一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法转让专利
申请号 : CN200910154187.X
文献号 : CN101701043A
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 殷文静 , 王松叶 , 詹金明 , 陈志伟
申请人 : 浙江澳兴生物科技有限公司
摘要 :
本发明提供了一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，属于新型生物工程技术领域。它解决了现有的硫酸软骨素提取步骤多，工艺流程繁琐，产品得率低，蛋白质和氮杂质含量较高的问题。本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法包括以下步骤：A、碱提；B、酶解；C、超滤；D、氧化、结晶。本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程简单，工艺步骤较少，易于操作可实现大规模的工业化生产，且产品的收率可以达到17％-22％，纯度可以达到90-96％。
权利要求 :
一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，该方法包括以下步骤：A、碱提：选择鲨鱼软骨脱脂后将其粉碎，加入碱溶液和氯化钠溶液在温度为20-60℃的条件下提取1-10小时，过滤后调滤液pH值为8.5-9.0；B、酶解：将上述碱提后的滤液中加入到酶反应器中，加入为软骨投料重量1.0％-5.0％的固定化酶，在pH值为2.0-9.0，温度为45-55℃的条件下酶解2-10小时；C、超滤：将酶解后的滤液脱色后，在室温下超滤脱水浓缩至原体积的1/3-1/2；D、氧化、结晶：将超滤脱水后的浓缩液调pH值为8.5-9.0，加入为软骨投料重量0.5％-3％的双氧水，在温度为15-40℃的条件下氧化3-8小时过滤，滤液调pH值为5.0-6.0，加入95％乙醇结晶，使乙醇浓度达65-75％，结晶后离心、洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素。
2. 根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤A中所述的鲨鱼软骨为鲨鱼头软骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨、鲨鱼翅软骨中的一种或多种。
3. 根据权利要求1或2所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤A中所述的碱溶液为浓度为2% _5%的氢氧化钠溶液，所述的氯化钠溶液的浓度为1% _3%，所述的氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的4-6倍。
4. 根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤B中所述的酶反应器为连续搅拌釜式反应器、固定床式反应器、流化床式反应器其中的一种。
5. 根据权利要求1或4所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤B中所述的固定化酶为固定化木瓜蛋白酶、固定化胰蛋白酶、固定化胃蛋白酶、固定化微生物碱性蛋白酶中的一种或多种。
6. 根据权利要求5所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤B中所述的固定化酶固定化方法为包埋法或交联法中的一种或两种；所述的包埋法采用的载体为海藻酸钠或海藻酸钠和壳聚糖，所述的交联法采用的载体为壳聚糖，采用的交联剂为戊二醛。
7. 根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤C中所述的超滤脱水采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、巻式超滤膜、平板式超滤膜中一种。
8. 根据权利要求1或7所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤C中所述的超滤膜截留分子量为5， 000-10， 000。
9. 根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于：步骤D中所述的双氧水的用量为软骨投料量的1% _2%，氧化温度为25-35t:，氧化时间为4-6小时。
说明书 :
