用于治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法与用途转让专利
申请号 : CN200910250533.4
文献号 : CN101716319B
文献日 : 2012-02-15
发明人 : 方步武
申请人 : 方步武
摘要 :
本发明公开了具有治疗及预防慢性肝纤维化和肝硬化的中药组合物(蒿鳖养阴软坚方)，它是由其包括作为活性成份的原料药材或其活性提取物和可药用的载体组成。其中青蒿0.01～50份，鳖甲6～75份，生地6～75份，知母6～50份，丹参6～75份，虎杖6～75份，白花蛇舌草6～75份，郁金6～50份，泽兰6～50份。本发明的蒿鳖养阴软坚方组合物具有活血软坚散结、养阴凉血、清热利湿解毒的功能。药效学实验结果表明：对于多种原因如慢性病毒性肝炎、血吸虫病和长期饮酒以及化学毒物中毒等所致的肝纤维化和肝硬化具有治愈率高、效果显著的特点，有很好的应用前景，值得临床上推广使用。
权利要求 :
1.用于治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物，它是由作为活性成份的下列重量份数的原料药材或其活性提取物和可药用的载体组成，所述原料药材：青蒿0.01～50份 鳖甲6～75份 生地6～75份知母6～50份 丹参6～75份 虎杖6～75份白花蛇舌草6～75份 郁金6～50份 泽兰6～50份。
2.权利要求1所述的中药组合物，其中原料药材重量份数比为：青蒿6～40份 鳖甲10～55份 生地10～55份知母6～40份 丹参6～55份 虎杖6～55份白花蛇舌草10～55份 郁金6～40份 泽兰6～40份。
3.权利要求1所述的中药组合物，其中的原料药材重量份数比为：青蒿9～25份 鳖甲10～40份 生地10～40份知母9～25份 丹参10～40份 虎杖10～40份白花蛇舌草15～40份 郁金9～25份 泽兰9～25份。
4.权利要求1所述的中药组合物，其中所述的活性提取物是采用水、乙醇或它们的混合物作为溶剂提取的。
5.权利要求1～3任一项所述的中药组合物，其特征在于将其中所述的原料药材或其活性提取物与任何一种或几种药学上可接受的载体混合制成口服制剂。
6.一种制备权利要求1～3任一项所述治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化中药组合物的方法，其包括：a.先将鳖甲煎煮2小时，加入其他八味药材，以6-10倍量水提取1-3次，合并滤液，将药渣晾干，再用40％-80％乙醇，提取1-3次，每次0.5-2小时，合并滤液，过滤后浓缩得到活性提取物；将活性提取物与药学上可接受的载体充分混合后制成各种口服制剂；或者b.将鳖甲、生地用水8-10倍量水提取1-3次，每次1-3小时；将其它七味药材用
50％-95％的乙醇，6-8倍量提取1-3次，每次1-3小时，合并滤液，过滤后浓缩得到活性提取物；将活性提取物与药学上可接受的载体充分混合后制成各种口服制剂。
7.权利要求1～3任一项所述组合物在制备治疗及预防肝纤维化和肝硬化药物中的应用。
8.权利要求7所述的应用，包括：慢性病毒性肝炎、血吸虫病或长期饮酒以及化学毒物中毒所致的肝纤维化和肝硬化。
9.权利要求1～3任一项所述组合物在制备治疗及预防CCl4复合因素所致的肝纤维化和肝硬化药物中的应用。
说明书 :
用于治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法与用途
技术领域
[0001] 本发明属于中药制剂技术领域，涉及治疗和预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物，更具体的说是《蒿鳖养阴软坚方》组合物抗肝纤维化的作用及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 肝纤维化是由多种病因引起的以细胞外基质增多为特征的病理变化，它存在于各种慢性肝病的发病过程中，也是影响慢性肝病预后的重要因素之一。肝纤维化的常见原因包括慢性病毒性肝炎、大量酒精摄入、血吸虫病等。乙型、丙型病毒性肝炎是我国的多发病，酒精性肝病逐年增多，散在流行的血吸虫病所致肝损害，这些肝病特别是病毒性肝炎(乙型、丙型)易慢性化及存在肝纤维化，后者是慢性肝病发展为肝硬化的必经之路，部分可形成肝癌，也与其它多种常见病的发病有关。预后差，严重影响劳动生产力和国民经济的发展。世界著名肝病专家Hans Popper早就指出，谁能阻止或减慢肝纤维化的发生将会治愈大多数慢性肝病患者。近来研究表明肝纤维化是可以逆转的。
[0003] 肝纤维化的防治仍是一个世界性难题，目前尚无特效治疗。现代医学治疗肝纤维化尚处于实验研究阶段，如干预某一发病环节，抗炎、抗氧化、抑制胶原合成、基因治疗。极少数用于临床者疗效并不理想或不良反应大难以接受。
[0004] 中医药防治肝纤维化取得一定疗效。临床上强调辨证论治，以复方为主，辨证加减，可有效地改善症状。有代表性的研究：1960年代桃红四物汤治疗血吸虫病性肝纤维化。1970年代强肝软坚汤的系列研究。1980年代以丹参为主的复方；养阴补肾复方；凉血活血复方。1990年代益气活血法，对异种血清蛋白、CCl4、D-氨基半乳糖、血吸虫病性肝纤维化均有明显的防治作用。其间，还有主张温阳补肾、活血化瘀、养阴柔肝、清热利湿、健脾益气等治法的复方，其中多数复方基于数法合用。对实验性肝纤维化有防治作用的单体包括苦杏仁甙、丹酚酸A、水飞蓟素、氧化苦参碱、大黄素等。
[0005] 上述多数药物特别是单味药或单体的疗效尚需评价，目前已上市的抗肝纤维化中药制剂均为以益气活血法为主组方的制剂，尚未见以养阴活血法为主组方的制剂，且作用机制并不十分明确，使应用受限。
[0006] 由于阴虚血瘀、血热毒蕴证型常见于慢性肝病活动期并发肝纤维化患者，如慢性活动型肝炎、慢性重症肝炎、活动期肝硬化，病例较多，病情较重，治疗难，预后较差，目前缺少针对这一证型的抗肝纤维化药物；相反，目前上市的抗肝纤维化药物主要是针对气虚血瘀证型，多用于慢性肝病静止期如慢性迁延性肝炎、静止期肝硬化；因此，本专利处方针对尚无治疗阴虚血瘀、血热毒蕴证型的肝纤维化的药物这一事实，解决这一为数不少的人群的问题，其实这也是临床更需要的。
发明内容
[0007] 本发明人多年从事慢性病毒性肝炎、血吸虫病和长期饮酒以及化学毒物中毒等所致的肝纤维化和肝硬化的治疗研究工作。在总结个人多年积累的临床用药经验基础上，结合中医理论，阅读了大量中医中药关于治疗慢性肝病肝纤维化和肝硬化的书籍，以《温病条辨》的青蒿鳖甲汤化裁为基础，增加活血解毒、清热利湿药物，以养阴活血法为主组方，功效主治有了显著的变化。但如何能从众多的药材中筛选出有治疗效果的药材，如何将筛选的药材进行有效组合，如何选择合理的配比，如何提出组方中的活性提取物，使之达到高效、无毒的目的是一项艰苦、细致工作。
[0008] 本发明人经过多年的长期试验摸索惊奇地发现：将一定量的青蒿、鳖甲、生地、知母、丹参、虎杖、白花蛇舌草、郁金、泽兰共九味药合理组成或提取其中的有效活性成分，对治疗及预防慢性病毒性肝炎、血吸虫病和长期饮酒以及化学毒物中毒等所致的肝纤维化和肝硬化有显著的疗效。为此，本发明人进行了大量的尝试性试验，在保证疗效的前提下，进一步完善了各味中药的不同配比，终于完成了本发明的试验，自行研制出了无毒副作用，服用方便的治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物，暂且命名为《蒿鳖养阴软坚方》。因此，
[0009] 本发明的目的之一在于公开了治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物。
[0010] 本发明的目的之二在于公开了治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化中药组合物的制备方法。
[0011] 本发明的目的之三在于公开了治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物在制备治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。包括：慢性病毒性肝炎、血吸虫病或长期饮酒以及化学毒物中毒等所致的肝纤维化和肝硬化。例如在制备治疗血吸虫性肝纤维化和肝硬化与CCl4复合因素所致的肝纤维化和肝硬化的药物中的应用。本发明详细的技术方案如下：
[0012] 一种治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化的中药组合物，其包括作为活性成份的下列重量份数的原料药材或其活性提取物和可药用的载体，所述原料药材包括：
[0013] 青蒿0.01～50份 鳖甲6～75份 生地6～75份
[0014] 知母6～50份 丹参6～75份 虎杖6～75份
[0015] 白花蛇舌草6g～75份 郁金6～50份 泽兰6～50份。
[0016] 本发明所述的中药组合物，优选的原料药材重量份数比为：
[0017] 青蒿6～40份 鳖甲10～55份 生地10～55份
[0018] 知母6～40份 丹参6～55份 虎杖6～55份
[0019] 白花蛇舌草10～55份 郁金6～40份 泽兰6～40份。
[0020] 本发明所述的中药组合物，更加优选的原料药材重量份数比为：
[0021] 青蒿9～25份 鳖甲10～40份 生地10～40份
[0022] 知母9～25份 丹参10～40份 虎杖10～40份
[0023] 白花蛇舌草15～40份 郁金9～25份 泽兰9～25份。
[0024] 本发明所述组合物中的原料药材，在不影响疗效的情况下，可以根据需要进行适当的替换。例如，丹参可用丹皮、赤芍、桃仁或红花代替；泽兰可用楮实子、八月札或益母草代替；青蒿可用青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、白薇、银柴胡或胡黄连代替；当选用青蒿素或青蒿琥酯时其用量为0.01～6份，优选0.01份；鳖甲可用龟板代替；生地可用玄参、犀角、水牛角或枸杞代替；白花蛇舌草可用半枝莲、半边莲、拳参、垂盆草、土茯苓、鱼腥草、蒲公英、地锦草或夏枯草代替；知母可用天花粉代替；郁金可用姜黄、虎杖、三棱或莪术代替；虎杖可用平地木、郁金、刘寄奴或延胡索代替。
[0025] 本发明所述的鳖甲别名为别甲、甲鱼壳、团鱼壳、制鳖甲等。青蒿别名为嫩青蒿、香蒿、方溃、野兰蒿、苦蒿、黄花蒿等。生地(生地黄)别名为干地黄、干生地、酒壶花、山烟、山白菜、甜酒棵、蜜罐棵等。地黄包括：生地黄和熟地黄，本专利处方用生地黄(生地)。知母别名为连母、水须、穿地龙。丹参别名为赤参、紫丹参、酒丹参、红根、赤根、活血根、大红袍、木羊乳、奔马草等。虎杖别名阴阳莲、大叶蛇总管、大虫杖、苦杖、苦杖根、酸杖、酸杆、酸通、酸桶笋、斑杖、斑草、斑根、斑庄根、杜牛膝、土地榆、雄黄连、活血龙、紫金龙、子金龙。白花蛇舌草别名蛇舌草、白花蛇草、蛇舌癀、蛇针草、舌总管。郁金别名玉金、入金、乙金、温郁金等。泽兰别名水香、水泽。
[0026] 本发明所述中药组合物中的活性提取物是用水、乙醇或它们的混合物作为溶剂提取的。例如可以选用30％-70％低剂量乙醇，也可以选用75％-95％高剂量乙醇提取活性成分，然后与任何一种或几种药学上可接受的载体混合制成口服制剂。
[0027] 本发明所述治疗及预防慢性肝病肝纤维化和肝硬化中药组合物的制备方法，其包括：a.先将鳖甲煎煮2小时，加入其他八味药材，以6-10倍量水提取1-3次，合并滤液，将药渣晾干，再用40％-80％乙醇，提取1-3次，每次0.5-2小时，合并滤液，过滤后浓缩得到活性提取物；将活性提取物与药学上可接受的载体充分混合后制成各种口服制剂；或者b.将鳖甲、生地用水8-10倍量水提取1-3次，每次1-3小时；将虎杖、丹参等其它七味药材用50％-95％的乙醇，6-8倍量提取1-3次，每次1-3小时，合并滤液，过滤后浓缩得到活性提取物；将活性提取物与药学上可接受的载体充分混合后制成各种口服制剂。
[0028] 本发明的中药组合物可以是肠道给药和非肠道给药的任何剂型，优选将原料药材或其活性提取物与任何一种或几种药学上可接受的载体充分混合制成口服制剂。优选的口服制剂。例如汤剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或滴丸等等。例如将上述诸味药材混合共研细末，分别装入胶囊，每次10克，日2-4次。特殊的情况可根据患者的病情适当地加以调节。
