一种青霉菌菌种的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用

摘要

一种青霉菌菌种的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用，即以草甘膦废水为唯一碳源，通过选择性富集、驯化培养、划线分离和纯化，从自然界活性污泥中分离得到能高效降解草甘膦废水的工程菌。经形态、培养特征及生理生化实验结果观察，鉴定出青霉菌(Penicillium sp.)对草甘膦废水有很高降解效果。本发明的工程菌可应用于处理草甘膦废水及城市生活污水中有机污染物的净化处理。所述青霉菌最适生长条件：温度为30℃，pH为7.0，底物浓度为600mL·L-1。工程菌处于最适生长条件下，其对草甘膦废水降解率最高可达95.52％，矿化程度较高，处理设备成本低，操作简单，应用广泛。

权利要求

1.青霉菌CTGU-CGL-002(Penicillium sp.CTGU-CGL-002)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 209204，保藏日期2009年9月16日。

2.如权利要求1所述的青霉菌CTGU-CGL-002在降解草甘膦废水中的应用。

说明书

一种青霉菌菌种的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种青霉菌菌种及其筛选方法，本发明还涉及该菌种在降解草甘膦废水中的应用。

背景技术

[0002] 草甘膦的化学名称为N-膦羧甲基甘氨酸，属于氨基甲撑膦类含有羧酸基的化合物。草甘膦废水具有浓度高、污染严重的特点，废水所含的污染物主要有甲醇、甲醛、草甘膦以及盐类等。现今，我国草甘膦废水的处理也是一个急需解决的难题。若不进行处理任其排入环境中，不可避免地会污染水源、传播疾病、危害人们的身心健康。

[0003] 根据国内外废水处理现已采用的工艺及运行情况，当前的环境处理技术主要分为：(1)物理处理技术，包括活性炭处理、活性氧化铝吸附、加入CaCl2溶液使草甘膦以钙盐的形式沉淀等，该处理技术主要用于去除水中难溶解的大颗粒污染物。在处理过程中没有真正降解废水，只是进行了简单的吸附作用或物态的转化；并且处理过程中需要调节pH值，在最适pH下才能达到最佳处理效果，操作过程复杂。(2)化学处理技术，如Fenton、氧化一镁盐沉淀法、次氯酸钠氧化、铁炭微电解法等。虽然目前以TiO2及Fenton为代表热点研究的高级氧化技术具有条件宽松，水污染处理相对简单等优势，但Fenton及TiO2氧化方法及技术对有机物矿化不完全、技术还处于研究阶段，需要进一步开发。(3)生物处理技术，是从自然界中选育菌株来处理废水的原始形式，即利用废水中的有毒污染物作为唯一碳源或者主要碳源，从而对废水进行降解。生物处理技术优势体现在处理废水量大，转化率高；操作管理简单、处理设备成本及运行费用低；无二次污染，对环境友好；该方法尤其对小分子有机物有良好的降解效果。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种筛选高效降解草甘膦废水的工程菌的方法；

[0005] 本发明的另一个目的是将这种青霉菌用于降解草甘膦废水。

[0006] 本发明的目的是这样实现的：

[0007] 青霉菌CTGU-CGL-002(Penicillium sp.CTGU-CGL-002)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 209204，保藏日期2009年9月16日。

[0008] 青霉菌CTGU-CGL-002的筛选方法，包括以下步骤：

[0009] a菌株的富集步骤

[0010] 在容器中，加入草甘膦废水及以体积比计3倍于草甘膦废水的富集培养基，再加入曝气静置24h的污泥，置于摇床中，30℃恒温振荡培养3天；

[0011] b菌株的驯化步骤

[0012] 在无菌条件下加入草甘膦废水、菌液以及无机盐培养基，草甘膦废水的体积逐渐递增，置于摇床中30℃恒温振荡培养，4天为一个驯化周期，进行三个周期的驯化，每个驯化周期结束后，测定每瓶培养液的COD值，计算出降解率，每组取平行样中草甘膦废水降解率最高的培养液作为下一次驯化的接种源；

[0013] c菌株的纯化步骤

[0014] 经过了三个周期的驯化，在无菌条件下，取废水降解率最高的培养液在含有草甘膦废水的无机盐平板上涂布，废水与无机盐培养液体积比为3∶2，30℃恒温培养，挑取单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。

[0015] 所述富集培养基组成是：单位：g/L，蛋白胨，1.0；葡萄糖，5.0；K2HPO4，1.0；KH2PO4，1.0；NaCl，2.5g；pH7.0-7.2。

[0016] 所述的无机盐培养基组成是，单位：g/L，KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；MgSO4·7H2O，0.2；CaCl2，0.1；NaCl，0.2；MnSO4·H2O痕量；质量分数10％的FeSO4溶液1滴；NH4NO3，1.0g；
废水加入作为微生物生长的唯一碳源；用质量分数为10％的NaOH溶液调节pH为7.0；固体培养基加质量分数为1.5-2.0％的琼脂。

[0017] 培养温度：最适温度为30℃；培养方式：好氧培养；培养底物浓度：600mL·L-1；pH值范围：最适pH为7.0。

[0018] 青霉菌CTGU-CGL-002在降解草甘膦废水中的应用。

[0019] 本发明提供的青霉菌菌种的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用，从自然界的活性污泥中筛选到一株能降解草甘膦废水的好氧微生物，即在有氧条件下能矿化草甘膦废水的微生物，然后经过选择性富集、驯化培养、筛选和纯化的过程，最终分离筛选出能高效降解废水中高浓度有机物的菌株，得到了一种用于降解草甘膦废水的青霉菌。本发明将此青霉菌应用于降解草甘膦废水，最高降解率达95.52％。

