青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用

摘要

本发明提供青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用。该组合物含有青蒿，鳖甲胶，地黄，知母，牡丹皮五味中药，其制剂形式为固体制剂。本发明提供的组合物在抗肿瘤慢性炎症反应中有活性，可用于肿瘤炎症反应与血管生成过程的治疗，可作为肿瘤化疗过程的辅助治疗药物增强化疗药物抗肿瘤疗效。本发明以肿瘤在低氧微环境中能诱导产生多种细胞及细胞因子为理论背景，研究并阐明该中药组合物“入络剔邪，引邪外出”的神奇功能，为发掘中药名优方剂新的临床价值提供重要依据，是发展中医药理论新的重要方向。

权利要求

1.青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用，所述组合物由青蒿80g鳖甲胶13.4g地黄160g知母80g牡丹皮120g组成。

2.根据权利要求1所述的青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用，其特征在于，在制备增强环氧化酶2抑制剂抗肿瘤慢性炎症反应药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用，其特征在于，在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效药物中的应用。

说明书

青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属中药方剂的用途，涉及青蒿鳖甲方在增强化疗药物抗肿瘤疗效方面的药物用途。

背景技术

[0002] 青蒿鳖甲方出自清代吴鞠通《温病条辨》。原方组成：青蒿6g，鳖甲15g，地黄12g，知母6g，牡丹皮9g，是治疗热病后期“阴虚内热”的代表方。

[0003] 对于“阴虚内热”，研究得最深入的是“癌热”。一般认为，癌热的产生与肿瘤释放坏死因子刺激机体引起免疫反应及肿瘤细胞本身产生内源性致热源等有关。癌热产生过程是由肿瘤组织低氧、酸中毒、炎性及免疫细胞活化等一系列代谢应激反应组成。在这一过程中，低氧对肿瘤细胞来说是一次促进恶化的考验，如果肿瘤细胞能存活下来，则细胞的恶性行为比原来更强。这是因为肿瘤细胞在低氧应答中产生的低氧诱导因子HIF-1α能诱导产生许多基因，使肿瘤细胞通过产生大量的生长因子和蛋白水解酶调节着肿瘤基质环境并以旁分泌的形式诱导血管生成和炎症反应。最主要的血管生成刺激因子是血管内皮生长因子VEGF，可主要以4种形式存在(氨基酸片段长度为121、165、189、和206)，且每种存在形式都含有多种功能，包括内皮细胞募集和促有丝分裂刺激；环氧化酶(COX)作为花生四烯酸转化为前列腺素生物合成通路中的一种关键酶，其中COX-2为前炎性因子，通常在组织缺氧或损伤反应中由单核巨噬细胞和中性粒细胞产生，通过VEGF活化能直接刺激血管生成的炎症介质PGE2和PGI2等。近年，流行病学专家通过研究慢性炎症与肿瘤的关系，发现在肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中均会出现慢性炎症。这是“癌热”发生的主要原因。

[0004] 自从1971年Folkman首先提出肿瘤的生长依赖于血管生成以来，人们发现由HIF-1α-VEGF介导的新生肿瘤血管通常是扩张的，形状呈不规则扭曲，不会形成明确的小动脉、小静脉和毛细血管，具有与正常血管不同的多重特征。肿瘤细胞为迅速适应缺氧环境，使三羧酸循环发生障碍，无氧糖酵解释放大量乳酸，加之受肿瘤组织周围不完备的脉管系统影响，使分解代谢产物不能及时排除，促成肿瘤酸性环境形成。由此构成肿瘤低氧微环境，有利于肿瘤细胞增殖和侵袭。

[0005] 肿瘤低氧微环境在肿瘤发生发展中起到了至关重要的作用。过去更多地关注于对肿瘤细胞个体，而现在人们逐渐认识到应该将肿瘤细胞与所处的低氧微环境共同受到关注。研究者们认为，肿瘤低氧微环境可以作为药物辅助治疗的靶点，通过对微环境中多种细胞及细胞因子的干预而影响肿瘤表型。但由于肿瘤微环境靶点众多，迄今尚未有合适的药物问世。