[0029] 本发明所述的一种或几种药学上可接受的药用载体包括：常规的稀释剂、填充剂[0030] (如乳糖、阿司帕坦、木糖醇、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠)。还可以包括：磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、干淀粉、聚山梨酯-80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质等等。例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂或适量硬脂酸镁等等。
[0031] 在本发明的一个优选实例中，将所述的原料药材用常规溶剂提取，制成活性提取物。优选的常规溶剂选自水、乙醇或它们的混合物。当用乙醇和水的混合物作为提取溶剂时，乙醇的浓度为30～95％(V/V)。
[0032] 在本发明的一个优选实例中，先将鳖甲煎煮2-3小时，加入其他把八味药材(青蒿、知母、生地、丹参、虎杖、白花蛇舌草、郁金、泽兰)，6-8倍量水提取1-3次，将药渣晾干，用60-95％乙醇，6-10倍量提取2-3次，合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0033] 在本发明的另一个优选实例中，按上述方法将合并的滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.38～1.40的清膏，加入适量蔗糖和糊精，制成颗粒，干燥，整粒，分包，制成颗粒剂。
[0034] 在本发明的还一个优选实例中，按上述方法将合并的滤液，回收乙醇，减压干燥成干浸膏，粉碎，加入少量淀粉等辅料，混匀后，装胶囊。
[0035] 在本发明的再一个优选实例中，按上述方法将合并的滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.38～1.40的清膏，加入淀粉等辅料，制成颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，压片，包薄膜衣。瓶装或泡罩包装。
[0036] 本发明还有的优选实例中丸剂按上述方法将合并的滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.38～1.40的清膏，加入少量淀粉等辅料，混合、干燥、粉碎成细粉，用水泛制成水丸或用蜜水泛制成水蜜丸，选丸，干燥即得。
[0037] 本发明另外还有的优选实例中，按上述方法将合并的滤液进一步经醋酸乙酯和正丁醇分别萃取制得精制提取物，然后按照精制提取物与聚乙二醇重量份数比为1∶1.0～2.0的比例充分混合制成滴丸。本发明所选用的各味中药材的功效如下：
[0038] 蒿鳖养阴软坚方是根据主药和主要功效来命名的，它由《温病条辨》的青蒿鳖甲汤化裁而来，但增加活血解毒、清热利湿药物，功效主治有变化。全方由青蒿、鳖甲、生地、知母、丹参、虎杖、白花蛇舌草、郁金、泽兰共九味药组成。
[0039] 方中，鳖甲滋阴软坚散结，可入络搜邪，青蒿清热凉血截疟，可芳香透络，合鳖甲领阴分余热外出，共奏养阴软坚清热之功，同为方中主药。生地清热凉血、养阴生津，知母清热泻火、滋阴润燥；虎杖活血定痛、解毒，丹参活血祛瘀、凉血，此四味均为辅药。白花蛇舌草解毒、清热利湿，为佐药。虎杖清热利湿，可退黄，丹参养血安神，能缓解并发的心悸、失眠，均可兼作佐药。郁金凉血清心安神、活血止痛、利胆退黄，泽兰活血疏肝通络、利水，均为辅药，并均兼作佐药和使药。诸药合用，共奏养阴软坚散结、凉血解毒、清热利湿之功，用于阴虚血瘀、血热毒蕴证型的慢性活动期肝病，如病毒性肝炎、酒精摄入、血吸虫感染等所致的慢性活动性肝炎、慢性重症肝炎、活动期肝硬化，以及其它疾病如慢性静止期肝病(症状较轻)等见阴虚血瘀、血热毒蕴证型者。症见：胁痛，衄血，腹壁青筋暴露，唇紫，发热或潮热，心烦，失眠，甚至湿热浊邪蒙蔽清窍而致神昏谵语，或湿热熏蒸引起黄疸，腹胀或腹痛，口干、口苦，舌质红或红绛或紫黯或瘀点瘀斑，舌苔黄，脉沉弦或弦细数等。
[0040] 需要加以说明的是：根据需要鳖甲也可用龟板代替；青蒿也可用青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚或白薇、银柴胡、胡黄连代替，疗效相同。生地可用玄参、犀角、水牛角或枸杞代替；虎杖可用郁金、平地木代替疗效相同。白花蛇舌草可用半枝莲、半边莲、拳参、垂盆草、土茯苓、鱼腥草、蒲公英、地锦草或夏枯草代替；知母可用天花粉代替；郁金可用虎杖代替也具有相同的疗效。
[0041] 蒿鳖养阴软坚方为本专利申请人创制的方剂：鳖甲、青蒿为必用之药，当病机为阴伤而邪伏阴分为主者，鳖甲、青蒿为君药，(君、臣、佐、使，也就是主、辅、佐、使)；当阴虚重者，鳖甲、生地为君药；当阴虚火旺明显者，鳖甲、知母为君药；当血瘀血热重、心神不宁突出者，鳖甲、丹参、郁金为君药；当湿热熏蒸黄疸重者，鳖甲、虎杖、郁金为君药；当湿热毒邪重者，鳖甲、虎杖、白花蛇舌草为君药；当阴虚水肿者，鳖甲、泽兰为君药。
[0042] 本发明的蒿鳖养阴软坚方组合物所具有的优点和特点在于：
[0043] 1、本发明的蒿鳖养阴软坚方组合物以养阴活血软坚、凉血解毒法组方，治法不同于现有的抗肝纤维化药物。目前抗肝纤维化的上市药或院制剂如强肝软坚汤系列、鳖甲软坚片、复方鳖甲软肝片、鳖甲煎丸、复方319胶囊、复方861等，总体上是益气活血法在这些方剂中起主导作用，不宜用于阴虚血瘀的各种慢性肝病，由于病情较重的各种慢性活动性肝病则多数属于阴虚血瘀证型，尚未见针对这一主要证型的药物，本专利处方则正好抓住这一关键问题，以养阴活血软坚、凉血解毒法组方，故立法组方有新颖性。
[0044] 2.立法组方符合临床病变规律，主治不同于现有的抗肝纤维化药物。慢性肝病一般可分为活动期及静止期，前者如慢性活动性肝炎、慢性重症肝炎、活动期肝硬化，后者如慢性迁延性肝炎、静止期肝硬化。在慢性肝病活动期，肝细胞损害加重，肝功能异常明显；病毒标志物可多项阳性且传染性强；细胞免疫功能仍低下，体液免疫却异常亢进；辨证多属于阴虚血瘀、血热毒蕴证型，症状如前所述，治法是养阴活血(软坚)、凉血解毒，本专利处方即因此而立，但并不排除慢性肝病静止期患者见阴虚血瘀证型者，但其临床症状轻于慢性肝病活动期患者，故可小其量使用蒿鳖养阴软坚方于阴虚血瘀证型的慢性肝病静止期患者，有是证用是药，扩大了应用范围，故有临床基础与实用性。
[0045] 本发明进一步公开了中药组合物在制备治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的用途。包括：慢性病毒性肝炎、血吸虫病或长期饮酒以及化学毒物中毒(CCl4复合因素)所致的肝纤维化和肝硬化。
[0046] 下面通过药效学实验数据，对慢性病毒性肝炎、血吸虫病或长期饮酒以及化学毒物中毒所致的肝纤维化和肝硬化加以进一步的说明：为了使提取工艺更完善，生产的样品在临床使用更有效，对正交实验的活性提取物进行药理筛选。药理所需样品提取方案如下。
[0047] 方案一样品制备：
[0048] 有效成分低含量组(1-1)：先将鳖甲煎煮2小时，加入其他八味药材，6倍量水提取1次，每次1小时(正交1)。将药渣晾干，用40％乙醇6倍量提取1次，每次0.5小时(正交1)，回收乙醇，合并滤液，浓缩，定容至所需浓度，备用。
[0049] 有效成分中含量组(1-2)：将鳖甲煎煮2小时后，加入其他八味药材，8倍量提取2次，每次2小时(正交5)，合并滤液。将药渣晾干，用80％乙醇8倍量提取1次，提取时间2小时(正交8)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0050] 有效成分高含量组(1-3)：将鳖甲煎煮2小时后，加入其他八味药材，8倍量提取3次，每次1小时，合并滤液，将药渣晾干，用60％乙醇6倍量提取2次，每次0.5小时(最佳方案)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0051] 方案二样品制备：
[0052] 有效成分低含量组(2-1)：将鳖甲、生地用水8倍量提取一次，提取时间1小时(正交1)。将虎杖，丹参等其它七味药材用50％的乙醇，6倍量提取1次，提取时间1小时(正交1)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0053] 有效成分中含量组(2-2)：将鳖甲、生地用8倍量水提取3次，每次2小时(正交3)，合并滤液，备用。将虎杖、丹参等其他七味药材用65％乙醇8倍量提取3次，每次1小时(正交5)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0054] 有效成分高含量组(2-3)：将鳖甲、生地用10倍量水提取3次，每次1小时(最佳方案)，合并滤液。将虎杖、丹参等其他七味药材用80％乙醇提取，8倍量提取3次，每次2小时合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0055] 其他备用方案
[0056] 方案一：
[0057] 有效成分水提高含量组+醇提低含量组(3-1)：将鳖甲煎煮2小时后，加入其他八味药材，8倍量提取提取3次，每次1小时(最佳方案)，合并滤液，将药渣晾干，用40％乙醇6倍量提取1次，每次0.5小时(正交1)，回收乙醇，合并滤液，浓缩，定容至所需浓度，备用。
[0058] 有效成分水提低含量组+醇提高含量组(3-2)：先将鳖甲煎煮2小时，加入其他把八味药材，6倍量水提取1次，每次1小时(正交1)，将药渣晾干，用60％乙醇6倍量提取2次，每次0.5小时(最佳方案)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0059] 方案二：
[0060] 有效成分水提高含量组+醇提低含量组(4-1)：将鳖甲、生地用10倍量水提取3次，每次1小时(最佳方案)，合并滤液。将虎杖，丹参等其它七味药材用50％的乙醇，6倍量提取1次，提取时间1小时(正交1)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0061] 有效成分水提低含量组+醇提高含量组(4-2)：将鳖甲、生地用水8倍量提取一次，提取时间1小时(正交1)。将虎杖、丹参等其他七味药材用80％乙醇提取，8倍量提取3次，每次2小时(最佳方案)，合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0062] 一、蒿鳖养阴软坚方抗肝纤维化的药理作用研究
[0063] 1.1蒿鳖养阴软坚方在体内抗肝纤维化的作用
[0064] 1.1.1对牛血清白蛋白免疫性大鼠肝纤维化的治疗作用
[0065] 1.1.1.1材料与方法
[0066] (1)动物SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号：SCXK-(军)2002-001)，天津医科大学实验动物中心饲养。
[0067] (2)药品供试药为采用本专利的提取方案(3-2)及中试规模制备的蒿鳖养阴软坚方原料药。以复方药物成分青蒿素(HPLC-ELSD测定)、丹酚酸B和虎杖苷(HPLC测定)作为质控指标。阳性对照中药复方鳖甲软肝片为内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司产品(国药准字Z19991011)，阳性对照西药秋水仙碱为Sigma公司产品。
[0068] (2)主要试剂：L-羟脯氨酸：电泳纯，上海康达氨基酸厂，批号920506；对二甲氨基苯甲醛：分析纯，天津化学试剂研究所，批号20020322；高氯酸：优级纯，天津市化学试剂一厂，批号20070039；生物染色剂丽春红S(上海三爱思试剂有限公司，批号20050114)和维多利亚蓝B(华东师范大学化工厂，批号20060430)；透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型胶原(PCIII)和CIV型胶原放免测试盒购自解放军总医院科技开发中心；其他均为市售分析纯或优级纯试剂。
