一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用。该抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和力为1.74×10-8mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力。本发明的人源化抗体能更好与uPAR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上，所述本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.权利要求1所述抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述重链可变区的编码基因为如下

1)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；

所述轻链的编码基因为如下I)所示：

I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

所述抗体中包括重链恒定区；所述重链恒定区的氨基酸序列如序列表中序列9所示；

所述重链恒定区的编码基因为如下a)所示：

a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子。

4.扩增权利要求2或3所述编码基因的引物对，其特征在于：所述引物对为如下引物对：

1)一条引物序列如序列表中序列5所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列6所示；

2)一条引物序列如序列表中序列7所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列8所示。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

6.一种制备权利要求1所述抗体的方法，是将权利要求2或3所述编码基因导入宿主细胞中，培养，得到所述抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，是通过重组载体将权利要求

2或3所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组载体中既含有权利要求2或3所述重链可变区的编码基因又含有权利要求2或3所述轻链的编码基因，且所述重链可变区的编码基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。

8.一种抑制尿激酶型纤溶酶原激活物受体信号转导途径的抑制剂，其活性成分为权利要求1中所述抗体、权利要求2或3所述编码基因、权利要求5中所述重组载体、权利要求

5中所述重组菌、权利要求5中所述转基因细胞系和/或权利要求5中所述表达盒。

9.权利要求1中所述抗体、权利要求2或3所述编码基因、权利要求5中所述重组载体、权利要求5中所述重组菌、权利要求5中所述转基因细胞系或权利要求5中所述表达盒在制备抑制尿激酶型纤溶酶原激活物受体信号转导途径的抑制剂中的应用。

说明书

一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator)及尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)介导纤维蛋白溶解系统在肿瘤的浸润和转移中发挥着重要作用。随着uPA、uPAR在癌症中的作用研究的日益深入，其临床意义很快受到重视。许多专家认为uPA及uPAR是恶性肿瘤的特征，与肿瘤的进展和转移是一致的。抑制uPA和uPAR的表达可以减少多种肿瘤的侵袭和转移能力。国内外许多研究表明，针对uPAR的抗体可有效地在胞外通过阻断配体的结合来实现对uPAR信号转导导途径的抑制，对多种由uPAR过度表达或/和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌，结直肠癌，非小细胞型肺癌等有较好的疗效。

[0003] uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶，基因定位于第10号染色体，其mRNA为2.4kb，蛋白分子量为55000。uPA在细胞合成和分泌时为单链无活性的尿激酶原(Pro-uPA)，它与肿瘤细胞表面特异性受体uPAR结合后，Pro-uPA被激活转变为有活性的以二硫键连接的A、B两条链组成的uPA，uPA的A链含有EGF样功能区，该区和纤连蛋白及凝血酶原有很高的同源性，可介导uPA和uPAR的结合。uPAR是由313个氨基酸残基组成的单链跨膜糖蛋白，基因定位于第19号染色体，mRNA为1.4kb，相对分子量为45000～55000。uPAR结构包括3个同源结构域(D1、D2、D3)，其中D1含有与uPA结合的抗原决定族。uPAR使uPA激活并定位于细胞表面提供了在细胞之间及细胞与基质连接处的局部集中机制，为表达uPAR的肿瘤细胞提供了uPA介导的蛋白质水解的有利环境。

[0004] uPA与uPAR结合后可以促进肿瘤的浸润和转移，但其具体机制尚不完全明了。目前普遍认为，uPA与uPAR结合后，可以激活纤溶酶系统，使细胞外基质和基底膜的多种成分降解，引起蛋白裂解的级连反应，基底膜产生灶性和直接的蛋白裂解，从而使肿瘤细胞穿透正常组织屏障，引起肿瘤的浸润和转移。同时，uPA与uPAR结合后还可以引起细胞形态改变、细胞骨架重塑及特异性角蛋白磷酸化等效应。Ploug认为在肿瘤浸润和转移引起的重组事件中，uPAR常常被上调，与多种基质金属蛋白酶(MMP)相互作用，以利于蛋白水解酶降解细胞外基质。Andreasen等认为，uPA不仅通过降解细胞外基质在肿瘤浸润中发挥作用，并在肿瘤细胞引起的组织重塑中发挥作用，还可以通过不依赖于纤维蛋白溶解酶系统的机制引起肿瘤的浸润和转移，其中包括uPA、uPAR、细胞外基质蛋白及生长因子等多因素相互作用，这种相互作用允许该系统在肿瘤侵袭转移过程中，在时间和空间上重新组织，选择性地降解细胞外基质蛋白。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种可与尿激酶型纤溶酶原激活物受体结合的抗体及其编码基因。

