一株产气肠杆菌及其应用转让专利
申请号 : CN200910232709.3
文献号 : CN101701199A
文献日 : 2010-05-05
发明人 : 徐幸莲 , 卢士玲 , 周光宏 , 刘登勇 , 舒蕊华
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3163的一株产气肠杆菌，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，为粉红色圆形菌落，不透明，直杆，周生鞭毛，革兰氏阴性，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气，VP试验、明胶水解阳性，在普通显微镜下杆状。应用时，菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，反复活化五次后；将菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，将菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度液；其中，A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
权利要求 :
1.一株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3163的菌株，菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，粉红色圆形菌落，不透明，直杆，周生鞭毛，革兰氏阴性，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气，VP试验、明胶水解阳性，该菌株在普通显微镜下杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890355。
2.根据权利要求1所述的一株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，其特征在于：VRBDA琼脂培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
3.保藏号为CGMCC No.3163的一株产气肠杆菌的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度液，尸胺含量为3279.24μg/ml；
所述的A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
4.根据权利要求3所述保藏号为CGMCC No.3163的一株产气肠杆菌的应用，其特征在于：所述的肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，在115℃灭菌15min。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一株微生物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
尸胺的化学名称为1，5-戊二胺，可用于有机合成、生物化学试剂和医药中间体，目前，我国尸胺及其衍生物的需求量大，但国内尚无企业能生产出合格产品，从国外进口价格很高。
传统的尸胺是利用赖氨酸进行化学合成，合成率低，副产物多，成体高。
通过微生物代谢产生尸胺(赖氨酸在微生物产生的赖氨酸脱羧酶的作用下，脱羧产生尸胺)，获得高浓度尸胺培养液，然后分离尸胺，可降低尸胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要课题。
传统的尸胺是利用赖氨酸进行化学合成，合成率低，副产物多，成体高。
通过微生物代谢产生尸胺(赖氨酸在微生物产生的赖氨酸脱羧酶的作用下，脱羧产生尸胺)，获得高浓度尸胺培养液，然后分离尸胺，可降低尸胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前尸胺生产存在的问题，提供一种微生物并通过该微生物代谢产生尸胺，获得高浓度尸胺培养液。
本发明的目的是这样实现的：一株产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3163，菌落在MRS琼脂培养基上，30℃培养24h，乳白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890355。
在本发明中，VRBDA琼脂培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
一种保藏号为CGMCC No.3163的菌株的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度液，尸胺含量为3279.24μg/ml；
所述的A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
在本发明中：所述的肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，在115℃灭菌15min。
本发明的优点在于：由于产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)xlcad002产尸胺能力强，在上述方法制得的培养液中，尸胺含量可达到3279.24μg/ml，用此方法生产尸胺将极大降低生产成本和减少污染。
本发明的目的是这样实现的：一株产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002，其特征在于：保藏号为CGMCC No.3163，菌落在MRS琼脂培养基上，30℃培养24h，乳白色菌落，1.0-1.5×0.3-0.6μm，短杆，革兰氏阴性，发酵葡萄糖产酸，该菌株在普通显微镜下杆状，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890355。
在本发明中，VRBDA琼脂培养基为：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
一种保藏号为CGMCC No.3163的菌株的应用，其特征在于：从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度液，尸胺含量为3279.24μg/ml；
所述的A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
在本发明中：所述的肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，在115℃灭菌15min。
本发明的优点在于：由于产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)xlcad002产尸胺能力强，在上述方法制得的培养液中，尸胺含量可达到3279.24μg/ml，用此方法生产尸胺将极大降低生产成本和减少污染。
附图说明
图1是产气肠杆菌在普通显微镜下的照片；
图2是检测产气肠杆菌扩增的DNA片断电泳图；
图3是生物胺标样的高效液相色谱图；
图4是高效液相检测产气肠杆菌培养液色谱图。
图5尸胺检测的标准曲线图。
图2是检测产气肠杆菌扩增的DNA片断电泳图；
图3是生物胺标样的高效液相色谱图；
图4是高效液相检测产气肠杆菌培养液色谱图。
图5尸胺检测的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
菌株的筛选和保藏
培养基
肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，在115℃灭菌15min；
下层培养基：蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2.5g，葡萄糖0.5g，吐温1g，硫酸镁0.4g，硫酸锰0.03g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，碳酸钙0.1g，硫酸亚铁0.04g，维生素B10.01g，磷酸吡哆醛0.05g，琼脂18克。腐氨酸，各5克，1000ml蒸馏水。pH5.0(115℃高压灭菌15分钟)；
上层培养基：溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5.0(121℃灭菌10min)；
VRBDA琼脂培养基：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
在无菌条件下取20克传统中式香肠，无菌条件下剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三角瓶中，室温230转摇床摇10分钟，取1ml接种于肠道菌增菌肉汤培养基中，37℃培养24小时，取1ml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于产尸胺检测下层培养基上，37℃培养48小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内结果记录完毕，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为能产生腐胺的菌株，阴性为不能产生腐胺的菌株。
挑取阳性菌株，在VRBDA固体培养基上纯化三次以上，用肠细菌增生肉汤培养基37℃培养24小时，离心后获得产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002菌株。
该菌株的菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，粉红色圆形菌落，不透明，直杆，周生鞭毛，革兰氏阴性，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气，VP试验、明胶水解阳性。
该菌株根据Gen bank比对结果，命名为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002，2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3163。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890355。
该菌株加入无菌甘油，在-80℃冰箱保存。
实施例2
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)xlcad002的基因检测
检测赖氨酸脱羧酶基因的引物
CAD1-f：5‘-TTYGAYWCNGCNTGGGTNCCNTAYAC-3’；
CAD1-r：5‘-CCRTGDATRTCNGTYTCRAANCCNGG-3’；
检测方法：
25μl反应体系包括：GoTaq Green Master Mix 12.5μl，每种引物各1.0μl，DNA模版2μl，去离子双蒸水8.5μl.