[0069] (3)主要仪器：VIS-7220紫外可见分光光度计、HZS-H型水浴振荡器、FA2104SN电子天平、电热鼓风干燥箱、光学显微镜等。
[0070] (4)模型制备、分组、用药
[0071] 牛血清白蛋白免疫性大鼠肝纤维化模型，采用我们的方法(方步武，等.益气活血合剂抗牛血清白蛋白免疫性肝纤维化的研究.中国中西医结合杂志，1992，12(12)：738-40)。牛血清白蛋白(BSA)和福氏不完全佐剂的乳化液对大鼠皮下免疫注射5次，以BSA于尾静脉攻击注射15次后，处死6只大鼠，以肝组织形态和羟脯氨酸评价肝纤维化形成，即开始以蒿鳖养阴软坚方原料药粉治疗用药。正常对照组(正常组)动物不造模，而用生理盐水代替造模药物使用。模型形成后，将造模动物按体重随机区组分组，采用提取方案(3-2)制备的蒿鳖养阴软坚方原料药大、中、小剂量(8.20g/kg、2.59g/kg、0.82g/kg，分别相当于生药40.37g/kg(体重)、12.78g/kg、4.04g/kg)治疗用药，同时设阳性药物对照。灌胃大鼠，每日1次，每周用药6天(停用1天)，至实验结束。留取肝组织及血标本，检测指标。
[0072] (5)指标检测
[0073] ①肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量测定，采用Jamall法，通过标准曲线求Hyp含量(μg/mg)，乘以系数22.38(6000/50×7.46/40)(μg/mg＝mg/g，胶原蛋白/肝干粉)即为胶原蛋白含量。②血清肝纤维化指标检测，III型胶原(PIIIP)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)采用放射免疫分析法。③肝组织形态学观测肝组织缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片，HE染色和胶原染色(显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法.见：龚志锦，詹鎔洲.病理组织制片和染色技术.第1版.上海：上海科学技术出版社，1994.70.其中胶原纤维呈鲜红色。CCl4肝纤维化治疗用药的标本用Masson染色法)，光镜观察。肝纤维化程度分期及计分标准见文献(王泰龄，等.对慢性肝炎分类、分级分期的探讨.中华肝脏病杂志，1995，3(3)：130～3王泰龄，等.慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度计分方案.中华肝脏病杂志，1998，6(4)：185～7)。
[0074] (6)统计分析计量资料表示为x±s，采用SPSS8.0统计软件，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，其中每两组间比较在方差齐性时用Tukey HSD检验而方差不齐时用Tamhane或Games Howell检验。非正态分布资料用非参数检验，其中多组间比较用Kruskal-Wallis检验，两组间比较用Mann-Whitney U检验。半定量资料采用Ridit分析。
[0075] 1.1.1.2结果
[0076] 模型对照组肝胶原蛋白含量、血清HA和CIV水平均显著升高，8.20g/kg和2.59g/kg蒿鳖养阴软坚方能明显降低胶原蛋白，前者还能明显降低CIV，后者还能明显降低HA(P＜0.05)，见表1、表2。模型对照组(含短模和长模)的肝纤维化程度分期与计分均显著增高，8.20g/kg蒿鳖养阴软坚方能明显减低纤维化程度分期，高、中、低剂量的蒿鳖养阴软坚方皆能明显减低纤维化程度计分(P＜0.05)。见表3，图1～图8。
[0077] 表1蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对BSA致肝纤维化大鼠肝胶原蛋白和血清HA的影响
[0078]
[0079] 注：对胶原蛋白的One-Way ANOVA，F＝10.410，P＝0.000；因方差齐次性检验，P＜0.05，故每两组间比较采用Tamhane检验；与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。对透明质酸的单因素方差分析，F＝6.818，P＝0.000；因方差不齐(P＜0.05)，故每两组间比较采用Tamhane检验；与正常对照组比较，#P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05。
[0080] 表2蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对BSA致肝纤维化大鼠血PCIII、CIV、LN的影响
[0081]
[0082] 注：对PCIII的单因素方差分析，F＝1.067，P＞0.05。对CIV的单因素方差分析，F＝4.336，P＝0.001；因方差齐次性检验，P＞0.05，故每两组间比较采用Tukey HSD检验；与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。对层粘连蛋白的单因素方差分析，F＝2.742，P＝0.021。因方差不齐(P＜0.01)，故每两组间比较采用Tamhane检验。
[0083] 表3.蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对BSA致大鼠肝纤维化程度分期及计分的影响
[0084]
[0085] 注：肝纤维化程度分期：治疗前模型组与正常对照组比较，u＝3.207，P＜0.01。2
除外治疗前模型组，其余7组间Ridit分析，χ ＝27.204，P＜0.001；治疗后模型组与正常对照组比较，u＝3.651，P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片及秋水仙碱组分别与治疗后模型组比较，u＝2.891，2.094，2.010，1.968，2.220，P＜0.01，P
2
＜0.05。纤维化程度计分：多组间Kruskal-Wallis检验，χ ＝35.888，P＝0.000。两组间Mann-Whitney U检验，治疗前和后模型组分别与正常对照组比较，Z＝-3.754，-4.045，##
P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组及秋水仙碱组分别与治疗后模型组比较，Z＝-3.373，-2.379，-2.172，-1.800，-2.870，*P＜0.01，**P＜0.05。
除外治疗前模型组，其余7组间Ridit分析，χ ＝27.204，P＜0.001；治疗后模型组与正常对照组比较，u＝3.651，P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片及秋水仙碱组分别与治疗后模型组比较，u＝2.891，2.094，2.010，1.968，2.220，P＜0.01，P
2
＜0.05。纤维化程度计分：多组间Kruskal-Wallis检验，χ ＝35.888，P＝0.000。两组间Mann-Whitney U检验，治疗前和后模型组分别与正常对照组比较，Z＝-3.754，-4.045，##
P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组及秋水仙碱组分别与治疗后模型组比较，Z＝-3.373，-2.379，-2.172，-1.800，-2.870，*P＜0.01，**P＜0.05。
[0086] 1.1.1.3讨论与结论
[0087] (1)BSA致大鼠肝纤维化模型成功。
[0088] (2)8.20g/kg和2.59g/kg蒿鳖养阴软坚方具有治疗BSA致大鼠免疫性肝纤维化的作用。
[0089] 1.1.2对血吸虫尾蚴感染所致小鼠血吸虫病性肝纤维化的治疗作用
[0090] 1.1.2.1材料与方法
[0091] (1)动物昆明种小鼠，SPF级，150只，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号：SCXK-(军)2002-001)，天津医科大学实验动物中心饲养。
[0092] (2)钉螺鄱阳湖湖区野生钉螺湖北亚种购自江西省血吸虫病防治研究所。
[0093] (3)药品同1.1.1.1项下
[0094] (4)试剂明胶、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基硫酸钠(SDS)、N，N，N‘，N’一四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵、聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)、Tris、甘氨酸、溴酚蓝、Triton X-100、考马斯亮蓝G-250、低分子量标准蛋白质等。其余同1.1.1.1项下。
[0095] (5)主要设备紫外可见光分光光度计、台式高速离心机、垂直电泳槽、电泳仪、凝胶图像光密度分析系统等。
[0096] (6)小鼠血吸虫病性肝纤维化模型制备结合文献(曾令兰，等.日本血吸虫感染小鼠肝脏IL-2、TNF-α的表达及注射该因子后对肝纤维化的影响.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2003，21(3)：150-152)和本室条件制定方法：按要求孵育钉螺，血吸虫尾蚴，计数，每只小鼠感染血吸虫尾蚴25条，小鼠腹部同一部位剪毛，将涂有血吸虫尾蚴的盖玻片贴在去毛部位，保持约0.5h至干，感染后35天用吡喹酮除虫，至感染后90天，随机取10只小鼠，留肝及血标本，以肝组织形态和羟脯氨酸含量评价肝纤维化形成后，即开始治疗用药。正常对照组采用稀释液代替尾蚴悬液贴皮。
[0097] (7)分组与用药采用随机区组分组法从150只动物中取8只作为正常对照组，其余全部用于造模3个月，成模后按体重随机区组分组法分为短期模型对照组、长期模型对照组、蒿鳖养阴软坚方高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性中药对照组(复方鳖甲软肝片)、阳性西药对照组(秋水仙碱组)，分别灌胃高、中、低剂量的鳖养阴软坚方(11.575g/kg，3.663g/kg，1.159g/kg)、复方鳖甲软肝片(0.768g/kg)、秋水仙碱(0.128mg/kg)，每日1次，每周用药6天(休息1天)，连续3个月。
[0098] (8)指标检测Hyp测定采用Jamall等的方法。透明质酸和III型胶原测定按试剂盒说明书进行。肝组织以10％福尔马林缓冲液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。MMP2和MMP9检测：采用明胶酶谱法，取-80℃冻存的小鼠肝组织50mg，用PBS冰浴匀浆，12000r/min离心30min抽提蛋白。用考马斯亮蓝G-250法进行蛋白定量。配制SDS-PAGE胶(底物明胶已加入)，以每孔50μg蛋白量上样，进行电泳。电泳结束后，凝胶经洗脱、孵育、考马斯亮蓝染色、脱色至显示出MMP-2和MMP-9为位于蓝色背景上的透亮带。经标准蛋白对照，均为酶原型MMP。以凝胶成像仪扫描，用分析软件测定酶分解条带的亮度和面积。
[0099] (9)统计分析同1.1.1.1项下。
[0100] 1.1.2.2结果
[0101] (1)一般情况：小鼠感染尾蚴后，饮食、活动减少，灌胃吡喹酮后死亡8只，重者出现腹水，造模第3个月死亡40只；灌胃死亡8只；剩余94只，其中几例保存时损失。
[0102] (2)肝组织胶原蛋白短模组和长模组与正常组比较，肝组织胶原蛋白显著升高(P＜0.01)；与长模组比较，蒿鳖养阴软坚方高、中剂组胶原蛋白明显降低(P＜0.05)。见表4。
[0103] (3)血清肝纤维化标志物短模组和长模组与正常组比较，血清HA显著升高(P＜0.01，P＜0.05)；与长模组比较，蒿鳖养阴软坚方中、低剂组胶原蛋白明显降低(P＜0.05)。各组间PCIII差异未见统计学意义。见表4。