[0006] 青蒿鳖甲方由多味中药组成，方中鳖甲乃血肉有情之品，性善入阴分养阴液，且鳖为蠕动之物，入络剔邪；青蒿轻清芳香，清热透络，引邪外出。鳖甲先煎而青蒿后下，更有先入后出之妙，先入阴搜邪，后引邪出表。有配伍地黄滋阴凉血，牡丹皮、知母清泻阴分伏火，全方配伍严谨，共奏滋阴清热，透邪外出之功。我国学者在临床用于阴虚内热尤其是“癌热”的治疗效果十分满意，同时还能调节肿瘤患者免疫功能。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的是提供青蒿鳖甲组合物在制备抗肿瘤低氧微环境药物中的应用。所述青蒿鳖甲组合物由青蒿80g 鳖甲胶13.4g 地黄160g 知母80g 牡丹皮120g组成。

[0008] 本发明提供的青蒿鳖甲组合物制备的是片剂，即作为一种靶向抗肿瘤低氧微环境的中药复方制剂在制备增强环氧化酶2抑制剂抗肿瘤慢性炎症反应药物中的应用。以及在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效辅助药物中的应用。

[0009] 本发明具有以下优点：

[0010] (1)本发明结合中西医理论，首次提出青蒿鳖甲组合物具有抗肿瘤低氧微环境功能，可以作为靶向制剂干预肿瘤微环境中多种细胞及细胞因子。这种神奇功能的发现，将会使该古方在肿瘤治疗中得到重要应用。

[0011] (2)低氧微环境是恶性肿瘤发展过程中必须经历的环境条件，也是恶性肿瘤对放疗、化疗产生耐受的重要原因之一。本发明为青蒿鳖甲组合物开发成为化疗药物增敏剂提供药效学及其作用机制的研究依据，具有将中药名优方剂二次开发的重要价值。

[0012] (3)本发明以肿瘤低氧微环境理论为背景，研究并阐明中药古方剂的科学内涵，是发展中医药理论新的重要方向，为发展中医药新的理论和药物作用新的靶点提供重要依据。

附图说明

[0013] 图1为青蒿鳖甲片增强环氧化酶2抑制剂对S180移植瘤生长的抑制作用实体图。

[0014] 图2-1为S180移植瘤组织中性粒细胞(HE染色，400×)。

[0015] 图2-2为COX-2蛋白在S180移植瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0016] 图2-3为VEGF蛋白在S180移植瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0017] 图2-4为CD31蛋白在S180移植瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0018] 图3为Western blotting分析S180移植瘤组织COX-2，VEGF蛋白的表达。

[0019] 图4-1为青蒿鳖甲片增强顺铂抑制A549肺腺癌移植瘤生长的实体图。

[0020] 图4-2为青蒿鳖甲片增强顺铂抑制A549/CDDP肺腺癌移植瘤生长的实体图。

[0021] 图5-1为青蒿鳖甲片增强顺铂对A549肺腺癌移植瘤的相对肿瘤体积抑制作用。

[0022] 图5-2为青蒿鳖甲片增强顺铂对A549/CDDP肺腺癌移植瘤的相对肿瘤体积抑制作用。

[0023] 图6-1为HIF-1α蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤肿瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0024] 图6-2为COX-2蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤肿瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0025] 图6-3为VEGF蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤肿瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0026] 图6-4为CD31蛋白在A549移植瘤以及A549/CDDP移植瘤肿瘤组织中的表达(免疫组化，100×)。

[0027] 图7-1为青蒿鳖甲片对荷A549肺腺癌小鼠肿瘤组织中顺铂含量及瘤重的影响(末次给药后24h)。

[0028] 图7-2为青蒿鳖甲片对荷A549/CDDP肺腺癌小鼠肿瘤组织及血浆中顺铂含量的影响(末次给药后1h)。

具体实施方式

[0029] 本发明结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。就作用机制而言，青蒿鳖甲方适用于所有恶性表型的实体瘤(如肺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌)以及血液肿瘤(白血病、多发性骨髓瘤等)的治疗。