PCR扩增程序：94℃预变性5min，30个循环包括：95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，最终72℃延伸7min，冷却至4℃。
用检测赖氨酸脱羧酶的特异性引物CAD1-f和CAD1-r，可成功扩增出1098bp的基因片段，在图2中，泳道1为本研究扩增出来的基因片段，泳道n为阴性对照。可见，在产气肠杆菌中存在赖氨酸脱羧酶基因。
实施例3
高浓度尸胺培养液制备方法
肠道菌增菌肉汤培养基(同实施例1)；
制备方法
从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度尸胺液.
所述的A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
实施例4
腐胺含量检测方法(高效液相检测)
1、生物胺标准溶液的配制
准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL，制成1mg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成终浓度分别为5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液，避光、4℃冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化
取实施例3的样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化
分别取5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶液的衍生物。
4、检测方法为：
Waters Alliance2695液相检测系统，色谱柱为AgilentZORBAXXDB-C18(4.6×250mm2，5μm)，流速为1mL·min-1，紫外检测波长为254nm，进样量20μL，柱温30℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
在图3的生物胺标样的高效液相图中：1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺，5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图4所示。由图4可见，样品溶液中含有尸胺。
利用上述的检测方法检测，响应值为17403574.28(参见图5)，根据标准曲线计算得到结果为327.924μg/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了10倍，所以最终尸胺含量为3279.24ug/mg。
以上各实施例不是对本发明的具体限定。
菌株的筛选和保藏
培养基
肠道菌增菌肉汤培养基：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钠8g，蒸馏水1000mL，pH值7.2～7.4，在115℃灭菌15min；
下层培养基：蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2.5g，葡萄糖0.5g，吐温1g，硫酸镁0.4g，硫酸锰0.03g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，碳酸钙0.1g，硫酸亚铁0.04g，维生素B10.01g，磷酸吡哆醛0.05g，琼脂18克。腐氨酸，各5克，1000ml蒸馏水。pH5.0(115℃高压灭菌15分钟)；
上层培养基：溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5.0(121℃灭菌10min)；
VRBDA琼脂培养基：酵母浸膏3g，蛋白胨7g，胆盐1.5g，氯化钠5g，乳糖10g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH值7.3-7.5。
在无菌条件下取20克传统中式香肠，无菌条件下剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三角瓶中，室温230转摇床摇10分钟，取1ml接种于肠道菌增菌肉汤培养基中，37℃培养24小时，取1ml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于产尸胺检测下层培养基上，37℃培养48小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内结果记录完毕，显紫色的菌落为阳性，显黄色为阴性，其中，阳性为能产生腐胺的菌株，阴性为不能产生腐胺的菌株。
挑取阳性菌株，在VRBDA固体培养基上纯化三次以上，用肠细菌增生肉汤培养基37℃培养24小时，离心后获得产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002菌株。
该菌株的菌落在VRBDA琼脂培养基上，30℃培养24h，粉红色圆形菌落，不透明，直杆，周生鞭毛，革兰氏阴性，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气，VP试验、明胶水解阳性。
该菌株根据Gen bank比对结果，命名为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)xlcad002，2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3163。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890355。
该菌株加入无菌甘油，在-80℃冰箱保存。
实施例2
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)xlcad002的基因检测
检测赖氨酸脱羧酶基因的引物
CAD1-f：5‘-TTYGAYWCNGCNTGGGTNCCNTAYAC-3’；
CAD1-r：5‘-CCRTGDATRTCNGTYTCRAANCCNGG-3’；
检测方法：
25μl反应体系包括：GoTaq Green Master Mix 12.5μl，每种引物各1.0μl，DNA模版2μl，去离子双蒸水8.5μl.
PCR扩增程序：94℃预变性5min，30个循环包括：95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，最终72℃延伸7min，冷却至4℃。
用检测赖氨酸脱羧酶的特异性引物CAD1-f和CAD1-r，可成功扩增出1098bp的基因片段，在图2中，泳道1为本研究扩增出来的基因片段，泳道n为阴性对照。可见，在产气肠杆菌中存在赖氨酸脱羧酶基因。
实施例3
高浓度尸胺培养液制备方法
肠道菌增菌肉汤培养基(同实施例1)；
制备方法
从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，接种量为106cfu/ml；将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度尸胺液.
所述的A培养基为加入0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基；所述的B液体培养基为加入0.005％磷酸吡哆醛和0.1％赖氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。
实施例4
腐胺含量检测方法(高效液相检测)
1、生物胺标准溶液的配制
准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50mL，制成1mg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成终浓度分别为5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液，避光、4℃冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化
取实施例3的样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化
分别取5.0、10、20、30、40、50μg/ml的标准溶液样品1mL于5ml容量瓶中，加入200μL的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300μL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于40℃水浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0.22μm的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶液的衍生物。
4、检测方法为：
Waters Alliance2695液相检测系统，色谱柱为AgilentZORBAXXDB-C18(4.6×250mm2，5μm)，流速为1mL·min-1，紫外检测波长为254nm，进样量20μL，柱温30℃，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
在图3的生物胺标样的高效液相图中：1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺，5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图4所示。由图4可见，样品溶液中含有尸胺。
利用上述的检测方法检测，响应值为17403574.28(参见图5)，根据标准曲线计算得到结果为327.924μg/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了10倍，所以最终尸胺含量为3279.24ug/mg。
以上各实施例不是对本发明的具体限定。