[0104] (4)肝组织形态学观察正常小鼠肝汇管区纤维组织少，肝小叶结构正常。短模组和长模组小鼠肝汇管区纤维组织大量增生，充满整个汇管区，甚至包绕周围的肝组织；中央静脉及血窦周围可见纤维组织增生；小叶内可见大小不等的近似园形的纤维组织团块；汇管区、血窦及纤维组织中可见虫卵及死亡的虫体。各治疗组纤维组织增生有不同程度的减轻，蒿鳖养阴软坚方高、中剂量组的疗效明显。见表5，图9～图16。
[0105] 表4蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对血吸虫肝纤维化鼠肝胶原蛋白和血HA、PCIII的影响
[0106]
[0107]
[0108] 注：对胶原蛋白而言，短模组与正常对照组之间的t检验，t＝7.440，P＝0.000；除外短模组的各组间One-Way ANOVA，F＝9.785，P＝0.000；每两组间比较采用Tamhane检验，与正常对照组比较，##P＜0.01；与长模组比较，*P＜0.05。对HA来说，短模组与正常对照组之间的t检验，t＝3.437，P＜0.01；除外短模组的各组间One-Way ANOVA，F＝
3.532，P＜0.01；每两组间比较采用Tukey HSD检验，与正常对照组比较，#P＜0.05；与长模组比较，*P＜0.05。对PCIII而言，除外短模组的各组间单因素方差分析，F＝2.742，P＜0.05。
3.532，P＜0.01；每两组间比较采用Tukey HSD检验，与正常对照组比较，#P＜0.05；与长模组比较，*P＜0.05。对PCIII而言，除外短模组的各组间单因素方差分析，F＝2.742，P＜0.05。
[0109] 表5.蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对血吸虫性小鼠肝纤维化程度分期及计分的影响
[0110]
[0111] 注：对纤维化程度分期的Ridit分析：短模组与正常组之间比较，u＝3.652，P2
＜0.01。除外短模组的多组间比较，χ ＝44.136，P＜0.001。长模组与正常组之间比较，u＝3.651，P＜0.01。高、中、低剂量蒿鳖养阴软坚方、复方鳖甲软肝片、秋水仙碱分别与长模组比较，u＝3.964，5.184，3.438，4.064，4.015，P＜0.01。高剂量蒿鳖养阴软坚方分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，u＝2.204，2.451，P＜0.05。对纤维化程度
2
计分的非参数统计，多组间的Kruskal-Wallis检验，χ ＝62.782，P＝0.000。两组间的Mann-Whitney U检验，与正常组比较，Z值分别为-3.727，-3.795，##P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组及秋水仙碱组分别与长模组比较，Z值分别为-3.932，-4.194，-3.996，-4.137，-3.999，**P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高剂量组与秋水仙碱组比较，Z＝-2.324，$P＜0.05。
＜0.01。除外短模组的多组间比较，χ ＝44.136，P＜0.001。长模组与正常组之间比较，u＝3.651，P＜0.01。高、中、低剂量蒿鳖养阴软坚方、复方鳖甲软肝片、秋水仙碱分别与长模组比较，u＝3.964，5.184，3.438，4.064，4.015，P＜0.01。高剂量蒿鳖养阴软坚方分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，u＝2.204，2.451，P＜0.05。对纤维化程度
2
计分的非参数统计，多组间的Kruskal-Wallis检验，χ ＝62.782，P＝0.000。两组间的Mann-Whitney U检验，与正常组比较，Z值分别为-3.727，-3.795，##P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组及秋水仙碱组分别与长模组比较，Z值分别为-3.932，-4.194，-3.996，-4.137，-3.999，**P＝0.000；蒿鳖养阴软坚方高剂量组与秋水仙碱组比较，Z＝-2.324，$P＜0.05。
[0112] (5)对肝组织MMP2和MMP9的影响与正常对照组比较，肝纤维化小鼠肝MMP9和MMP2的面积和亮度均显著升高(P＜0.01)。与长模组比较，蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组的MMP9亮度均明显降低(P＜0.05)；蒿鳖养阴软坚方高剂量组的MMP2面积明显降低(P＜0.05)，其亮度呈降低趋势。见图17。
[0113] 1.1.2.3讨论与结论
[0114] (1)血吸虫尾蚴致小鼠肝纤维化模型成功。
[0115] (2)11.58g/kg、3.66g/kg蒿鳖养阴软坚方具有治疗血吸虫性小鼠肝纤维化的作用，1.16g/kg剂量也有一定的作用。
[0116] 1.1.3对CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化的治疗作用
[0117] 1.1.3.1材料与方法
[0118] (1)动物SPF级Wistar大鼠230只，雌雄各半，体重220g～240g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(军)2002-001。饲养于天津医科大学实验动物中心，室温20～22℃，24h昼夜节律。实验前大鼠适应环境3天，自由进食进水，进食、饮水和一般功能活动正常者纳入试验。
[0119] (2)药品分别用本专利的十种提取方案所致蒿鳖养阴软坚方合剂，皆含生药2g/ml。
[0120] (3)主要试剂和主要设备橄榄油：化学纯，北京化学试剂公司，批号：69018028；四氯化碳：分析纯，天津大学科威公司，批号：20061028；其余同1.1.1.1项下。
[0121] (4)模型制备对韩德五的方法略加修改：按体重随机区组分组法，随机取8只大鼠为正常对照组(正常组)，其余大鼠均用于造模。造模第一次四肢皮下注射CCl40.5ml/100g体重，以后每隔3天四肢皮下注射CCl4橄榄油溶液(CCl4∶橄榄油＝4∶6，V/V)0.5ml/100g体重，共注射16次，平时以10％乙醇为唯一饮料，但注射前一天临时改为洁净自来水为饮料，注射后再立即改为10％乙醇。造模时不用玉米面、猪油、胆固醇。
[0122] (5)分组与给药造模45天后，随机取8只造模鼠(短模组)，经肝胶原蛋白含量测定与肝组织形态学观察证实肝纤维化形成。对其余造模鼠按体重随机区组分组法分为21组：模型对照组(长模组)、十种提取方案的大剂量组、小剂量组(临床等效剂量组)。造模成功后开始治疗用药：大、小剂量组每天分别给予24.48g生药/kg体重和8.16g/kg，每天1次，每周用药6天，连续2个月。正常对照组和长模组灌胃等体积蒸馏水。所有大鼠饲以标准饲料。最后一次用药后24h，留取肝组织和血标本。
[0123] (6)指标检测和统计分析同1.1.1.1项下
[0124] 1.1.3.2结果
[0125] (1)一般情况正常组大鼠生长良好、活泼好动，饮食正常，皮毛柔顺有光泽；模型组大鼠精神差，活动少，皮毛松弛无光泽；治疗组大鼠皮毛少光泽，但精神较好。
[0126] (2)十种方案提取的蒿鳖养阴软坚方治疗用药对肝组织胶原蛋白含量的影响多种提取方案均有一定的降低肝胶原蛋白含量的作用，以方案1-1提取的药物24.48g生药/kg治疗作用最强(P＜0.05)，方案3-2提取的药物8.16g生药/kg的作用次之。见表6。
[0127] 表6.蒿鳖养阴软坚方十种方案提取的合剂对CCl4肝纤维化大鼠肝胶原蛋白的影响
[0128]
[0129] 注：表中22个组间One-Way ANOVA，F＝1.598，P＝0.055，每两组间比较采用Tamhane检验，与正常对照组比较，##P＜0.01。当对模型对照组及正常对照组分别与方案1-1或方案3-2比较时：对于方案4，F＝17.016，P＝0.000，方案4高剂量组与模型对照组比较，*P＜0.05；对于方案6，F＝15.497，P＝0.000，方案6中剂量组与模型对照组比较，$P＝0.075。
[0130] (3)对大鼠血清肝纤维化标志物的影响提取方案1-1和3-2制备的蒿鳖养阴软坚方24.48g生药/kg和8.16g生药/kg用药均能明显降低血清HA水平，而且明显降低血清IV-C，见表7。
[0131] 表7蒿鳖养阴软坚方提取方案1-1和3-2治疗对CCl4致鼠肝纤维化血清标志物影响
[0132]
[0133] 与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
[0134] (4)肝组织病理形态学变化
[0135] 肉眼观察：正常组大鼠肝脏颜色红活，表面光滑，边缘锐，质地软；模型组大鼠肝脏增大，颜色浅，表面见粗或颗粒，边缘钝，质地韧；治疗组(特别是方案1-1和方案3-2提取的药物，下同)大鼠肝脏颜色较红，略增大，表面尚光滑，少数可见细小颗粒，个别肝脏颜色红润，形态接近正常。
[0136] 镜下观察：正常组大鼠肝组织可见肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射样排列，板间有不规则肝窦，肝小叶内网状纤维支架结构完整，分布规律，汇管区无扩大，无纤维组织增生和炎性细胞浸润；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团，肝细胞变性坏死，汇管区扩大，胶原沉积；同纤维化模型组比较，治疗组肝细胞的变性坏死程度及肝小叶结构破坏程度降低，肝脏胶原纤维增生亦明显减轻，纤维条索疏松变窄。模型组的肝纤维化程度分期显著高于正常组(P＜0.01)，各治疗组的纤维化程度均有所减降，但未见统计学差异。见表8，见图18～图21。
[0137] 表8蒿鳖养阴软坚方提取方案1-1和3-2对CCl4致大鼠肝纤维化程度分期的影响[0138]
[0139] 注：Ridit分析，长模组与正常对照组之间比较，P＜0.01。
[0140] 1.1.3.3讨论与结论
[0141] (1)CCl4致大鼠肝纤维化模型成功。
[0142] (2)关于药物疗效：由于这里的造模仅用CCl4、酒精，未加用猪油、胆固醇、玉米面，慢性肝损伤略轻；同时采用治疗给药，一则因时间较长，CCl4所致肝纤维化有自行吸收倾向，二则治疗肝纤维化较之预防的难度大，但尽管如此，蒿鳖养阴软坚方仍呈现良好的治疗CCl4所致大鼠肝纤维化的作用，方案1-1提取的药物含生药24.48g/kg治疗作用最强(P＜0.05)，方案3-2提取的药物含生药8.16g/kg的作用次之。
[0143] 1.1.4对CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化的预防作用
[0144] 1.1.4.1材料与方法
[0145] (1)动物SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重200g～220g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(军)2002-001。
[0146] (2)药品同1.1.1.1项下
[0147] (3)主要试剂和主要设备1.1.1.1项下。
[0148] (4)模型制备按韩德五的方法(韩德五，等.葫芦素B对实验性肝炎与肝硬变的防治作用.中华医学杂志，1979，59(4)：206～9)。
[0149] (5)分组与给药按体重随机区组分组为正常对照组、模型对照组、蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组，除外正常对照组，其余各组均按上述方法造模，造模开始即进行预防用药，依次给予蒸馏水、蒸馏水、提取方案(3-2)制备的蒿鳖养阴软坚方原料药8.20g/kg、2.59g/kg、0.82g/kg，每日1次，每周6天，连续8周。
[0150] (6)指标检测和统计分析同1.1.1.1项下