[0030] 实施例1：青蒿鳖甲片增强环氧化酶2抑制剂对S180肉瘤慢性炎症反应的[0031] 抑制效应

[0032] 药品 青蒿鳖甲片(QHBJP)，按部颁标准-中药标准(标准编号WS3-B-1355)制备。美洛昔康片(Meloxicam，批号：784187)，上海勃林格殷格翰药业有限公司。

[0033] 瘤株和动物 小鼠S180瘤株，中科院上海细胞生物学研究所；ICR小鼠，浙江省医学科学院动物实验中心[实验动物许可证号：SX(浙)2003-0001]。

[0034] 试剂 免疫组化EnvisionTM plus加强型试剂盒，福州迈新生物技术有限公司。COX-2多克隆抗体，Cayman Chemical公司。羊抗人Actin多克隆抗体，SantaCruz公司。增强化学发光检测试剂，Santa Cruz公司。PVDF膜，Millipore公司。M-MLV和Taq酶，MB I产品；Trizol购于上海生物工程公司。琼脂糖(agarose)，BBI产品。

[0035] 方法

[0036] 1.体内抑瘤实验

[0037] 清洁级ICR小鼠，雄性，6周龄，18-22g。无菌条件下，取接种后8天的S180腹水瘤7 -1
种鼠肿瘤腹水，用生理盐水稀释为1×10ml 细胞悬液，每鼠左前肢腋窝皮下接种0.2ml。
-1 -1
再将小鼠随机分为模型对照组(溶剂对照组)，美洛昔康(Mel)单用组(10mg·kg ·d )，-1 -1
青蒿鳖甲片(QHBJP)单用剂量组(3.0g·kg ·d )，青蒿鳖甲片低、中、高剂量(1.5、3.0、-1 -1 -1 -1
6.0g·kg ·d )分别与美洛昔康(10mg·kg ·d )合用组，每组10只。接种次日灌胃给药，模型对照组给予生理盐水。连续给药10天，停药次日断椎处死，剥取瘤子并称重，计算抑瘤率。抑瘤率％＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

[0038] 2.HE染色和免疫组织化学

[0039] 肿瘤取出后用多聚甲醛固定，经常规处理后免疫组化，步骤按福州迈新生物技术TM有限公司的即用型第二代免疫组化Envision plus加强型试剂盒提供的操作说明进行。
DAB显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。根据检测的目标蛋白一抗分别采用抗鼠COX-2单克隆抗体，抗鼠VEGF单克隆抗体，鼠抗人CD31单克隆抗体，阴性对照组采用PBS代替特异性一抗，均以棕黄色的强弱程度为观察指标。HE染色观测10个视野中多核白细胞(WBC)数量，以总数10个细胞记为“+”，总数未到10个细胞记为“±”，作为肿瘤组织炎症反应强弱的观察指标。

[0040] 3.Western blotting分析

[0041] 用12％SDS-PAGE进行电泳，每个泳道上总蛋白80μg。电泳后蛋白条带转移至PVDF膜上，膜用含5％脱脂奶粉的TPBS室温封闭1h，抗兔COX-2多克隆抗体、抗鼠VEGF单克隆抗体(1∶500稀释)4℃放置过夜，经TPBS洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温作用1h(1∶5000稀释)，TPBS洗膜，采用ECL法对目标条带进行检测。采用同一张膜通过抗体的洗脱，重新对β-actin的蛋白条带进行检测，作为内参。

[0042] 4.数据统计分析

[0043] 所有数据以 表示，半定量分析实验均重复三次。采用SPSS10.0统计程序，以t检验两样本均数间显著性差异。P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异非常显著；P＜0.001为差异极显著。

