用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌

摘要

本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ANSB060 CGMCC No.3440及其培养方法和应用。本发明还提供了所述菌株的发酵液用于降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的方法，通过所述方法，枯草芽孢杆菌与黄曲霉毒素B1反应2小时，对其的降解率可达到70％以上，反应12小时后对B1的降解率可达到80％以上；枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素G1和M1的降解率可分别达到80％和60％以上。本发明的枯草芽孢杆菌解毒活性高、特异性强、作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，适用于去除饲料中的黄曲霉毒素。

权利要求

1.一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisANSB060，其保藏编号为CGMCC No.3440。

2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，取所述枯草芽孢杆菌种子液1-5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，所述培养基由如下组分组成：蛋白胨5-10g、葡萄糖5-8g、磷酸氢二钾0.1-0.2g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、一水硫酸锰

0.5-2.0g、七水硫酸镁0.5-2.0g、蒸馏水800-1200mL，pH值为6.5-7.5。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵时间18-36h，pH值6.5-7.5，转速150-225r/min。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ANSB060，CGMCC No.3440在降解黄曲霉毒素方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为降解饲料中的黄曲霉毒素。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素M1。

7.一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素B1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为

6.0-8.0，在20-40℃反应2-72h。

8.一种降解黄曲霉毒素G1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素G1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为

6.0-8.0，在25-45℃反应2-72h。

9.一种降解黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于，取权利要求1所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素M1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为

6.5-8.5，在20-40℃反应2-72h。

说明书

用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌

技术领域

[0001] 本发明涉及枯草芽孢杆菌，特别是涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1、G1和M1的枯草芽孢杆菌。

背景技术

[0002] 自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的预防和去毒方法。目前对黄曲霉毒素解毒方法的研究主要有化学处理法和物理脱毒法等。传统的理化方法去毒都存在一些问题，如导致饲料中的营养损失，影响饲料的感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了实际生产中的应用。

[0003] 利用微生物脱毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有刘大岭等(真菌提取液对黄曲霉毒素解毒作用的研究[J].广东药学院学报，1995，11(2)：92～94.)发现一种真菌代谢产物具有降解毒素的作用。国外的研究报道比较多的集中在乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌和白腐真菌等，还有橙色黄杆菌、红球菌、假密环菌、根霉菌等。对于乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50％以下，而且最关键的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一些细菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作用时间、溶液pH值、菌体数量、毒素浓度、金属离子浓度等影响，尚未发现一种微生物能完全的不可逆的降解饲料中的黄曲霉毒素。

[0004] 至今为止，未见关于枯草芽孢杆菌及其代谢产物降解黄曲霉毒素的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

[0006] 本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌的培养方法及其应用。

[0007] 所述枯草芽孢杆菌是发明人筛选得到的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ANSB060，其细胞形态和理化特征见表1：

[0008] 表1.细胞形态和理化特征

[0009]试验项目 结果 试验项目 结果
革兰氏染色 阳性 利用碳水化合物产酸
细胞形状 杆状 葡萄糖 +
细胞直径＞1μm - 木糖 +
形成芽孢 + L-阿拉伯糖 +
试验项目 结果 试验项目 结果
芽孢膨大 - 甘露醇 +
芽孢圆形 - 利用葡萄糖产气 -
接触酶 + 利用柠檬酸盐 +
氧化酶 + 50℃生长 -
厌氧生长 - pH5.7生长 +
VP试验 + 7％NaCl生长 +
VP＜pH6 + 淀粉水解 +
VP＞pH7 - 分解酪素 +
甲基红试验 + 硝酸盐还原 +

[0010] 本发明还提供所述枯草芽孢杆菌的培养方法，取所述枯草芽孢杆菌种子液1-5ml，接种到50-100ml培养基中进行摇瓶发酵培养。

[0011] 其中，所述枯草芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件9
相同，种子液的活菌浓度以10CFU/ml计；

[0012] 所述培养基由如下组分组成：蛋白胨5-10g、葡萄糖5-8g、磷酸氢二钾0.1-0.2g、磷酸二氢钾1.0-2.0g、一水硫酸锰0.5-2.0g、七水硫酸镁0.5-2.0g、蒸馏水800-1200mL，pH值为6.5-7.5；

[0013] 优选地，所述培养基由如下组分组成：蛋白胨10g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾0.15g、磷酸二氢钾1.5g、一水硫酸锰1.0g、七水硫酸镁1.5g、蒸馏水1000mL，pH值为7.0；

[0014] 所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵时间18-36h，pH值6.5-7.5，转速150-225r/min；

[0015] 优选地，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为37℃，发酵时间24h，pH值7.0，转速200r/min。

[0016] 本发明还提供所述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3440在降解黄曲霉毒素方面的应用。

[0017] 所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素M1。

[0018] 本发明还提供利用上述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3440降解黄曲霉毒素B1的方法，取所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素B1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为6.0-8.0，在20-40℃反应2-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素B1；

[0019] 其中，所述黄曲霉毒素B1溶液的浓度以500ppb计；

[0020] 优选地，将反应体系的pH值调节为7.2，在30℃反应72h。

[0021] 本发明还提供利用上述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3440降解黄曲霉毒素G1的方法，取所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素G1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为6.0-8.0，在25-45℃反应2-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素G1；

[0022] 其中，所述黄曲霉毒素G1溶液的浓度以500ppb计；

[0023] 优选地，将反应体系的pH值调节为7.0，在37℃反应64h。

[0024] 本发明还提供利用上述枯草芽孢杆菌CGMCC No.3440降解黄曲霉毒素M1的方法，取所述枯草芽孢杆菌的发酵液500-900μl，加入黄曲霉毒素M1溶液100-500μl，将反应体系的pH值调节为6.5-8.5，在20-40℃反应2-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素M1；