[0151] 1.1.4.2结果
[0152] (1)蒿鳖养阴软坚方提取方案3-2原料药对CCl4致肝纤维化大鼠肝胶原蛋白和血清HA、PCIII、CIV及LN的影响见表9，表10。
[0153] 表9蒿鳖养阴软坚方提取方案3-2预防用药对CCl4肝纤维化鼠肝胶原蛋白和血HA影响
[0154]
[0155] 注：对胶原蛋白的One-Way ANOVA，F＝10.063，P＝0.000；因方差不齐(P＜0.05)，故每两组间比较采用Tamhane检验；与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05。对HA的单因素方差分析，F＝6.421，P＝0.000；因方差不齐，两组间比较用Tamhane检验，模型对照组与正常对照组比较，P＝0.072；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0156] 表10蒿鳖养阴软坚方提取方案3-2预防CCl4肝纤维化大鼠血PCIII、CIV及LN变化
[0157]
[0158] 注：对于PCIII，各组间比较F＝2.576，P＜0.05；且方差齐性，两组间比较用LSD检验，与正常对照组比较，##P＜0.01，与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与秋水仙碱组比较，$P＜0.05。对于CIV，各组间比较F＝1.061，P＞0.05；但模型对照组与正常对照组比较，#P＜0.05。对于LN，各组间比较F＝1.314，P＞0.05。
[0159] (2)蒿鳖养阴软坚方提取方案3-2原料药预防CCl4致肝纤维化大鼠肝组织形态变化见表11，图22，图23。
[0160] 表11蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对CCl4致大鼠肝纤维化程度分期及计分的影响
[0161]
[0162] 注：对肝纤维化程度分期的Ridit分析，多组间比较，χ2k1＝41.085，P＜0.001。模型对照组与正常对照组比较，u＝2.089，P＜0.05。高、中、低剂量蒿鳖养阴软坚方组分别与模型对照组比较，u值为4.110，3.046，1.161，P＜0.01，0.01，＞0.05。高剂量蒿鳖养阴软坚方分别与其中、低剂量组及复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，u值为别为2.249，
2.487，3.620，3.620，P＜0.05，0.05，0.01，0.01；蒿鳖养阴软坚方中剂量组与低剂量组比较，u＝2.063，P＜0.05。对肝纤维化程度计分的非参数统计，多组间的Kruskal-Wallis
2
检验，χ ＝49.180，P＝0.000。两组间的Mann-Whitney U检验，模型对照组与正常对照组比较，Z＝-3.767，##P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组分别与模型对照组比较，Z值分别为-4.305，-3.673，-3.196，**P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高剂量组分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，Z值分别为-3.771，-3.731，$$P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方中剂量组分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，Z值分别为-2.286，-1.978，$P＜0.05。
2.487，3.620，3.620，P＜0.05，0.05，0.01，0.01；蒿鳖养阴软坚方中剂量组与低剂量组比较，u＝2.063，P＜0.05。对肝纤维化程度计分的非参数统计，多组间的Kruskal-Wallis
2
检验，χ ＝49.180，P＝0.000。两组间的Mann-Whitney U检验，模型对照组与正常对照组比较，Z＝-3.767，##P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组分别与模型对照组比较，Z值分别为-4.305，-3.673，-3.196，**P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方高剂量组分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，Z值分别为-3.771，-3.731，$$P＜0.01；蒿鳖养阴软坚方中剂量组分别与复方鳖甲软肝片、秋水仙碱组比较，Z值分别为-2.286，-1.978，$P＜0.05。
[0163] 1.1.4.3讨论与结论
[0164] (1)CCl4复合因素致大鼠肝纤维化模型成功。
[0165] (2)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)制备的原料药8.20g/kg和2.59g/kg具有预防CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化的作用。
[0166] 1.1.5对酒精性大鼠肝纤维化的预防作用
[0167] 1.1.5.1材料与方法
[0168] (1)动物SPF级Wistar大鼠100只，雄性，体重200g～240g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(军)2002-001。
[0169] (2)药品同1.1.1.1项下
[0170] (3)造模原料吡唑为Fluca公司产品，羰基铁粉(YTF-0，基础粉)由岳龙超细金属材料有限公司提供，衡水老白干(65度)由衡水安平人和酒业生产。大鼠基础饲料(面料)由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，金龙鱼玉米油为嘉里粮油(天津)有限公司产品，猪油购自市场。自制高脂饲料含大鼠基础饲料80％、猪油4％、玉米油16％和羰基铁0.125％。
[0171] (4)主要试剂和主要设备丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其余同1.1.1.1项下。
[0172] (5)模型制备造模大鼠8:00灌胃白酒，每日一次，酒精度逐渐增加，依次为10％，20％，30％，40％，50％，60％，每个浓度灌胃2天，最后增至65％并维持该浓度再灌酒8周，该维持剂量相当于6.2g/kg.d，体积均为1.2ml/100g.d，并用吡唑25mg/kg.d溶于酒内灌胃。期间，造模大鼠饮用10％酒，食用含0.125％羰基铁、16％玉米油、4％猪油的基础饲料。
正常对照大鼠每日同时灌胃蒸馏水，以自来水和大鼠标准块料喂养。
正常对照大鼠每日同时灌胃蒸馏水，以自来水和大鼠标准块料喂养。
[0173] (6)分组与给药实验分2批进行，每批随机取4只大鼠为正常对照组(正常组，共8只)，其余均用于造模。当灌酒浓度增加到65％时，对造模大鼠按体重随机区组法分组为模型对照组(模型组，32只)、蒿鳖养阴软坚方高、低剂量组(各20只)、阳性对照药秋水仙碱组(20只)。同时进行预防性用药，每天一次于傍晚灌胃治疗药物，分别以蒿鳖养阴软坚
1/3
方和秋水仙碱的临床等效剂量，按公式dB＝dA×(RB/RA)×(WA/WB) 计算出大鼠用药剂量，
1/3
由此算得的蒿鳖养阴软坚方用量作为低剂量(2.59g/kg.d)，以该剂量的10 倍作为高剂量(8.2g/kg.d)；秋水仙碱组剂量为0.09mg/kg.d。模型对照组傍晚灌胃蒸馏水。10周后结束实验，留取肝组织和血标本。
1/3
方和秋水仙碱的临床等效剂量，按公式dB＝dA×(RB/RA)×(WA/WB) 计算出大鼠用药剂量，
1/3
由此算得的蒿鳖养阴软坚方用量作为低剂量(2.59g/kg.d)，以该剂量的10 倍作为高剂量(8.2g/kg.d)；秋水仙碱组剂量为0.09mg/kg.d。模型对照组傍晚灌胃蒸馏水。10周后结束实验，留取肝组织和血标本。
[0174] (7)指标检测和统计分析肝组织病理分级标准参照文献(王泰龄.酒精性肝病的病理和分类.胃肠病学，2003，8(5)：299-302)：1级：脂肪变＜30％，局灶性气球样变，少数小坏死灶；2级：脂肪变＞30％，气球样变，多数小坏死灶，Mallory小体形成，局部中性粒细胞浸润；3级：脂肪变＞50％，坏死灶融合或形成桥接坏死，伴明显的Mallory小体形成；4级：脂肪变＞75％，损伤广泛。血清脂质过氧化物(MDA)用荧光分光光度法检测。血清ALT、AST、ALB、TP按试剂盒的方法测定，球蛋白(GLOB)＝TP-ALB。其余同1.1.2.1项下。
[0175] 1.1.5.2结果
[0176] (1)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)降低酒精性肝损伤大鼠的死亡率及增加体重[0177] 模型对照组死亡23只、存活9只，死亡率(71.9％)显著升高(P＜0.01)；蒿鳖养阴软坚方高剂量组死亡10只、存活10只(死亡率50％)，低剂量组死亡9只、存活11只(死亡率45％)，秋水仙碱组死亡12只、存活8只(死亡率60％)，蒿鳖养阴软坚方组死亡率较模型对照组明显降低(P＜0.05)，且体重较模型对照组增加。
[0178] (2)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)减轻酒精性肝损伤大鼠肝组织病理改变[0179] 正常对照组大鼠肝小叶结构、中央静脉和汇管区结构正常，肝细胞无变性及坏死，未见炎症细胞浸润；模型对照组中央静脉周围肝细胞肿胀，胞浆疏松化，肝细胞溶解坏死，胞浆内出现大量脂滴，呈中至重度脂肪变，伴大量炎症细胞浸润，窦周、小叶内、中央静脉周围和汇管区纤维组织增生；蒿鳖养阴软坚方组见少数肝细胞肿胀，胞浆疏松化，个别胞浆中出现脂滴，少数炎症细胞浸润，纤维组织增生减少。见表12，图24～图27。
[0180] 表12蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对酒精性肝损伤大鼠肝脏病理改变的影响[0181]
[0182] 注：多组间Ridit分析，χ2＝30.130，P＜0.01*与正常对照组比较P＜0.01；#与模型对照组比较P＜0.05。
[0183] (3)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对酒精性肝损伤大鼠肝组织胶原蛋白和血清MDA的影响模型对照组肝胶原蛋白和血MDA水平显著升高(P＜0.01)，蒿鳖养阴软坚方则使之明显降低(P＜0.05)，见表13。
[0184] 表13蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)降低酒精性肝损伤大鼠肝胶原蛋白和血MDA[0185]
[0186]
[0187] 注：*与正常对照组比较P＜0.01；#与模型对照组比较P＜0.05。
[0188] (4)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对酒精性肝损伤大鼠肝功能的影响模型对照组血清ALT、AST、GLOB水平显著升高，ALB则明显降低(P＜0.01)，蒿鳖养阴软坚方使ALT、AST、GLOB明显降低，ALB明显升高(P＜0.05)，见表14。
[0189] 表14蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对酒精性肝损伤大鼠肝功能的影响[0190]
[0191] 注：*与正常对照组比较P＜0.01；#与模型对照组比较P＜0.05。
[0192] (5)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对酒精性肝损伤大鼠肝组织MMP-2、MMP-9的影响模型对照组鼠肝MMP-9和MMP-2水解条带的亮度及面积显著增高(P＜0.01)，蒿鳖养阴软坚方使之明显降低(P＜0.05)，见表15。