[0006] 本发明所提供的抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

[0007] 上述抗体的重链可变区的编码基因为如下1)、2)或3)所示：

[0008] 1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；

[0009] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的DNA分子；

[0010] 3)与序列表中序列4自5′末端起第157-171bp和261-283bp位核苷酸具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的DNA分子；

[0011] 上述抗体的轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示：

[0012] I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

[0013] II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；

[0014] III)与序列表中序列2自5′末端起第160-184bp和217-250bp位核苷酸具有70％以上的同源性且编码所述轻链的DNA分子。

[0015] 所述抗体由重链和轻链组成，所述重链由重链可变区和重链恒定区组成，所述重链恒定区的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述重链恒定区的编码基因为如下a)、b)或c)所示：

[0016] a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述重链恒定区的DNA分子；c)与序列表中序列10所示DNA分子具有70％以上的同源性且编码所述重链恒定区的DNA分子。

[0017] 扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对为如下引物对：

[0018] 1)一条引物序列如序列表中序列5所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列6所示；

[0019] 2)一条引物序列如序列表中序列7所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中序列8所示。

[0020] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述抗体的方法。

[0022] 本发明所提供的制备上述抗体的方法，是将上述任一所述编码基因导入宿主细胞中，培养，得到所述抗体。

[0023] 所述方法中，是通过重组表达载体将权利要求2或3所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组表达载体中既含有上述重链可变区的编码基因又含有上述轻链的编码基因，且所述重链可变区的编码基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。

[0024] 本发明的另一个目的是提供一种抑制尿激酶型纤溶酶原激活物受体信号转导途径的抑制剂。

[0025] 本发明所提供的制尿激酶型纤溶酶原激活物受体信号转导途径的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒。

[0026] 本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂。

[0027] 本发明所提供的抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂，其活性成分为上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒。

[0028] 本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物。

[0029] 本发明所提供的预防和/或治疗肿瘤的药物，其活性成分为上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒。

[0030] 上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒在制备抑制尿激酶型纤溶酶原激活物受体信号转导途径的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

[0031] 上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

[0032] 上述抗体、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组载体、上述任一所述重组菌、上述任一所述转基因细胞系和/或上述任一所述表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。

[0033] 上述肿瘤具体可为宫颈癌；上述肿瘤细胞具体可为宫颈癌HeLa细胞。

[0034] 实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和力为1.74×10-8mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力。本发明的人源化抗体能更好与uPAR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的表达比例更接近1∶1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上，所述本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。

附图说明

[0035] 图1为轻链基因、重链可变区基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。

[0036] 图2为抗uPAR人源化抗体的pIRES表达载体的结构示意图。

[0037] 图3为抗uPAR人源化抗体的还原型SDS-PAGE检测。

[0038] 图4为抗uPAR人源化抗体与uPAR的亲和力检测图。

[0039] 图5为ELISA检测抗体表达结果。

[0040] 图6为免疫印迹分析结果。

具体实施方式

[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0043] 实施例1、抗体的轻链编码基因和重链可变区编码基因的获得

[0044] 根据计算机模拟，以鼠单克隆抗uPAR抗体为模板，对其鼠源FR表面基因进行人源化改造而设计合成轻链序列L2和重链可变区序列S2H。轻链L2的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；重链可变区S2H的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。重链恒定区的氨基酸序列如序列表中序列9所示，重链恒定区的编码基因序列如序列表中序列10所示。