一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法，具体地说涉及一种鲨鱼硫酸软骨素的提 取方法；属于新型生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 硫酸软骨素是从动物组织中提取的黏多糖类物质，其基本单位是D-葡萄糖醛酸 和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯。 一般硫酸软骨素约含50-70个二糖单位，平均分子量 10000-30000。分子中带有大量的负电荷，具有调脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性， 对维持细胞环境的相对稳定性和正常功能具有重要作用。
[0003] 硫酸软骨素能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代 谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水 分代谢，对角膜有较强的亲和力，能在角膜表面形成一层透气保水膜，促进角膜创伤的愈合 及改善眼部干燥症状。
[0004] 硫酸软骨素能将水分吸入蛋白多糖分子内，使软骨变厚及有如海绵般，并增加关 节内的滑液量。如此一来，它便能提供"垫衬"作用以增强关节的减震能力和缓和行走或跳 动时的冲击和摩擦。硫酸软骨素还作为输送管道，为软骨输送重要的氧和营养素，同时把二 氧化碳和废物加以排除。硫酸软骨素还可以抑制破坏软骨的酵素（例如胶原酶、弹性蛋白 酶和组织蛋白酶），以免软骨被分解或溶解。
[0005] 自然界中的硫酸软骨素多存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨，鱼类软骨中含量也很丰 富，结缔组织含量很少。目前，市场上硫酸软骨素多从猪、牛、羊等动物软骨中提取，该类动 物的软骨中硫酸软骨素含量和产品价值都较低。而从鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素属 于纯天然海洋生物活性物质，能够降血脂、抗衰老、防止动脉粥样硬化，在防治冠心病和心 肌梗塞等心血管疾病中有较好的疗效；还能调节关节机能，用于治疗关节炎和预防结缔组 织相关的疾病；并且具有抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力的作用。鲨鱼硫酸软骨素以其独 特的生物活性功能在医药和保健品中有着广泛的应用。
[0006] 采用传统的稀碱、稀碱-盐、稀碱-酶等提取硫酸软骨素的方法，产品得率低，蛋白 质和氮杂质含量较高；中国专利申请（公开号：CN101358220A)涉及鲨鱼软骨中提取硫酸软 骨素钙的方法，该方法包括有熟化、碱化、酶解、去蛋白、结晶、树脂预处理、树脂交换、超滤 脱水、滤液钙化、结晶脱水干燥各工序过程组成。虽然采用该方法可以提高鳖鱼硫酸软骨素 的纯度，节约乙醇的使用量。但是该方法不仅工艺步骤多，工艺流程繁琐；而且酶解后需要 升温将酶灭活过滤，酶不能反复使用，不能进行连续化生产。
发明内容
[0007] 本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，该方法不仅可以大大减少酒精的用量以及酒精回收的能耗，而且实现连续化生产。
[0008] 本发明的目的是通过下列技术方案来实现的：一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，3该方法包括以下步骤：
[0009] A、碱提：选择鲨鱼软骨脱脂后将其粉碎，加入碱溶液和氯化钠溶液在温度为 20-60°C的条件下提取1-10小时，过滤后调滤液pH值为8. 5-9. 0 ;
[0010] B、酶解：将上述碱提后的滤液中加入到酶反应器中，加入为软骨投料量 1.0% _5.0%的固定化酶，在。11值为2. 0-9.0，温度为45-55"的条件下酶解2-10小时； [0011] C、超滤：将酶解后的滤液脱色后，在室温下超滤脱水浓縮至原体积的1/3-1/2 ; [0012] D、氧化、结晶：调超滤脱水后的浓縮液pH值为8.5-9.0，加入为软骨投料量 0. 5% -3%的双氧水，在温度为15-4(TC的条件下氧化3-8小时过滤，调滤液pH值为 5. 0-6. O，加入95%乙醇结晶，使乙醇浓度达65-75%，结晶后离心、洗涤、干燥后得到鲨鱼 硫酸软骨素。
[0013] 本发明步骤A中脱脂的具体过程是：取鲨鱼软骨在沸水中蒸煮2-6h，冲洗干净，用 乙醇或丙酮浸泡30min去除油脂。碱提过程中采用间歇搅拌可增大碱和软骨的接触面积， 加快碱提速度。为了提高鲨鱼硫酸软骨素的收率，过滤后的残渣需要用蒸馏水浸泡后再次 过滤，合并过滤液，用HC1调pH值至8. 0-9. 0。
[0014] 步骤B中按鲨鱼软骨重量百分比的1. 0% -5. 0%加入固定化酶。在该重量百分比 范围内，产品的纯度达95%以上，收率达17%以上，氮含量<2.8%。酶解过程中保持pH值 为2. 0-9. 0。
[0015] 步骤C中脱色采用活性炭和硅藻土脱色，具体的脱色过程是：将滤液升温至60°C 左右加入为软骨投料量0. 5% _5%的活性炭和适量硅藻土，慢慢搅拌20-40分钟，压滤。脱 色不仅可吸附小分子色素杂质，使产品颜色洁白；而且可以部分吸附蛋白、多肽、氨基酸类 杂质，使溶液澄清，防止堵塞超滤膜或者延长超滤膜清洗周期。