[0193] 表15蒿鳖养阴软坚方对酒精性肝病大鼠肝组织MMP-9、MMP-2的影响
[0194]
[0195] 注：*与正常对照组比较P＜0.01；#与模型对照组比较P＜0.05。
[0196] 1.1.5.3讨论与结论
[0197] (1)酒精性大鼠肝损伤模型形成，引起酒精性肝炎、脂肪肝、肝纤维化。
[0198] (2)蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)制备的原料药8.20g/kg和2.59g/kg具有预防酒精性大鼠肝损伤的作用，减轻肝脏炎症、脂肪变性和肝纤维化，可能通过保肝、抗脂质过氧化损伤、降低MMP-9和MMP-2。
[0199] 1.1.6对伴刀豆球蛋白A诱导的小鼠肝纤维化的预防作用
[0200] 1.1.6.1材料与方法
[0201] (1)动物Balb/c小鼠，SPF级，280只，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(合格证号：SCXK-(军)2002-001)，天津医科大学实验动物中心饲养。
[0202] (2)药品同1.1.1.1项下。
[0203] (3)主要试剂和设备Concanavalin A为Sigma公司产品，其余同1.1.1.1项下。
[0204] (4)ConA诱导小鼠肝纤维化模型制备参考Louis等的方法(Louis H，et al.Repeatedconcanavalin A challenge in mice induces an interleukin 10-producing phenotypeand liver fibrosis.Hepatology，2000，31(2)：381-90)，将Concanavalin A用量改为15mg/kg，溶解于0.9％NaCl无菌无热源注射液中，配成1.5mg/ml，经无菌0.22μm针式滤器过滤，注射体积为0.1ml/10g体重，每周1次，连续10周。相关用品经无热源处理，采用医用胰岛素注射器注射。末次注射后1周内，乙醚麻醉下，腹腔静脉采血，同时留取肝组织，按要求处理及存放标本。
[0205] (5)分组与用药实验分5批进行，每批小鼠随机取1～2只为正常对照组，其余用于造模；对造模鼠按体重随机区组法分组，通常模型对照组采用2个所分组的小鼠，各用药组均用1个所分组的小鼠；用药组包括蒿鳖养阴软坚方高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性中药(复方鳖甲软肝片)对照组、阳性西药(秋水仙碱)对照组，分别灌胃高、中、低剂量的鳖养阴软坚方(11.575g/kg，3.663g/kg，1.159g/kg)、复方鳖甲软肝片(0.768g/kg)、秋水仙碱(0.128mg/kg)，每日1次，每周用药6天(休息1天)，至实验结束。
[0206] (6)指标检测同1.1.1.1项下。
[0207] (7)统计分析同1.1.1.1项下。
[0208] 1.1.6.2结果
[0209] (1)一般情况：造模过程中小鼠死亡的80％～90％见于第1、2次注射尤其是第2次注射后，5批造模小鼠的存活率为21.0％，造模后小鼠疲乏，第1、2次注射后出现消瘦，约1个月后部分小鼠逐渐适应，一般状况好转。
[0210] (2)肝组织胶原蛋白与正常对照组比较，模型对照组肝组织胶原蛋白含量显著升高(P＜0.01)；与模型对照组比较，蒿鳖养阴软坚方低剂量组、复方鳖甲软肝片组及秋水仙碱组胶原蛋白明显降低(P＜0.05)，蒿鳖养阴软坚方高剂量组呈降低趋势(P＝0.056)。见表16。
[0211] (3)血清肝纤维化标志物由于部分标本溶血，各组间血清HA和PCIII水平未能出现显著性差异(P＞0.05)。见表16。
[0212] 表16蒿鳖养阴软坚方提取方案(3-2)对ConA致肝纤维化鼠肝胶原蛋白和血HA及PCIII的影响
[0213]
[0214] 注：对胶原蛋白的方差分析，F＝4.764，P＝0.001，与正常对照组比较，##P＜0.01，与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，与模型对照组比较，$P＝0.056。对HA的方差分析，F＝1.632，P＝0.145。对PCIII的方差分析，F＝1.615，P＝0.188。
[0215] (4)肝组织形态学观察正常小鼠肝汇管区纤维组织少，肝小叶结构正常。模型对照组小鼠肝汇管区及小叶中央静脉周围纤维组织增生，并向小叶内伸展，特别是血窦纤维组织增生；肝细胞可见点、灶状坏死，个别为大片状坏死，伴炎症细胞浸润，纤维间隔形成。各治疗组肝纤维组织的增生程度减轻。见图28～图31。
[0216] 1.1.6.3讨论与结论
[0217] (1)Con A诱导小鼠肝纤维化模型形成。
[0218] (2)1.16g/kg蒿鳖养阴软坚方具有治疗血吸虫性小鼠肝纤维化的作用，11.58g/kg剂量也有一定的作用。
[0219] 1.2蒿鳖养阴软坚方在体外抗肝纤维化的作用
[0220] 1.2.1来自正常大鼠的蒿鳖养阴软坚方药物血清对HSC-T6的作用
[0221] 1.2.1.1材料与方法
[0222] (1)实验动物、药品同1.1.1.1项下。
[0223] (2)肝星状细胞系HSC-T6为SV40转染的SD大鼠肝星状细胞，由上海中医药大学肝病研究所提供，其表现型为活化的HSC，可表达高水平的I型胶原。
[0224] (3)主要试剂特级胎牛血清，北京元亨金马生物技术开发有限公司，批号080102；DMEM培养基，北京天润善达生物科技有限责任公司，批号20080306；胰蛋白酶，GIBCO公司，批号27250；LDH测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，批号20080428；二甲基亚砜(DMSO)，AR，天津大学科威公司，批号20050515；四甲基偶氮唑盐(MTT)，SIGMA公司；碘化丙淀(PI)，GIBCO进口分装，批号2004120。
[0225] (4)仪器CK400型倒置显微镜，日本OLYMPUS；5400型CO2培养箱，美国NAPCO；FA2104SN电子天平，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；SW-CJ-1F型净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司；流式细胞仪，Coulter EPICS-XL SystemII，美国Beckman公司。
[0226] (5)制备含药血清及正常血清①灌胃药液：研磨复方鳖甲软肝片，加三蒸水配成0.055g/ml的混悬液；秋水仙碱溶于三蒸水中，使其终浓度为0.01mg/ml；蒿鳖养阴软坚方原料药粉加三蒸水配制成高(0.82g/ml)、中(0.249g/ml)、低(0.082g/ml)浓度的混悬液。
②分组及用药：Wistar大鼠按体重随机区组分为6组：蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组(8.2，2.59，0.82g/kg)、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组、正常对照组，分别灌胃相应药液，正常对照组用三蒸水，每日早、晚各1次，每次1ml/100g，连续3天。③血清制备：末次给药后1小时乙醚麻醉大鼠，无菌条件下下腔静脉采血，离心3000r/min，30min，上清即所需药物血清，同组血清混合后置56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。
正常血清制备方法同上。
②分组及用药：Wistar大鼠按体重随机区组分为6组：蒿鳖养阴软坚方高、中、低剂量组(8.2，2.59，0.82g/kg)、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组、正常对照组，分别灌胃相应药液，正常对照组用三蒸水，每日早、晚各1次，每次1ml/100g，连续3天。③血清制备：末次给药后1小时乙醚麻醉大鼠，无菌条件下下腔静脉采血，离心3000r/min，30min，上清即所需药物血清，同组血清混合后置56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。
正常血清制备方法同上。
[0227] (6)细胞培养以含10％FBS的DMEM高糖培养液，37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱中培养，隔日换液一次。
[0228] (7)细胞增殖分析0.25％胰蛋白酶消化细胞，加培养液制成单细胞悬液，以4
2×10/ml密度接种于96孔培养板，每孔100μl。培养24h后，加各组血清，每孔20μl，每组12复孔。再培养24h吸弃上清液，每孔加10μl MTT(5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加100μl DMSO，溶解结晶物。酶标仪上振荡5min，570nm处测吸光度值。抑制率＝(1-药物血清组A值/对照组A值)×100％
2×10/ml密度接种于96孔培养板，每孔100μl。培养24h后，加各组血清，每孔20μl，每组12复孔。再培养24h吸弃上清液，每孔加10μl MTT(5mg/ml)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加100μl DMSO，溶解结晶物。酶标仪上振荡5min，570nm处测吸光度值。抑制率＝(1-药物血清组A值/对照组A值)×100％
[0229] (8)HSC-T6上清液中Hyp测定取指数生长期细胞以2×104/ml密度接种于96孔培养板，每孔100μl，24h后加各组血清，每孔20μl，每组12复孔，再培养24h后，收集上清液，按Hyp试剂盒说明书进行测定。
[0230] (9)HSC-T6上清液中LDH检测细胞以2×104/ml密度接种至96孔板，每孔100μl，培养24h后，加各组血清，每孔20μl，继续培养24h，收集上清，按LDH测试盒说明书检测。
[0231] (10)细胞周期分析细胞以1×105/ml接种于50ml培养瓶，每瓶5ml，待贴壁生长至约70％时换无血清的培养液培养10h。弃培养液，PBS冲洗2次，每瓶加5ml含血清培养液，再各加1ml相应的药物血清，以正常大鼠血清对照，继续培养36h。弃培养液，PBS洗1次，加消化液制备细胞悬液，1500r/min离心5min去上清，以PBS洗细胞1次，再以0.5ml PBS悬浮细胞，制成单细胞悬液。以1ml注射器吸取单细胞悬液，迅速吹入5ml 80％冷乙醇中，以吸管吹打均匀，4℃固定24h。检测前，离心去上清，PBS洗1次后，加入碘化丙啶(50μg/ml，含RNAase 100μg/ml)，混匀后，室温避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期，据PI染色荧光强度不同，将细胞分为G0/G1期、S期、G2/M期，计算各期细胞百分比。
[0232] (11)统计学方法同1.1.1.1项下。
[0233] 1.2.1.2结果
[0234] (1)药物血清均抑制HSC-T6增殖与未用药的血清对照组比较，各药物血清组A值均明显降低(低剂量组P＜0.05，其他组P＜0.01)，见表17。
[0235] (2)上清液中Hyp和LDH的变化与未用药的血清对照组比较，各药物血清组上清液中Hyp均明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，但仅秋水仙碱组上清液中LDH显著增加(P＜0.01)，见表17。
[0236] (3)对HSC-T6细胞周期的影响蒿鳖养阴软坚方药物血清低、中、高剂量组中G0/G1期的细胞比例逐渐增高，而S期的细胞比例逐渐降低。
[0237] 表17正常大鼠的药物血清对HSC-T6增殖与上清液中Hyp及LDH的影响
[0238]
[0239]
[0240] 注：未用药的血清对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