[0045] 通过引物对2L/2LR，采用重叠延伸PCR的方法，扩增得到轻链的编码基因序列；通过引物对2H/2HR，采用重叠延伸PCR的方法，扩增得到重链可变区的编码基因序列。

[0046] 轻 链 (L) 引 物：2L：CGGATCCGCT AGCCGCCACC ATGGACATCC AGATGACTCA GTCCCCATCTACTCTGTCTG CTTCCGT(序列5)

[0047] 2LR：CG GAA TTC TCA GGAACT CCAGTAGCGC GAGAGGAAGC CTCGTACATC AGT(序列6)[0048] 重链(H)可变区引物：

[0049] 2H：GTG TCT AGA GCC GCC ACC ATGGAGGTTC AGCTGGTTCA GTCCGGTGCT(序列7)[0050] 2HR：GTG GGA TCC ACT TAC CTGT CTTAGGCTCA ACCTTCTTGT CAACCTTAGT(序列8)[0051] 将扩增得到的各片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，结果与预期大小一致，L和H片段大小分别约为735bp和770bp(图1，M.相对分子质量标准；A：泳道2为轻链基因产物L2；B：泳道1为重链可变区基因S2H)；

[0052] 将获得的L2和S2H片段分别克隆入pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定。结果表明，获得片段的序列正确，将含有正确的L2的重组载体记作pMD18-T/L2，将含有正确的S2H的重组载体记作pMD18-T/S2H。

[0053] 将轻链L2、重链可变区S2H、重链恒定区构成的抗体记作S2。

[0054] 实施例2、抗体的表达与纯化

[0055] 一、重组表达载体的构建：

[0056] pIRES双表达载体购自Clontech公司，产品目录号为631605；pMD18-T表达载体购自Takara Bio Company，产品目录号为：D504CA.

[0057] 载体pIRES-Ant i-CD20(《抗CD20嵌合抗体的表达和活性检测》，中国生物工程杂志(china biotechnology)，2005，25(7)：34-39.)(中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所)。

[0058] 将重组载体pMD18-T/L2和pIRES双表达载体分别用相应的限制性内切酶[0059] (Nhe I和EcoRI)酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段；将轻链基因片段L2与载体片段混匀，在连接试剂的作用下，16℃反应12h。转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定，结果该重组表达载体中基因的插入方向正确及插入序列正确，记作重组表达载体pIRES/L2。

[0060] 克 隆 有 重 链 恒 定 区 基 因 的pMD18-T载 体：用BamH I 和Not I酶 切pIRES-Anti-CD20，回收重链恒定区片段，克隆于亦用BamH I和Not I酶切的pMD18-T载体，测序鉴定，得到正确的克隆有重链恒定区基因的pMD18-T载体。

[0061] 以重组表达载体pIRES/L2为模板，用Xba I和Not I酶切，回收载体大片段，记作片段1；以克隆有重链可变区基因的pMD18-T载体(即pMD18-T/S2H)为模板，用Xba I和BamH I酶切，回收重链可变区片段，记作片段2；以克隆有重链恒定区基因的pMD18-T载体为模板，用BamH I和Not I酶切，回收重链恒定区片段，记作片段3；将片段1、2和片段3连接，得到重组载体，转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序鉴定。结果表明，得到的重组表达载体的结构正确，插入的基因的方向及顺序正确；抗体的轻重链基因共用同一个启动子，通过IRES序列连接，最终构建了表达质粒。将阳性重组表达载体记作pIRES-Anti-uPAR(图2)。

[0062] 二、载体转化及抗体的表达

[0063] 293T细胞(293T人胚肾T细胞)购自美国菌种保藏中心(American type culturecollection，ATCC，又称美国模式菌种收集中心)，产品目录号为CRL-11268；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，产品目录号为12566014；HyQSFM4CHO培养基购自HyClone公司，产品目录号为SH30518.02；rProtein A层析柱购自购自GE Healthcare公司，产品目录号为17-5080-01。DMEM培养基购自Gibco公司，产品目录号为12100-046；
山羊抗人-IgG-HRP抗体购自Sigma公司，产品目录号为046K4801。