[0016] 步骤D中采用氢氧化钠溶液调浓縮液pH值为8. 5-9. O，采用盐酸溶液调滤液pH值 为5. 0-6. 0。
[0017] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤A中所述的鲨鱼软骨为鲨鱼头软 骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨、鲨鱼翅软骨中的一种或多种。鲨鱼软骨中硫酸软骨素含量 高达50-60% ，且市场价值比普通动物来源的硫酸软骨素高。鲨鱼软骨种类很多，有不同来 源的鲨鱼，同种鲨鱼还可以有不同部位的骨头。可采用的软骨包括头骨、尾骨、中骨、翅骨、 牙骨。这些部位的软骨产品得率较高，可达11%以上。
[0018] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤A中所述的碱溶液为浓度为 2% _5%的氢氧化钠溶液，所述的氯化钠溶液的浓度为1% _3%，所述的氢氧化钠溶液和氯 化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的4-6倍。鲨鱼硫酸软骨素和蛋白共价连接成糖蛋 白，氢氧化钠溶液可以切断糖苷键，使糖蛋白水解，释放出游离的硫酸软骨素，同时使杂质 蛋白部分水解。但氢氧化钠溶液的浓度过高会使产品色泽加深，并使硫酸软骨素部分降解。 氯化钠溶液可提高离子强度，促进糖蛋白的解离，并有利于后续乙醇沉淀。但氯化钠溶液的 浓度过高在乙醇沉淀中会成为夹杂析出，增大灰分杂质含量。
[0019] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤B中所述的酶反应器为连续搅拌釜 式反应器、固定床式反应器、流化床式反应器其中的一种。作为优选，所采用的酶反应器为 流化床式反应器。本发明采用流化床式反应器与固定床式反应器相比，具有以下优点是：可 以实现固体物料的连续输入和输出；流体和颗粒的运动使床层具有良好的传热性能，床层内部温度均匀，而且易于控制，特别适用于强放热反应。
[0020] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤B中所述的固定化酶为固定化木瓜 蛋白酶、固定化胰蛋白酶、固定化胃蛋白酶、固定化微生物碱性蛋白酶中的一种或多种。所 述的固定化微生物碱性蛋白酶可以为固定化枯草杆菌蛋白酶等。作为优选，所述的固定化 酶为固定化木瓜蛋白酶。上述酶都是非专一性蛋白酶，即能够对各种蛋白质进行水解。不 同酶其作用的pH不同，碱性蛋白酶、胰蛋白酶最适pH为碱性，胃蛋白酶为酸性，木瓜蛋白酶 近中偏碱。不同酶作用效果要视底物蛋白而定。本发明优选采用木瓜蛋白酶有以下好处： 1、木瓜蛋白酶是植物性蛋白酶，适合于保健食品、药品生产过程2、木瓜蛋白酶固定化工艺 条件简单，固定化后酶活力回收较高3、用固定化木瓜蛋白酶酶解产品收率与采用其它固定 化酶酶解相比稍高。
[0021] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤B中所述的固定化酶固定化方法为 包埋法或交联法中的一种或两种；所述的包埋法采用的载体为海藻酸钠或海藻酸钠和壳聚 糖，所述的交联法采用的载体为壳聚糖，采用的交联剂为戊二醛。本发明采用固定化酶与现 有技术采用的一般游离的酶制剂相比不但具有高度专一性、催化效率高及作用条件温和， 而且比游离的酶制剂稳定，使用寿命长，可反复使用多次，能使生产管道化、连续化和自动 化，不会污染反应液，产物的分离提纯简单，收率高，酶活损失少。可以实现大规模工业化 生产鲨鱼硫酸软骨素。固定化酶的制备方法有物理吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法。 本发明优选采用交联法和包埋法，其中交联法中依靠壳聚糖和戊二醛双功能基团，使酶蛋 白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶。包埋法采用海藻酸钠或海藻酸钠 和壳聚糖制成凝胶或半透膜，将蛋白酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束 内。采用海藻酸钠和壳聚糖作为固定化载体。具有以下优点：首先两者都是天然高分子凝 胶物质，来源丰富、价格低廉、无毒安全、生物相容性好。其次海藻酸钠作为酶包埋的载体， 固定化方法简单，条件温和，酶活损失少。再次壳聚糖分子含有游离氨基，易于使酶固定化， 固定化酶性质稳定。海藻酸钠_壳聚糖固定化木瓜蛋白酶，其热稳定性好，半衰期长，凝胶 硬度较高，可用于装柱使用，便于工业自动化生产。