[0241] 1.2.1.3讨论与结论
[0242] 0.82，2.59和8.2g/kg蒿鳖养阴软坚方灌胃正常大鼠所得药物血清均能显著抑制HSC-T6增殖，同时显著减少其上清液中羟脯氨酸含量，且对HSC-T6无细胞毒作用。
[0243] 1.2.2来自CCl4致肝纤维化大鼠的蒿鳖养阴软坚方药物血清对HSC-T6的作用[0244] 1.2.2.1材料与方法
[0245] (1)模型制备、分组与用药同1.1.3.1项下。
[0246] (2)其余各项同1.2.1.1项下。
[0247] 表18CCl4肝纤维化大鼠的药物血清对HSC-T6增殖与上清液中Hyp的影响[0248]
[0249] 注：与正常对照(血清)组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
[0250] 1.2.2.2结果
[0251] 与正常对照组血清比较，方案1、2、3、4、8、7大剂量组药物血清能显著抑制HSC-T6增殖(P＜0.01，P＜0.05)，同时方案1、4大剂量组及方案9小剂量组药物血清能明显降低上清液中Hyp含量(P＜0.05)，见表18。
[0252] 1.2.2.3讨论与结论
[0253] 这里，肝纤维化模型大鼠的药物血清及同期的正常对照大鼠血清制备后在-70℃存放近8个月才进行本实验的。由于有些被吸收的药物成分或其活性代谢物或由此引起的内源性活性物质较稳定，有些则不稳定，故与大鼠体内实验的结果不尽一致。同一提取方案大剂量的药物血清作用较强。肝纤维化大鼠经药物治疗所获得的药物血清在体外仍具有抗纤维发生作用(抑制活化的HSC增殖与产生Hyp)，表明药物抗肝纤维化的作用部分是通过抑制HSC产生胶原蛋白的。
[0254] 1.3蒿鳖养阴软坚方的抗乙型肝炎病毒作用
[0255] 1.3.1材料和方法
[0256] (1)HepG2 2.2.15细胞株由北京大学第一医院病毒研究室提供。
[0257] (2)动物见1.1.1.1项下。
[0258] (3)药物拉米夫定片(贺普丁)，每片含100mg拉米夫定，葛兰素史克制药(苏州)有限公司，批号08080007。蒿鳖养阴软坚方见1.1.1.1项下。
[0259] (4)主要试剂G418进口分装；GIBCO进口胎牛血清；DMEM高糖培养基，北京天润善达生物科技有限公司；胰蛋白酶，GIBCO公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)，AR，天津化学试剂一厂。罗氏诊断电化学发光试剂：电化学发光表面抗原，批号15209502，电化学发光e抗原，批号15049401，罗氏公司产品；HBV核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(S200359)，上海科华生物工程公司生产；跨缺刻引物和探针，天津市第三中心医院高英堂博士设计，基康公司合成。
[0260] (5)主要仪器CKX31型倒置光显微镜，日本OLYMPUS；HEPA CLASS 100型steri-cycleCO2培养箱，Thermo Electron公司；SA-1800-1水平层流洁净工作台，上海上净净化设备有限公司；KDC-2046低速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；2010型罗氏电化学发光免疫分析仪；ABI7000型荧光定量PCR仪。
[0261] (6)药物血清制备以我们测算的蒿鳖养阴软坚方中大黄素t1/2＝6h29min为时间间隔灌胃蒿鳖养阴软坚方混悬液6个t1/2共7次，剂量为8.2，2.59，0.82g/kg，灌胃体积1ml/100g，末次灌胃后1h，无菌条件下，腹腔静脉采血，3000r/min离心20min制备含药血清，同时制备不含药的对照血清。
[0262] (7)药物配制拉米夫定，MWt 229.26，其片剂每片含100mg，即0.4362mmol，溶解于436.2ml PBS(0.01M，pH 7.4)，即为1mmol/L的该溶液，2片拉米夫定片压碎、溶解于436.2ml PBS中即得2mmol/L，先后以滤纸和0.22μm滤膜滤器过滤，4℃存放。将蒿鳖养阴软坚方原料药粉溶于三蒸水中配成0.82g/ml混悬液，15磅高压20min灭菌。以全培养液稀释至4mg/ml的渗透压为316.0mOsm/kg(临床正常范围285.0～295.0mOsm/kg，冰点法测定)，此时培养液的颜色在中性范围内。
[0263] (8)HepG2 2.2.15培养采用10％FBS DMEM高糖培养液，37℃，饱和湿度，5％CO2培4 5
养箱中培养。0.25％胰蛋白酶消化、传代、保种。宜用进口FBS。以10 或10 密度接种于
96、24或6孔板及培养瓶。见图32。
养箱中培养。0.25％胰蛋白酶消化、传代、保种。宜用进口FBS。以10 或10 密度接种于
96、24或6孔板及培养瓶。见图32。
[0264] (9)指标检测按试剂盒说明书操作，HBsAg和HBeAg检测用罗氏电化学发光免疫分析仪，HBV DNA用ABI7000荧光定量PCR扩增仪进行检测。检测HBV cccDNA：上游引物F 5’GCCTTCTCATCTGCCGGAC，下游引物R 5’GGCTTGAACAGTAGGACATGAACA，探针为299T 5’FAM-TGCACGTCGCATGGAGACCACC-MGB(基康公司合成)，实时荧光定量PCR反应体系：DNA模板2μL、2×Realtime PCR Master Mix 12μL(TOYOBO公司)、上/下游引物1μL(10μmol/L)、探针1μL(20μmol/L)、UNG酶0.5μL，补去离子水至总反应体积24μL。扩增条件：
37℃5min、94℃2min；94℃15s、60℃40s，45个循环.每次荧光定量检测均设空白对照。以
9 3
该DNA片段构建的重组质粒作为定量标准品，稀释的浓度范围为10-10 拷贝/mL，样品定量结果以拷贝/mL表示。
37℃5min、94℃2min；94℃15s、60℃40s，45个循环.每次荧光定量检测均设空白对照。以
9 3
该DNA片段构建的重组质粒作为定量标准品，稀释的浓度范围为10-10 拷贝/mL，样品定量结果以拷贝/mL表示。
[0265] (10)统计分析见1.1.1.1项下。采用药物抑制浓度计算软件(LOGIT法)计算IC50。
[0266] 1.3.2结果
[0267] (1)抑制HBsAg和HBeAg产生/分泌
[0268] 蒿鳖养阴软坚方2，4，8mg/ml具有显著的抑制HBsAg和HBeAg产生/分泌的作用(P＜0.05，P＜0.01)，其0.125，0.5mg/ml亦有抑制HBsAg和HBeAg产生/分泌的作用，前者的作用强于拉米夫定各剂量组及多数剂量的药物血清组和正常对照血清(P＜0.05)。中剂量(2.59g/kg)药物血清400μl(加入1ml培养液中)亦有明显抑制HBsAg和HBeAg产生/分泌的作用(P＜0.05)，该作用强于拉米夫定多数剂量组及部分药物血清组(P＜0.05)。见表19。蒿鳖养阴软坚方对HBsAg的IC50为0.3876mg/ml，对HBeAg的IC50为0.5035mg/ml。
[0269] 表19蒿鳖养阴软坚方对HBsAg和HBeAg产生分泌的抑制作用
[0270]
[0271] 注：对HBsAg各组间比较，F＝53.950，P＝0.000，且方差不齐，每2组间比较用Games-Howell检验，复方4，8mg/ml与HepG2.2.2.15细胞对照比较，P＝0.006，0.020，与拉米夫定各剂量组、正常大鼠血清，低、中、高剂量的药物血清(200、400μl)比较，皆P＜0.05。中剂量药物血清400μl与拉米夫定各剂量组及低剂量药物血清组比较，皆P＜0.05。
[0272] 对HBeAg各组间比较，F＝55.822，P＝0.000，且方差不齐，每2组间比较用Games-Howell检验，复方2，4，8mg/ml与HepG2.2.2.15细胞对照拉米夫定各剂量组、正常血清和各剂量药物血清组比较，皆P＜0.05；复方0.125，0.5mg/ml与拉米夫定及药物血清的多数剂量组比较，亦P＜0.05；复方8mg/ml与其0.125，0.25，0.5，1mg/ml比较，皆P＜0.05。中剂量药物血清400μl和200μl与细胞对照，拉米夫定0.003125，0.00625，0.0125，0.05nM，0.1nM及多数低、中剂量药物血清比较，皆P＜0.05。中剂量药物血清
400μl与200μl比较，P＜0.05。
400μl与200μl比较，P＜0.05。
[0273] 与HepG2.2.2.15细胞对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
[0274] (2)降低HepG2 2.2.15细胞内、外的HBV-DNA和HBV-cccDNA水平
[0275] 与HepG2 2.2.15细胞对照组比较，上清液中HBV-DNA和HBV-cccDNA在蒿鳖养阴软坚方4mg/ml和2mg/ml组分别明显降低(P＜0.05)；细胞内HBV-DNA和HBV-cccDNA在蒿鳖养阴软坚方0.5，1，4mg/ml组和8mg/ml组分别明显降低(P＜0.05)。见表20。HBV-cccDNA的扩增曲线，见图33。
[0276] 表20蒿鳖养阴软坚方降低HepG2 2.2.15细胞内、外的HBV-DNA和HBV-cccDNA水平
[0277]
[0278] 注：皆作3复孔。HepG2 2.2.15培养上清液中HBV-DNA，各组间比较，F＝3.382，P＝0.000，由于部分组数据呈偏态分布，对其中的4，8mg/ml和HepG2 2.2.15三组间行非2
参数检验，χ ＝5.586，P＝0.018，其每2组间比较采用Mann-Whitney U检验，蒿鳖养阴软坚方4，8mg/ml组分别与细胞对照组比较，Z＝-1.993，-1.964，P＝0.046，0.050。HepG2
2.2.15细胞内HBV-DNA各组间比较，F＝1.544，P＝0.117，由于方差不齐，每2组间比较采用Games-Howell检验，蒿鳖养阴软坚方0.5，1，4mg/ml组分别与细胞对照组比较，P＝
0.014，0.015，0.038。HepG2 2.2.15培养上清液中HBV-cccDNA，各组间比较，F＝3.561，P＝0.009，且方差齐性，每2组间比较用Tukey HSD检验，蒿鳖养阴软坚方2mg/ml与细胞对照组比较，P＝0.015。HepG2 2.2.15细胞内HBV-cccDNA各组间比较，F＝2.675，P＝
0.049，且方差齐性，每2组间比较用Tukey HSD检验，蒿鳖养阴软坚方8mg/ml与细胞对照组比较，P＝0.035。与HepG2 2.2.15细胞对照组比较，*P＜0.05，$P＝0.05。
参数检验，χ ＝5.586，P＝0.018，其每2组间比较采用Mann-Whitney U检验，蒿鳖养阴软坚方4，8mg/ml组分别与细胞对照组比较，Z＝-1.993，-1.964，P＝0.046，0.050。HepG2
2.2.15细胞内HBV-DNA各组间比较，F＝1.544，P＝0.117，由于方差不齐，每2组间比较采用Games-Howell检验，蒿鳖养阴软坚方0.5，1，4mg/ml组分别与细胞对照组比较，P＝
0.014，0.015，0.038。HepG2 2.2.15培养上清液中HBV-cccDNA，各组间比较，F＝3.561，P＝0.009，且方差齐性，每2组间比较用Tukey HSD检验，蒿鳖养阴软坚方2mg/ml与细胞对照组比较，P＝0.015。HepG2 2.2.15细胞内HBV-cccDNA各组间比较，F＝2.675，P＝
0.049，且方差齐性，每2组间比较用Tukey HSD检验，蒿鳖养阴软坚方8mg/ml与细胞对照组比较，P＝0.035。与HepG2 2.2.15细胞对照组比较，*P＜0.05，$P＝0.05。
[0279] 1.3.3讨论与结论