[0064] 将293T细胞按1×106/ml分别接种于直径为10cm的培养皿中，培养皿中装有含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2孵箱，培养。取5μg步骤一中得到的质粒pIRES-Anti-uPAR转染293T细胞，具体操作参照Lipofectamine 2000的试剂说明。得到重组细胞293T-pIRES-Anti-uPAR。将重组细胞293T-pIRES-Anti-uPAR用无血清DMEM培养基培养，培养6～8h后吸出无血清培养基，代之以HyQSFM4CHO培养基。相同条件下继续共培养84h，间隔12h收取一次细胞上清，用ELISA法初步检测抗体的表达。扩大转染体系，收集细胞培养上清4～5L，调pH至6.0～7.0，用0.45μm滤膜过滤，再用rProtein A层析柱纯化抗体，具体操作参见产品说明书。

[0065] ELISA法：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：

[0066] 1.包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体(一抗为山羊抗人IgG)稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

[0067] 2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

[0068] 3.加酶标抗体(二抗为山羊抗人IgG-HRP(山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶))：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

[0069] 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

[0070] 5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

[0071] 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

[0072] 试剂

[0073] (1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 1.59克，NaHCO32.93克，加蒸馏水至1000ml。

[0074] (2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15M：KH2PO4 0.2克，Na2HPO4·12H2O2.9克，NaCl8.0克，KCl 0.2克，Tween-200.05％ 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

[0075] (3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

[0076] (4)终止液(2M H2SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

[0077] 结果 如图5 所示，图5中，A1为 空白 对照，A2-A12为 重组 表 达载 体pIRES-Anti-uPAR瞬时转染293T细胞，不同细胞培养皿表达的S2抗体。结果表明pIRES-Anti-uPAR在293T细胞获得表达，得到目的蛋白S2抗体。尽管不同细胞培养皿表达量有差异，这可能与转染时细胞状态和载体量等因素有关。

[0078] 用rProtein A层析柱纯化抗体：纯化介质：HiTrap rProtein A FF，5ml，购自GE公司，目录号17-5079-01，详细使用说明书请参阅其公司提供的说明书。

[0079] 操作：

[0080] 1)清洗，用1M NaOH和ddH2O先后清洗管道，将小滤器用0.1M NaOH煮沸10min后再用ddH2O浸泡1～2min；

[0081] 2)设定程序，连接rProtein A亲和层析柱；

[0082] 3)用20mM结合缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；

[0083] 4)将已制备好的细胞上清以1～2ml/min的流速上样；细胞上清制备：以12000g离心15分钟，取出上清，经过0.22um硝酸纤维素滤膜过滤除菌。

[0084] 5)上样将要结束时用1M洗脱缓冲液(pH3.0)洗脱目的蛋白；

[0085] 6)收集蛋白，用Trise碱(pH9.0)将其pH调至7.0，电泳检测；

[0086] 7)按步骤1)清洗管道和小滤器。

[0087] 磷酸钠盐缓冲液(结合缓冲液)：用作ProteinA纯化的结合缓冲液。配制方法为：取1M Na2HPO457.7ml和1M NaH2PO442.3ml混匀，即为0.1M pH7.0的磷酸钠盐缓冲液100ml，再用蒸馏水稀释至20Mm备用。

[0088] 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(洗脱缓冲液)：用作ProteinA纯化的洗脱缓冲液。配制方法为：取0.1M柠檬酸186ml和0.1M柠檬酸钠14ml混匀，即为0.1M pH3.0的柠檬酸盐缓冲液200ml。

[0089] 分别取15μl纯化抗体S2在12％凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰3
R-250染色。结果显示，纯化所得抗体的重链的相对分子质量分别为50×10，轻链的相对
3
分子质量为25×10(图3中，泳道2为抗体的重链和轻链，泳道1为蛋白相对分子质量标准)，与预期结果一致。

[0090] Rituxan(药名：美罗华)(通用名：利妥昔单抗注射液)购自上海罗氏制药有限公司，制造商：F.Hoffmann-La Roche Inc.