附图说明

[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0021] 图1是温度对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。

[0022] 将菌悬液10mL接入废水体积为30mL(培养液总体积为50mL)、pH为7.0的10mL无机盐培养液中，在不同的培养温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)下恒温振荡培养。培养4d后，测定培养液的COD，得出在不同温度条件下菌株降解废水的降解曲线。

[0023] 图2是pH对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。

[0024] 将菌悬液10mL、废水30mL接入不同的pH(4、5、6、7、8、9、10、11)的无机盐培养基中，30℃条件下恒温振荡培养4d，测定培养液的COD，得出在不同pH条件下菌株降解废水的降解曲线。

[0025] 图3是底物浓度对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。

[0026] 在无机盐培养基中加入不同体积的废水(5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL)，再接入菌悬液10mL，配制成不同底物浓度的培养基，在30℃，pH为7.0下恒温振荡培养(培养液总体积为50mL)4d，测定培养液的COD，得出在不同底物浓度下菌株降解废水的降解曲线。

[0027] 图4是最优条件下草甘膦废水降解曲线(a)和空白实验(b)。

[0028] 菌株降解草甘膦废水的最佳降解条件为：温度30℃、pH为7.0、底物浓度为-1600mL·L 。在菌株生长最适条件下，每隔10h测定培养液COD，得出草甘膦废水降解率随时间的变化曲线。

具体实施方式

[0029] 本发明提供的青霉菌CTGU-CGL-002(Penicillium sp.CTGU-CGL-002)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 209204，保藏日期2009年9月16日。

[0030] 青霉菌CTGU-CGL-002的制备方法：

[0031] (一)、该菌种的分离步骤

[0032] a菌株的富集

[0033] 在250mL的锥形瓶中，加入30mL富集培养基，草甘膦废水10mL，再加入曝气静置24h的污泥10mL(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养3d。

[0034] b菌株的驯化过程

[0035] 在无菌条件下加入草甘膦废水、菌液以及无机盐培养基，草甘膦废水的体积由10mL、15mL逐渐递增到30mL，培养液总体积均为50mL，置于摇床中30℃恒温振荡培养，4d为一个驯化周期，进行三个周期的驯化。每个驯化周期结束后，测定每瓶培养液的COD值，计算出降解率。每组取平行样中草甘膦废水降解率最高的培养液作为下一次驯化的接种源。

[0036] c菌株的纯化与鉴定

[0037] 经过了三个周期的驯化，在无菌条件下，取废水降解率最高的培养液在含有草甘膦废水的无机盐平板(废水与无机盐培养液体积比为3∶2)上涂布，30℃恒温培养，挑取单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。将所得到的菌株接种于查氏培养基平板上，4℃冰箱保存。菌株的鉴定，采用形态和显微观察相结合的方法，根据文献进行特性鉴定。

[0038] (二)、培养该菌种采用的培养基

[0039] 富集培养基(g/L)：蛋白胨，1.0；葡萄糖，5.0；K2HPO4，1.0；KH2PO4，1.0；NaCl，2.5g；pH7.0-7.2。

[0040] 无机盐培养基(g/L)：KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；MgSO4·7H2O，0.2；CaCl2，0.1；NaCl，0.2；MnSO4·H2O痕量；质量分数10％的FeSO4溶液1滴；NH4NO3，1.0g；废水按一定体积(10、
15、30mL)加入作为微生物生长的唯一碳源；用质量分数为10％的NaOH溶液调节pH为7.0；
固体培养基加质量分数为1.5-2.0％的琼脂。

[0041] 查氏培养基(g/L)：NaNO3，2g；KH2PO4，1g；KCl，0.5g；MnSO4，0.5g；FeSO4，0.01g；蔗糖，30g；质量分数为1.5％-2.0％的琼脂；pH为7.0。

[0042] (三)、菌种的培养条件

[0043] 培养温度：最适温度为30℃；

[0044] 培养方式：好氧培养；

[0045] 培养底物浓度：600mL·L-1；

[0046] pH值范围：最适pH为7.0。

[0047] (四)、该菌种的形态特征

[0048] 形态特征：该菌在查氏培养基平板上生长，绒毛状菌落，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。菌株基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都带有不同颜色，菌落边缘和中心、正面和背面颜色不同，中心白色、正面青绿色、背面褐色，孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色；生理生化特征：菌丝粗长，有孢子，菌丝无隔，不运动，有分枝的丝状体。

[0049] 青霉菌CTGU-CGL-002在降解草甘膦废水中的应用：

[0050] 实施例1

[0051] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入5mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达28.15％。

[0052] 实施例2

[0053] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入10mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达56.08％。

[0054] 实施例3

[0055] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入15mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达67.27％。

[0056] 实施例4

[0057] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入20mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达76.27％。

[0058] 实施例5

[0059] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入25mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达80.23％。

[0060] 实施例6

[0061] 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入30mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养基(共计50mL)，置于摇床中，30℃恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达95.52％。

[0062] 所述草甘膦废水采自湖北宜昌某草甘膦生产集团。其废水主要理化性质为：砖红-1 -1色、略带刺味、偏酸性、BOD 47.8mg·L 、COD 1898.39mg·L 。

[0063] 所述污泥采自：废水所在集团污水处理厂废水排污口污泥，曝气静置24h。