[0044] 结果：

[0045] 1.体内抑瘤实验

[0046] 体内抑瘤实验表明，在小鼠S180移植瘤动物模型中，青蒿鳖甲片联合应用美洛昔康后各剂量组肿瘤生长速度缓慢，在用药结束后肿瘤体积较模型对照组明显减少，肿瘤组织内白细胞数量较模型对照组明显降低(图1，图2-1)。高、中、低三个剂量青蒿鳖甲片(1.5、3.0、6.0g·kg-1·d-1)联合应用美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组均显示出比单用美洛昔康有更显著的抑瘤作用(P＜0.01)，无明显量效关系(表1)。

[0047] 图1中：A.模型对照(生理盐水)组，B.单用美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组，C.单用青蒿鳖甲片(3000mg·kg-1·d-1)组，D.合用青蒿鳖甲片低剂量(1500mg·kg-1·d-1)+美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组，E.合用青蒿鳖甲片中剂量(3000mg·kg-1·d-1)+美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组，F.合用青蒿鳖甲片高剂量(6000mg·kg-1·d-1)+美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组。

[0048] 表1青蒿鳖甲片增强环氧化酶2抑制剂对S180移植瘤生长的抑制作用(n＝10)[0049]

[0050] *，p＜0.01；**，p＜0.001；***，p＜0.0001vs模型对照.

[0051] ##，p＜0.001；###，p＜0.0001vs美洛昔康.

[0052] 2.肿瘤组织炎症反应及相关蛋白表达

[0053] 环氧化酶(COX)作为花生四烯酸转化为前列腺素生物合成通路中的一种关键酶，其中COX-2为前炎性因子，通常在组织缺氧或损伤反应中由单核巨噬细胞和中性粒细胞产生，通过VEGF活化能直接刺激血管生成的炎症介质PGE2和PGI2等。CD31是分子量为130KD的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，主要分布在脉管细胞上，尤其在血管内皮细胞的连接处有高水平表达。由于CD31与白细胞的粘附和穿越功能有关，与血管形成关系密切，可作为内皮细胞特异的标记物，对肿瘤的微血管进行计数。经免疫组织化学分析结果显示，肿瘤组织COX-2，VEGF以及CD31三种蛋白表达量在模型对照组表现为较强的棕黄色。与模型对照组相比，青蒿鳖甲片、美洛昔康单用组及各联合用药组肿瘤细胞内棕黄色明显减弱(图2-2，2-3，2-4)。经HE染色检测，肿瘤组织内白细胞数量较模型对照组明显降低(表1，图2-1)，其结果与免疫组织化学显示的三种蛋白表达量相一致。

[0054] 图2-1，2-2，2-3，2-4中：A.模型对照(生理盐水)组，B.单用美洛昔康-1 -1 -1 -1(10mg·kg ·d )组，C.单用青蒿鳖甲片(3000mg·kg ·d )组，D.合用青蒿鳖甲-1 -1 -1 -1
片低剂量(1500mg·kg ·d )+美洛昔康(10mg·kg ·d )组，E.合用青蒿鳖甲片中-1 -1 -1 -1
剂量(3000mg·kg ·d )+美洛昔康(10mg·kg ·d )组，F.合用青蒿鳖甲片高剂量-1 -1 -1 -1
(6000mg·kg ·d )+美洛昔康(10mg·kg ·d )组。

[0055] 3.Western blotting分析肿瘤组织COX-2，VEGF蛋白的表达

[0056] 采用Western blotting方法分别检测肿瘤组织内VEGF，COX-2蛋白的表达量。-1 -1
结果表明，VEGF蛋白和COX-2蛋白在中剂量和高剂量青蒿鳖甲片(3.0g·kg ·d 和-1 -1 -1 -1
6.0g·kg ·d )联合应用美洛昔康(10mg·kg ·d )组的表达量较模型对照组显著下降(P＜0.05)(图3)。

[0057] 图3中：A.模型对照(生理盐水)组，B.单用美洛昔康(10mg·kg-1·d-1)组，-1 -1 -1 -1C.单用青蒿鳖甲片(3000mg·kg ·d )组，D.合用青蒿鳖甲片低剂量(1500mg·kg ·d )+-1 -1 -1 -1
美洛昔康(10mg·kg ·d )组，E.合用青蒿鳖甲片中剂量(3000mg·kg ·d )+美洛-1 -1 -1 -1
昔康(10mg·kg ·d )组，F.合用青蒿鳖甲片高剂量(6000mg·kg ·d )+美洛昔康-1 -1
(10mg·kg ·d )组。