[0280] (1)蒿鳖养阴软坚方(2，4，8mg/ml)具有显著地抑制HepG2 2.2.15细胞模型产生/分泌HbsAg和HBeAg的作用(P＜0.05，P＜0.05)。2.59g/kg灌胃大鼠所得药物血清400μl亦明显抑制HbsAg和HBeAg的产生/分泌(P＜0.05)。该作用强于拉米夫定(P＜0.05)。(2)蒿鳖养阴软坚方4，8mg/ml显著减少HepG2 2.2.15培养上清液中HBV-DNA，其2mg/ml明显降低上清液中HBV-cccDNA水平，其0.5，1，4mg/ml显著减少HepG2 2.2.15细胞内HBV-DNA，其8mg/ml明显减少HepG2 2.2.15细胞内HBV-cccDNA(P＜0.05)。
附图说明：
附图说明：
[0281] 图1正常大鼠肝组织石蜡切片，胶原染色，40倍；
[0282] 图2正常大鼠肝组织，HE染色，200倍
[0283] 图3BSA致大鼠肝纤维化短模组肝，胶原染色，40倍；
[0284] 图4BSA致大鼠肝纤维化短模组肝，HE染色，200倍；
[0285] 图5BSA致大鼠肝纤维化长模组肝，胶原染色，40倍；
[0286] 图6BSA致大鼠肝纤维化长模组肝，HE染色，200倍；
[0287] 图7蒿鳖养阴软坚方2.59g/kg对BSA肝纤维化治疗组肝，胶原染色，40倍；
[0288] 图8蒿鳖养阴软坚方2.59g/kg对BSA肝纤维化治疗组肝，HE染色，200倍；
[0289] 图9正常小鼠肝石蜡切片，胶原染色，100倍；
[0290] 图10正常小鼠肝石蜡切片，HE染色，200倍；
[0291] 图11血吸虫性肝纤维化短模组小鼠肝，胶原染色，100倍；
[0292] 图12血吸虫性肝纤维化短模组小鼠肝，HE染色，200倍；
[0293] 图13血吸虫性肝纤维化长模组小鼠肝，胶原染色，100倍；
[0294] 图14血吸虫性肝纤维化长模组小鼠肝，HE染色，200倍；
[0295] 图15蒿鳖养阴软坚方3.66g/kg对血吸虫病肝纤维化治疗组肝，胶原染色，100倍；
[0296] 图16蒿鳖养阴软坚方3.66g/kg对血吸虫病肝纤维化治疗组肝，HE染色，200倍；
[0297] 图17蒿鳖养阴软坚方对血吸虫病肝纤维化小鼠肝脏明胶酶谱的影响；
[0298] 图18正常对照组大鼠肝组织，Masson染色，75倍；
[0299] 图19CCl4模型组大鼠肝组织，Masson染色，75倍；
[0300] 图20CCl4肝纤维化大鼠用提取方案(1-1)8.2g/kg治疗组肝，Masson染色，75倍；
[0301] 图21CCl4肝纤维化大鼠用提取方案(3-2)2.59g/kg治疗组肝，Masson染色，75倍；
[0302] 图22CCl4复合因素致肝纤维化模型组大鼠肝，HE染色，40倍；
[0303] 图23CCl4复合因素致肝纤维化以8.2g/kg预防组肝，HE染色，40倍；
[0304] 图24酒精性肝病大鼠肝组织石蜡切片，HE染色，100倍；
[0305] 图25酒精性肝病大鼠肝组织，HE染色，200倍；
[0306] 图26蒿鳖养阴软坚方2.59g/kg对酒精性肝病大鼠预防组肝，HE染色，100倍；
[0307] 图27蒿鳖养阴软坚方2.59g/kg对酒精性肝病大鼠预防组肝，HE染色，200倍；
[0308] 图28Con A诱导肝纤维化小鼠肝组织石蜡切片，HE染色，40倍；
[0309] 图29Con A诱导肝纤维化小鼠肝组织，HE染色，200倍；
[0310] 图30蒿鳖养阴软坚方3.66g/kg对Con A诱导肝纤维化预防组肝，HE染色，40倍；
[0311] 图31蒿鳖养阴软坚方3.66g/kg对Con A诱导肝纤维化预防组肝，HE染色，200倍；
[0312] 图32HepG2 2.2.15细胞，加MTT(10μl，5mg/ml)孵育4h后，照相，100倍[0313] 图33实时荧光定量PCR中HBV-cccDNA的扩增曲线图。
具体实施方式
[0314] 下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明。但不以任何方式限制本发明，本发明实施例中的份数可以根据实际的需要加以选择为克或公斤。本发明的中药材青蒿(为菊科黄花蒿Artemisia annua L.的全草)、鳖甲(为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲)、生地(为玄参科多年生草本植物地黄Rehmanniaglutinosa Libosch.的根)、知母(为百合科知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的根茎)、丹参(为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的根)、虎杖(为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc。的根茎和根)、白花蛇舌草(为茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa Willd.的全草)、郁金(为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的块根)、泽兰(为唇形科植物毛叶地瓜儿苗Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel的全草)均有市售。
[0315] 实施例1
[0316] 青蒿25份、鳖甲15份、生地25份、知母25份、丹参35份、虎杖25份、白花蛇舌草30份、郁金25份、泽兰25份。先将鳖甲煎煮3小时，加入其他把八味药材(青蒿、知母、生地、丹参、虎杖、白花蛇舌草、郁金、泽兰)，8倍量水提取1次，每次1小时(正交1)，将药渣晾干，用60％乙醇6倍量提取2次，每次0.5小时。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0317] 实施例2
[0318] 青蒿40份、鳖甲55份、生地40份、知母40份、丹参55份、虎杖40份、白花蛇舌草55份、郁金40份、泽兰40份。将鳖甲、生地用10倍量水提取3次，每次1小时(最佳方案)，合并滤液。将虎杖、丹参等其他七味药材用80％乙醇提取，8倍量提取3次，每次2小时(最佳方案)，合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度，备用。
[0319] 实施例3
[0320] 青蒿6份、鳖甲15份、生地6份、知母6份、丹参15份、虎杖6份、白花蛇舌草15份、郁金6份、泽兰6份。取鳖甲加适量水煎煮2小时，加入其他八味药材，以6倍量水提取1小时，过滤，将药渣晾干，以6倍量60％乙醇提取2次，每次0.5小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩至适量，离心，取上清液过滤，滤液灌装。
[0321] 实施例4
[0322] 青蒿6份、鳖甲15份、生地10份、知母20份、丹参15份、虎杖20份、白花蛇舌草15份、郁金20份、泽兰20份。将鳖甲煎煮2小时后，加入其他八味药材，8倍量提取提取3次，每次1小时(最佳方案)，合并滤液，将药渣晾干，用40％乙醇6倍量提取1次，每次0.5小时(正交1)，回收乙醇，合并滤液，浓缩至相对密度为1.38的清膏，加入10％的蔗糖和糊精，制成颗粒，干燥，整粒，分包，即得。
[0323] 实施例5
[0324] 青蒿10份、鳖甲20份、生地10份、知母10份、丹参6份、虎杖6份、白花蛇舌草15份、郁金10份、泽兰20份。将鳖甲、生地用8倍量水提取3次，每次2小时，合并滤液，备用。将虎杖、丹参等其他七味药材用65％乙醇8倍量提取3次，每次1小时。合并滤液，回收乙醇，浓缩至适量。淀粉、糖粉等辅料粉碎、混合，取适量以水泛制丸心，过筛，选取一定粒度的丸心，反复喷撒浓缩液，泛制成丸，选丸，干燥即得。
[0325] 实施例6
[0326] 青蒿25份、鳖甲15份、生地25份、知母25份、丹参8份、虎杖20份、白花蛇舌草30份、郁金20份、泽兰20份。将鳖甲，生地用水8倍量提取一次，提取时间1小时。将虎杖，丹参等其它七味药材用50％的乙醇，6倍量提取1次，提取时间1小时。合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.40的清膏，加入适量蔗糖和糊精，制成颗粒，干燥，整粒，分包，即得。
[0327] 实施例7
[0328] 青蒿25份、鳖甲15份、生地25份、知母25份、丹参8份、虎杖20份、白花蛇舌草30份、郁金20份、泽兰20份。取鳖甲加6倍水煎煮2小时，加入其他八味药材，以6倍量水提取1小时，过滤，将药渣中的药液挤干，再以6倍量60％乙醇提取2次，每次0.5小时，合并滤液，回收乙醇，减压干燥成干浸膏，粉碎，加入10％淀粉，混匀后，装胶囊。
[0329] 实施例8
[0330] 青蒿15份、鳖甲15份、生地8份、知母8份、丹参8份、虎杖10份、白花蛇舌草30份、郁金20份、泽兰20份。取鳖甲加6倍水煎煮2小时，加入其他八味药材，以6倍量水提取1小时，过滤，将药渣中的药液挤干，以6倍量60％乙醇提取2次，每次0.5小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.40的清膏，加入10％淀粉，制成颗粒，干燥，整粒，加入0.5％硬脂酸镁，压片，包薄膜衣。瓶装或泡罩包装。
[0331] 实施例9
[0332] 青蒿10份、鳖甲15份、生地10份、知母8份、丹参9份、虎杖10份、白花蛇舌草20份、郁金20份、泽兰20份。取鳖甲加6倍水煎煮2小时，加入其他八味药材，以6倍量水提取1小时，过滤，将药渣中的药液挤干，以6倍量60％乙醇提取2次，每次0.5小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.38～1.40的清膏，加入20％淀粉，混合、干燥、粉碎成细粉，用水泛制成水丸或用蜜水泛制成水蜜丸，选丸，干燥即得。
[0333] 实施例10
[0334] 青蒿素0.01份、鳖甲25份、玄参20份、天花粉10份、赤芍15份、虎杖20份、白花蛇舌草30份、郁金15份、泽兰12份。先将鳖甲煎煮2小时，加入除青蒿素以外的其他七味药材，6倍量水提取1次，每次1小时(正交1)。将药渣晾干，用40％乙醇6倍量提取1次，每次0.5小时(正交1)，回收乙醇，合并滤液，浓缩，加入青蒿素，定容制成2000ml的汤剂，分2-3次/天服用。
[0335] 实施例11
[0336] 青蒿琥酯0.01份、龟板25份、生地25份、姜黄15份、红花10份、延胡索15份、半枝莲30份、郁金20份、八月札20份。取鳖甲加适量水煎煮2小时，加入除青蒿琥酯以外的其他七味药材，以6倍量水提取1小时，过滤，将药渣晾干，以6倍量60％乙醇提取2次，每次0.5小时，合并滤液，回收乙醇，浓缩至接近适量，加入青蒿琥酯，加入淀粉等辅料，制成颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，压片。
[0337] 实施例12
[0338] 青蒿50份、鳖甲75份、地黄70份、知母40份、丹参75份、虎杖75份、白花蛇舌草75份、郁金50份、泽兰50份。将鳖甲、生地用8倍量水提取3次，每次2小时(正交3)，合并滤液，备用。将虎杖、丹参等其他七味药材用65％乙醇8倍量提取3次，每次1小时(正交5)。合并滤液，回收乙醇，浓缩样品液，加入淀粉等辅料，制成颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，压片。
[0339] 实施例13
[0340] 银柴胡10份、鳖甲30份、水牛角10份、知母10份、丹参15份、虎杖20份、蒲公英20份、莪术20份、八月札20份。
[0341] 【制法】药材提取：按照上述处方量用70％重量的乙醇和水混合物回流提取2次，每次用2100ml乙醇和水的混合物提取1小时，滤液浓缩成浸膏，加250ml水，使浸膏成混悬液，再用醋酸乙酯和正丁醇分别萃取2次，每次250ml，萃取液过滤合并后浓缩至干成为精制提取物。取基质24.9g聚乙二醇6000、54.2g聚乙二醇4000、6.9g甘油置容器中，于水浴上加热到80℃，待全部熔融后，加入精制提取物21.5g，搅拌至溶解，均匀。将配制好的药液转移至贮液瓶中，密闭并保温在80℃，调节液滴定量阀门，滴入25℃的甲基硅油中，将形成的滴丸沥尽并擦除甲基硅油，经干燥，即得。