[0025] 其中，所述黄曲霉毒素M1溶液的浓度以500ppb计；

[0026] 优选地，将反应体系的pH值调节为7.5，在37℃反应48h。

[0027] 特别的，本发明所述的枯草芽孢杆菌CGMCC No.3440可用于降解饲料中的黄曲霉毒素。

[0028] 本发明的枯草芽孢杆菌及其解毒方法具有以下有益效果：

[0029] 1)本发明的枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的效率高、特异性强，对黄曲霉毒素B1和G1的降解率可达80％以上，对M1的降解率可达到60％以上，且为不可逆降解。

[0030] 2)本发明降解黄曲霉毒素的方法解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响，适用于去除饲料中的黄曲霉毒素。

[0031] 3)本发明降解黄曲霉毒素的方法操作简单，对饲料和环境没有污染，有效地解决了传统去毒方法存在的问题。

附图说明

[0032] 图1为对照组黄曲霉毒素B1图谱；

[0033] 图2为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素B1图谱；

[0034] 图3为枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1的时间规律图；

[0035] 图4为对照组黄曲霉毒素G1图谱；

[0036] 图5为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素G1图谱；

[0037] 图6为对照组黄曲霉毒素M1图谱；

[0038] 图7为枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素M1图谱。

[0039] 保藏信息说明

[0040] 本发明所述的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060，已于2009年11月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3440。

具体实施方式

[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0042] 黄曲霉毒素B1购自Sigma公司(生产批号为LB56678)，G1以及M1购自Supelco公司(其生产批号分别是LB64302和LB64710)；

[0043] PBS(0.01mol/L)的制备：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L。

[0044] 实施例1本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

[0045] 取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060 CGMCC No.3440 5ml(活菌浓度为9
10CFU/ml)，接种于50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37℃，pH值7.0，转速
200r/min，发酵时间24h。

[0046] 其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨10g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾1.0g，一水硫酸锰0.5g，七水硫酸镁1.0g，蒸馏水1000mL；pH值为7.0。

[0047] 发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

[0048] 实施例2本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

[0049] 取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060 CGMCC No.3440 1ml(活菌浓度为9
10CFU/ml)，接种于80ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为25℃，pH值7.5，转速
225r/min，发酵时间36h。

[0050] 其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨5g，葡萄糖8g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾2.0g，一水硫酸锰1.0g，七水硫酸镁2.0g，蒸馏水1200mL；pH值为7.5。

[0051] 发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

[0052] 实施例3本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

[0053] 取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060 CGMCC No.3440 2ml(活菌浓度为9
10CFU/ml)，接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为45℃，pH值6.5，转速
185r/min，发酵时间18h。

[0054] 其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨8g，葡萄糖6g，磷酸氢二钾0.15g，磷酸二氢钾1.5g，一水硫酸锰2.0g，七水硫酸镁0.5g，蒸馏水800mL；pH值为6.5。

[0055] 发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

[0056] 实施例4本发明枯草芽孢杆菌的培养方法

[0057] 取枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060 CGMCC No.3440 4ml(活菌浓度为9
10CFU/ml)，接种于50ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为35℃，pH值7.0，转速
150r/min，发酵时间36h。

[0058] 其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蛋白胨10g，葡萄糖8g，磷酸氢二钾0.18g，磷酸二氢钾1.3g，一水硫酸锰0.8g，七水硫酸镁1.7g，蒸馏水1000mL；pH值为7.0。

[0059] 发酵结束后，将发酵液保存在4℃冰箱内备用。

[0060] 实施例5本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素B1

[0061] 吸取900μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与100μl黄曲霉毒素B1(500ppb)反应；对照组为900μl PBS缓冲液中加入100μl黄曲霉毒素B1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.2，处理组和对照组分别在30℃反应2h、12h、24h、48h以及72h。

[0062] 将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素B1的浓度。

[0063] 检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，72h时黄曲霉毒素的出峰时间分别为9.66min(对照组，图1)和9.60min(处理组，图2)。

[0064] 检测结果：枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1的降解率随时间变化的曲线见图3。在2h时枯草芽孢杆菌处理组对黄曲霉毒素B1的降解率为76.9％，12小时可达到80％以上，
24小时后，其降解率没有显著变化，72h时的降解率为82.1％。

[0065] 实施例6本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素G1

[0066] 吸取800μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与200μl黄曲霉毒素G1(500ppb)反应；对照组为800μl PBS缓冲液中加入200μl黄曲霉毒素G1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.0，处理组和对照组均在37℃反应64h。

[0067] 将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素G1的浓度。

[0068] 检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇∶水＝1∶1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，黄曲霉毒素的出峰时间分别为7.37min(对照组，图4)和7.35min(处理组，图5)。

[0069] 检测结果：与对照组相比，枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素G1的降解率为84.7％，见图4和图5。

[0070] 实施例7本发明的枯草芽孢杆菌用于降解黄曲霉毒素M1

[0071] 吸取500μl实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液，与500μl黄曲霉毒素M1(500ppb)反应；对照组为500μl PBS缓冲液中加入500μl黄曲霉毒素M1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.5，处理组和对照组均在37℃反应48h。

[0072] 将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素G1的浓度。

[0073] 检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为水∶乙腈∶甲醇(68∶24∶8)，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量10μl，黄曲霉毒素的出峰时间分别为7.78min(对照组，图6)和7.77min(处理组，图7)。

[0074] 检测结果：与对照组相比，枯草芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素M1的降解率为61.7％，见图6和图7。