[0058] 实施例2：青蒿鳖甲片对HIF-1α介导的A549人肺腺癌低氧微环境调控[0059] 及其对顺铂增敏效应

[0060] 药品 青蒿鳖甲片(QHBJP)，按部颁标准-中药标准(标准编号WS3-B-1355)制备。注射用顺铂(CDDP，批号：709033100)，齐鲁制药有限公司。

[0061] 瘤株 A549肺腺癌细胞株(中科院上海细胞生物学研究所)，A549耐顺铂肺腺癌细胞株(A549/CDDP，Science Cell，USA)。

[0062] 实验动物 Balb/C小鼠128只，雌性，体重20±2g，5周龄，中科院上海实验动物中心提供。

[0063] 方法

[0064] 1.A549与A549/CDDP荷瘤动物模型建立

[0065] 用含10％小牛血清的1640培养液培养A549肺腺癌细胞，于37℃、5％CO 2细胞培养箱中孵育，待长满70-90％面积后传代。取对数生长期细胞，用无血清培养液调整细胞7 -1
浓度至1×10ml ，5周龄雌性Balb/C小鼠左肢腋下接种，0.2ml/只，共两只。待肿瘤长至
3 3
500mm 大小，处死小鼠，无菌条件下取出瘤块并切割成约1mm 大小，用套管针接种到新的
5-6周龄雌性Balb/C小鼠左前肢腋下，获得荷A549肺腺癌小鼠共64只。

[0066] 按同样方法培养、接种A549/CDDP肺腺癌细胞，获得荷A549耐顺铂肺腺癌小鼠共64只。

[0067] 2.A549与A549/CDDP荷瘤动物给药方案

[0068] 2.1荷A549肺腺癌小鼠给药方案：

[0069] 模型对照组每天生理盐水灌胃；青蒿鳖甲片(研磨并用生理盐水混合)在接种后第7天开始灌胃给药，每日1次，连续12次；顺铂(CDDP)在接种后第7天开始腹腔注射给药，每隔2日1次，连续5次。于末次给药24h后，处死小鼠，取出瘤块。给药方案参见表2-1。

[0070] 表2-1.青蒿鳖甲片增强顺铂对A549肺腺癌治疗作用动物实验给药方案[0071]

[0072] 2.2荷A549/CDDP肺腺癌小鼠给药方案：

[0073] 模型对照组每天生理盐水灌胃；青蒿鳖甲片在接种后第10天开始灌胃给药，每日1次，连续28次；CDDP在接种后第10天开始腹腔注射给药，每隔2日1次，连续10次。于末次给药1h后，处死小鼠，取出瘤块。给药方案参见表2-2。

[0074] 表2-2.青蒿瞥甲片增强顺铂对A549/CDDP肺腺癌治疗作用动物实验给药方案[0075]

[0076] 3.肿瘤体积变化及药物的毒副作用

[0077] 给药期间观察小鼠的一般情况及移植瘤生长情况，每3天测量一次肿瘤体积。测定方法为用游标卡尺测量肿瘤长轴(a)、短轴(b)，根据公式V＝0.5ab2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积增长曲线，同时测定小鼠体重。小鼠处死后，剖取肿瘤组织称重，并计算抑瘤率：抑瘤率＝(1-用药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

[0078] 4.免疫组织化学分析

[0079] 根据检测的目标蛋白一抗分别采用抗鼠HIF-1α单克隆抗体，抗鼠COX-2单克隆抗体，抗鼠VEGF单克隆抗体，抗鼠CD31单克隆抗体，阴性对照(底色对照)采用PBS代替特异性一抗。均以棕黄色的强弱程度为观察指标。

[0080] 5.对肿瘤组织/血浆中顺铂含量定量分析

[0081] 采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，XSENIES，R & D，USA)，由浙江大学分析测试中心提供并负责测定血浆及肿瘤组织中顺铂的含量。