[0022] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤C中所述的超滤脱水采用的超滤膜 为中空纤维式超滤膜、巻式超滤膜、平板式超滤膜中一种。作为优选，本发明采用中空纤维 式超滤膜。中空纤维式超滤膜不仅单位面积所占空间小；而且中空纤维式超滤膜采用的是 错流过滤，减轻了膜污染和浓差极化的程度，膜通量下降慢，清洗频率低。 [0023] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，步骤C中所述的超滤膜截留分子量为 5， 000-10， 000。本发明提取方法中的截留分子量视待浓縮料液的组成而定。分子量太大， 产物会透过膜孔，达不到浓縮的目的；分子量太小，杂质分子不能透过膜孔，从而达不到分 离杂质的目的。
[0024] 在上述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法中，作为优选，步骤D中所述的双氧水的用 量为软骨投料量的1% _2%，氧化温度为25-35t:，氧化时间为4-6小时。 [0025] 综上所述：本发明具有以下优点：
[0026] 1、本发明采用鲨鱼软骨来提取鲨鱼硫酸软骨素，鲨鱼软骨中硫酸软骨素含量高达 50-60%，且市场价值比动物来源的硫酸软骨素高。在提取过程采用固定化酶酶解代替传统 的游离酶酶解工艺，酶解结束后反应液流出酶反应器，固定化酶可以回收再利用且可以实5现连续化生产；酶解液使用超滤膜浓縮工艺，大大减少了酒精的用量以及酒精回收的能耗， 并提高了产品的收率和纯度。最终产品的收率可以达到17% _22，纯度可以达到90-96%。 [0027] 2、本发明鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程简单，工艺步骤较少，易于操作可 实现大规模的工业化生产。
附图说明：
附图说明：
[0028] 图1是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法工艺流程图。 [0029] 图2是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法在酶解过程中的工艺流程图。 [0030] 图3是本鲨鱼硫酸软骨素的提取方法在超滤过程中的工艺流程图。 [0031] 图4是采用本方法提取的鲨鱼硫酸软骨素的高效液相色谱图。
[0032] 图中，1、流化床；3、酶解循环罐；4、酶解循环泵；la、中空纤维超滤膜；3a、超滤循 环罐、4a、超滤循环泵。
具体实施方式
[0033] 下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但是本发明并不限于这些实施例。 [0034] 实施例1
[0035] 选取鲨鱼头软骨200g，在沸水中蒸煮2-6h，冲洗干净，用乙醇或丙酮浸泡30min去 除油脂。脱脂后的鲨鱼软骨打成碎片，加入800g浓度为5% NaOH溶液和800g浓度为3%食 盐溶液，在温度为2(TC的条件下间歇搅拌碱提取10h，过滤，残渣用适量蒸馏水浸泡过滤， 合并两次滤液，并用HC1调pH值至8. 0。
[0036] 选用木瓜蛋白酶，采用普通交联固定化方法将其制成4g固定化木瓜蛋白酶。其中 以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂进行固定化。如图2所示，在流化床式反应器1中加入固 定化木瓜蛋白酶，将碱提后的滤液加入到酶解循环罐3中由酶解循环泵4打入到流化床式 反应器1在温度为45t:的条件下保温酶解10小时；酶解液进入酶解循环罐3中循环直至 酶解结束，从酶解循环罐3出料，新的碱提液进入流化床式反应器开始下一轮操作。在酶解 过程中用氢氧化钠溶液调整pH为8. 0。酶解结束后，将滤液升温至60°C ，加入0. 5-5%活性 炭和适量硅藻土，慢速搅拌20-40min，板框压滤。
[0037] 如图3所示，选用截断分子量5000的中空纤维超滤膜浓縮，将上述滤液放入到超 滤循环罐3a中由超滤循环泵4a打入若干个中空纤维超滤膜la，各个中空纤维超滤膜中 循环液的浓度一次升高，最后一个中空纤维超滤膜引出达到要求的浓縮液从超滤循环罐 3a中流出，杂质溶液透过中空纤维超滤膜管壁，在管间汇合后排出。超滤过程中进料温度 20°C，中空纤维超滤膜压力0. 6MPa，浓縮液的体积是原体积1/3。
[0038] 浓縮液用碱调pH至9. 0，加入4g的双氧水，15t:氧化8h，过滤。过滤后用盐酸调节 氧化后滤液pH至5. 0，加入浓度为95 %的乙醇结晶，最终使溶液中乙醇终浓度达65 % ，沉淀 8-12h后离心得粗品。用蒸馏水洗涤、干燥后得到鲨鱼硫酸软骨素产品，整个工艺流程图如 图1所示，提取的鲨鱼硫酸软骨素产品收率为22%，纯度为93. 86%。高效液相色谱（HPLC) 图如图4所示，结果如表1所示。
[0039] 本鲨鱼硫酸软骨素高效液相色谱试验中流动相：辛烷磺酸钠：乙腈=90 : io ;流量：0. 6ml/min ;浓度：0. 304mg/ml ;体积：20 ii 1。
[0040] 表1 :本鲨鱼硫酸软骨素高效液相色谱分析结果表
[0041]table see original document page 7