgt 180 [0060] cgcggctctg ttttattttt gctctgagcc tttctcggcg accctagcgg gcgtctcgaa 240 [0061] aatgaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg 300 [0062] aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca 360 [0063] ttgcgcccgc cagtattctg gcgggcatgc ctgtccgagc gtcatttcaa ccctcgaacc 420 [0064] cctccggggg gtcggcgttg gggatcggcc cctcaccggg ccgcccccga aatacagtgg 480 [0065] cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac tcgcaccggg agcgcggcgc 540 [0066] ggccacagcc gtaaaacacc ccaaacttct gaaatgttga cctcggatca ggtaggaata 600 [0067] cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaaataa 639 [0068] <210>2

[0069] <211>228

[0070] <212>DNA

[0071] <213>长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)

[0072] <220>

[0073] <221>exon

[0074] <222>(1)..(43)

[0075] <220>

[0076] <221>Intron

[0077] <222>(44)..(107)

[0078] <220>

[0079] <221>exon

[0080] <222>(108)..(228)

[0081] <400>2

[0082] cta ggg gag ttc gag act acc agt act atg tca ccg tca ttg g 43 [0083] Leu Gly Glu Phe Glu Thr Thr Ser Thr Met Ser Pro Ser Leu

[0084] 1 5 10

[0085] tatgtttgat cccttgcact cactgcatca tcgccacaac aacatactaa tgccctctga 103 [0086] caga cg ctc ccg gcc acc gtg att tca tca aga aca tga tca ctg gta 151 [0087] Ala Leu Pro Ala Thr Val Ile Ser Ser Arg Thr Ser Leu Val [0088] 20 25

[0089] ctt ccc agg ccg act gcg cta ttc tca tca tcg ccg ccg gta ctg gtg 199 [0090] Leu Pro Arg Pro Thr Ala Leu Phe Ser Ser Ser Pro Pro Val Leu Val [0091] 30 35 40

[0092] agt tcg agg ctg gtc tcc aag gat ggc aa 228 [0093] Ser Ser Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly

[0094] 45 50