[0082] 5.1肿瘤组织测试方法

[0083] 称取一定质量的肿瘤组织于20mL小烧杯，加入5mL电子级硝酸，静置5小时。将小烧杯置于电炉上缓慢加热，蒸至溶液清亮透明，继续加热至近干后冷却至室温，以超纯水冲刷烧杯壁，并转移到25mL容量瓶，以超纯水定容至刻线待测。

[0084] 采用逐步稀释法配制铂(Pt)标准溶液，其浓度为10ppb(基体为空白肿瘤组织硝195
化液)。以空白肿瘤组织硝化液为空白，测定空白、标准溶液及样品溶液中 Pt的CPS值，以CPS值为纵轴，以浓度为横轴，作标准曲线，并计算出样品中Pt的浓度。采用如下公式计算肿瘤组织中Pt的浓度：

[0085]

[0086] 其中：D-元素含量(mg/kg)；c-元素测试浓度(μg/L)；V-定容体积(mL)；a-校正3
系数(为1.305)；m-肿瘤组织称重(g)；s-单位换算系数，此处为10。测定顺铂含量的方法参见表3-1。

[0087] 3-1.Pt标准曲线(组织基体)及精密度数据

[0088]序号 名称 浓度(μg/L) 基体 RSD(％)
1 空白对照 0.000 组织消解液 0.00
2 1ppb Pt 1.000 组织消解液 3.59
3 8ppb Pt 8.000 组织消解液 0.91
4 40ppb Pt 40.00 组织消解液 1.80

[0089] 5.2血浆测试方法

[0090] 移取50μL解冻的血浆到5mL容量瓶，以超纯水定容至刻线待测。

[0091] 采用逐步稀释法配制顺铂(Pt)标准溶液，其浓度为10ppb(基体为空白血浆)。以195
空白血浆稀释液为空白，测定空白、标准溶液及样品溶液中 Pt的测量值(CPS)，以CPS值为纵轴，以浓度为横轴，作标准曲线，并计算出样品中Pt的浓度。采用如下公式计算血浆中Pt的浓度：

[0092]

[0093] 其中：D-元素含量(μg/mL)；c-元素测试浓度(μg/L)；V-定容体积(mL)；a-校正系数(为0.5074)；V0-移取血浆体积(μL)；s-单位换算系数，此处为1。测定顺铂含量的方法参见表3-2。

[0094] 表3-2.Pt标准曲线(血浆基体)及精密度数据

[0095]序号 名称 浓度(μg/L) 基体 RSD(％)
1 空白对照 0.000 1％血浆 0.00
2 1ppb Pt 1.000 1％血浆 1.27
3 5ppb Pt 5.000 1％血浆 1.28
4 20ppb Pt 20.00 1％血浆 1.76

[0096] 6.数据统计分析

[0097] 所有数据以 表示，定量分析实验重复三次。采用SPSS10.0统计程序，以t检验两样本均数间显著性差异。P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异非常显著；P＜0.001为差异极显著。

[0098] 结果：

[0099] 1.抑制肿瘤生长

[0100] 在荷A549肺腺癌裸鼠肿瘤模型和荷A549/CDDP肺腺癌裸鼠肿瘤模型中，三个剂量的青蒿鳖甲片联合顺铂用药组的肿瘤生长速度缓慢，在治疗结束后肿瘤重量均较模型对照组明显减少(p＜0.001)，见表4-1，表4-2，图4-1，图4-2，图5-1，图5-2。这种联合用药的治疗效果在耐顺铂的荷A549/CDDP肺腺癌模型更佳，由表4-2图4-2图5-2可见，中剂量青蒿鳖甲片(3000mg·kg-1)联合顺铂(2mg·kg-1)组的抑瘤率较单用顺铂组有显著提高(p＜0.01)。

[0101] 表4-1.青蒿鳖甲片增强顺铂对A549肺腺癌移植瘤生长的抑制作用(n＝8)[0102]

[0103]

[0104] *，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001vs模型对照.#，p＜0.05vs CDDP.[0105] ▲，p＜0.05；▲▲，p＜0.01vs QHBJP.