[0091] 免疫印迹分析实验：分别取15μl纯化抗体在12％凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，取出膜用封闭液(含有5％脱脂奶粉的1×PBST)在室温封闭2h，用1∶5000稀释的羊抗人IgG-HRP抗体与之孵育2h(室温)，再用1×PBST洗膜3次。
最后用ECL显色，用X线片进行曝光。结果如图6所示(1是标准品Rituxan；2是S2抗体)。
结果表明获得的S2抗体可与羊抗人IgG特异性结合。分子量大小与预期结果一致。

[0092] 实施例3、抗体的功能

[0093] 一、Biacore检测人源化抗体S2与抗原的结合能力

[0094] uPAR蛋白购自R&D Systems，产品目录号为807-UK-100。Sensor Chip CM5购自TM TMBD公司，产品目录号为Br-1000-14；BD BioCoat Matrigel InvasionChamber购自BD公司，产品目录号为354480.

[0095] 用Biacore3000设备测定抗体S2与uPAR的亲和力。配制不同pH值(4.0，4.5，5.0和5.5)的10mmol/L NaAc稀释uPAR蛋白，在CM5芯片上做预浓缩，选择最适pH值的NaAc稀释蛋白。将纯化的抗体共价偶联于CM5传感芯片上，流动相为HBS-EP(pH7.4)，流速
20μl/min，取抗体五种浓度(0，12.5，25、50和100nmol/L)与uPAR蛋白结合亲和力的检测。亲和力用Biacore3000附带软件计算。

[0096] 实验设3次重复，结果取平均数。

[0097] 将纯化的抗uPAR人源化抗体S2与抗原uPAR结合，Biacore检测其结合能力，结-8果显示S2与抗原的亲和力为1.74×10 mol/L(图4)。

[0098] 二、肿瘤细胞侵袭实验

[0099] HeLa细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC，又TM称美国模式菌种收集中心)，产品目录号为CCL-2 ；人IgG购自北京新经科生物技术公司，产品目录号为30101；

[0100] 用DMEM培养基培养HeLa细胞。用无血清DMEM水化侵袭室(invasion chamber)，孵育2h(37℃，5％CO2)。弃无血清DMEM，在侵袭室的孔室加入750μl DMEM(含10％血清)；在插入(insert)室中加入475μl DMEM(含1％血清)，然后向其中加入25μl消化的HeLa
5
细胞(细胞数＞10/500μl)，最后分别向插入室中加入阴性对照人IgG和人源化抗体S2，每个样品均有两个复孔，抗体终浓度均为100ng/ml。孵育24h后，将未能穿透侵袭盒基底膜的细胞用无菌棉签擦去；穿透基底膜的细胞固定、染色、室温晾干后，光镜计数。

[0101] 统计学处理：在100倍显微镜下计算每个插入室中样品的相应3组细胞数。运用SPSS12.0统计软件对细胞侵袭实验数据进行t检验，将S2组与人IgG组比较。若结果为P＜0.05，两种处理效果差异有统计学意义。

[0102] 实验设3次重复，结果取平均数。t检验分析结果显示(表1)：人IgG组与S2组的P值小于0.01，抗uPAR抗体S2与对照组人IgG组相比，差异显著，对HeLa肿瘤细胞的侵袭具有显著的抑制作用。

[0103] 表1、细胞侵袭实验的t检测结果

[0104]

[0105] 注：与人IgG组对比，*P＜0.01；

[0106] 序列表

[0107] <110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

[0108] <120>一种抗uPAR人源化抗体及其编码基因与应用

[0109] <160>10

[0110] <210>1

[0111] <211>237

[0112] <212>PRT

[0113] <213>人工序列

[0114] <220>

[0115] <223>

[0116] <400>1

[0117] Val Ser Arg Ala Ala Thr Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe[0118] 1 5 10 15[0119] Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met[0120] 20 25 30

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[0171] <223>

[0172] <400>3

[0173] Val Ser Arg Ala Ala Thr Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu[0174] 1 5 10 15[0175] Val Ala Val Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser[0176] 20 25 30

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