[0106] 表4-2.青蒿鳖甲片增强顺铂对A549/CDDP肺腺癌移植瘤的生长抑制作用(n＝8)[0107]

[0108] *，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001vs模型对照.#，p＜0.05；##，p＜0.01vs CDDP.

[0109] ▲，p＜0.05；▲▲，p＜0.01vs QHBJP.

[0110] 图4-1为青蒿鳖甲片增强顺铂抑制A549肺腺癌移植瘤生长的实体图。

[0111] 图5-1为青蒿鳖甲片增强顺铂对A549肺腺癌移植瘤抑制作用的相对肿瘤体积生-1 -1长曲线：A.模型对照(生理盐水)组，B.单用顺铂(2mg·kg ·d )组，C.单用青蒿鳖甲-1 -1 -1 -1
片(1500mg·kg ·d )组，D.单用青蒿鳖甲片(3000mg·kg ·d )组，E.单用青蒿鳖甲片-1 -1 -1 -1 -1 -1
(6000mg·kg ·d )组，F.合用青蒿鳖甲片低剂量(1500mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )-1 -1 -1 -1
组，G.合用青蒿鳖甲片中剂量(3000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组，H.合用青蒿-1 -1 -1 -1
鳖甲片高剂量(6000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组。

[0112] 图4-2为青蒿鳖甲片增强顺铂抑制A549/CDDP肺腺癌移植瘤生长的实体图。

[0113] 图5-2为青蒿鳖甲片增强顺铂对A549/CDDP肺腺癌移植瘤抑制作用的相对肿瘤-1 -1体积生长曲线：A.模型对照(生理盐水)组，B.单用顺铂(2mg·kg ·d )组，C.单用青-1 -1 -1 -1
蒿鳖甲片(1500mg·kg ·d )组，D.单用青蒿鳖甲片(3000mg·kg ·d )组，E.单用青-1 -1 -1 -1
蒿鳖甲片(6000mg·kg ·d )组，F.合用青蒿鳖甲片低剂量(1500mg·kg ·d )+顺铂-1 -1 -1 -1 -1 -1
(2mg·kg ·d )组，G.合用青蒿鳖甲片中剂量(3000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )-1 -1 -1 -1
组，H.合用青蒿鳖甲片高剂量(6000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组。

[0114] 2.药物的毒副作用

[0115] 用药期间，各组荷瘤小鼠活动良好，未见特殊不良反应，无一例死亡。荷A549肺腺癌小鼠模型对照组及治疗各组小鼠去瘤体重分别为，1.81±0.34g，0.91±0.50g，0.97±0.49g，0.83±0.35g，0.95±0.45g，0.87±0.42g，0.65±0.33g，0.46±0.33g，治疗组与模型对照组比较无显著差异(表4-1)。荷A549/CDDP肺腺癌小鼠模型对照组及治疗各组小鼠去瘤体重分别为20.62±0.63g，20.35±1.31g，21.75±1.17g，21.52±1.45g，
20.99±1.3g，20.54±1.24g，20.53±2.1g，20.03±1.28g，治疗组与模型对照组比较无显著差异(表4-2)。

[0116] 3.肿瘤组织低氧诱导相关蛋白表达

[0117] 免疫组织化学检测肿瘤组织HIF-1α、COX-2、VEGF和CD31蛋白的表达，以组织内棕黄色强弱来判断肿瘤细胞内各蛋白表达量的变化。结果显示，在A549肺腺癌移植瘤，模型对照组表现为较强的棕黄色，与模型对照组相比，顺铂、青蒿鳖甲片单用组及各联合用药组的肿瘤组织内棕黄色明显减弱，在A549/CDDP肺腺癌移植瘤显示相似的治疗效果(图6-1，图6-2，图6-3，图6-4)。根据四种蛋白在各组动物肿瘤组织的表达程度，表明单用顺铂组对肿瘤组织HIF-1α、COX-2、VEGF和CD31蛋白的下调作用并不明显，单用青蒿鳖甲片低、中、高剂量组对蛋白的下调作用很明显，青蒿鳖甲片低、中、高剂量合用顺铂的各组对蛋白的下调作用更明显。

[0118] 图6-1，6-2，6-3，图6-4 中：A.模 型对 照(生 理盐 水)组，B.单 用顺 铂-1 -1 -1 -1(2mg·kg ·d )组，C.单用青蒿鳖甲片(1500mg·kg ·d )组，D.单用青蒿鳖甲g- -1 -1 -1
片(3000mg·k 1·d )组，E.单用青蒿鳖甲片(6000mg·kg ·d )组，F.合用青蒿-1 -1 -1 -1
鳖甲片低剂量(1500mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组，G.合用青蒿鳖甲片
-1 -1 -1 -1
中剂量(3000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组，H.合用青蒿鳖甲片高剂量
-1 -1 -1 -1
(6000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组。注：I.为阴性对照(底色对照)

[0119] 4.肿瘤组织/血浆中顺铂含量

[0120] 由表5-1，图7-1可见，在荷A549肺腺癌移植瘤，低、中、高剂量的青蒿鳖甲片分别与顺铂联合用药未能明显提高肿瘤组织顺铂含量。但与单用顺铂组比较，中、高剂量的青蒿鳖甲片与顺铂联合用药使瘤重明显下降(p＜0.05)。表明抑制瘤重与肿瘤组织中顺铂含量无关，与青蒿鳖甲片的剂量有一定依赖关系。

[0121] 由表5-2，图7-2可见，在荷A549/CDDP肺腺癌移植瘤，低、中、高剂量的青蒿鳖甲片分别与顺铂联合用药未能明显提高肿瘤组织及血浆顺铂含量。但与单用顺铂组比较，与顺铂联合用药的低剂量青蒿鳖甲片组使瘤重明显下降(p＜0.05)，与顺铂联合用药的中、高剂量青蒿鳖甲片组使瘤重非常明显下降(p＜0.01)。表明抑制瘤重与肿瘤组织中顺铂含量无关，与青蒿鳖甲片在低、中剂量范围有一定剂量依赖关系。

[0122] 表5-1.青蒿鳖甲片对荷A549肺腺癌小鼠肿瘤组织顺铂含量及瘤重的影响[0123] (末次给药后24h)

[0124]

[0125] *，P＜0.05；**，P＜0.01与顺铂单用组比较

[0126] 表5-2.青蒿鳖甲片对荷A549/CDDP肺腺癌小鼠肿瘤组织及血浆顺铂含量的影响[0127] (末次给药后1h)

[0128]

[0129] *，P＜0.05；**，P＜0.01与顺铂单用组比较-1 -1

[0130] 图7-1 中：B. 单 用 顺 铂 (2mg·kg ·d ) 组，F.合 用 青 蒿 鳖 甲 片 低-1 -1 -1 -1剂 量 (1500mg·kg ·d )+顺 铂 (2mg·kg ·d )组，G.合 用 青 蒿 鳖 甲 片 中 剂-1 -1 -1 -1
量(3000mg·kg ·d )+ 顺 铂 (2mg·kg ·d )组，H. 合 用 青 蒿 鳖 甲 片 高 剂 量-1 -1 -1 -1
(6000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组。
-1 -1

[0131] 图7-2 中：B. 单 用 顺 铂 (2mg·kg ·d ) 组，F.合 用 青 蒿 鳖 甲 片 低-1 -1 -1 -1剂 量 (1500mg·kg ·d )+顺 铂 (2mg·kg ·d )组，G.合 用 青 蒿 鳖 甲 片 中 剂-1 -1 -1 -1
量(3000mg·kg ·d )+ 顺 铂 (2mg·kg ·d )组，H. 合 用 青 蒿 鳖 甲 片 高 剂 量-1 -1 -1 -1
(6000mg·kg ·d )+顺铂(2mg·kg ·d )组。