一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种人用二倍体细胞狂犬疫苗及其制备方法，包括人用二倍体细胞的培养扩增，在人用二倍体细胞上培养狂犬病毒，其中狂犬疫苗还包括收获病毒，病毒灭活，浓缩和纯化等步骤。这种狂犬疫苗由于使用健康的人源二倍体细胞制备，不含任何外源污染因子和致瘤性，经纯化处理后疫苗纯度高，具有免疫效果好、安全性高的优点，本发明所述人用二倍体细胞狂犬疫苗的制备方法是适合大规模工业化生产且可满足国内外市场对狂犬疫苗需求的制备方法。

权利要求

1.一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗，其特征在于：该疫苗在制备过程中是在人用二倍体细胞上接种培养PM狂犬病毒株，经灭活纯化得到的狂犬疫苗，所述的人用二倍体细胞是IMR-90。

2.一种人用二倍体细胞人用狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)人用二倍体细胞的复苏、培养及扩增；所述的人用二倍体细胞是IMR-90；

(2)在人用二倍体细胞上接种PM毒株，所述的人用二倍体细胞是IMR-90；

(3)收获病毒液；

(4)澄清超滤浓缩；

(5)病毒液灭活、纯化；

(6)稀释分装并加入保护剂后冻干制成纯化疫苗。

3.根据权利要求2所述的人用二倍体细胞人用狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)中人二倍体细胞的培养方式为采用细胞工厂培养或微载体反应器培养。

4.根据权利要求3所述的人用二倍体细胞人用狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)所使用的细胞培养液为199培养液或MEM培养液，且该细胞培养液中含牛血清的体积分数比为15％-20％、庆大霉素或卡那霉素24-32U/ml，并调PH至8.0-9.2，其培养温度为39-41℃。

5.根据权利要求2或3或4所述的人用二倍体细胞人用狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)要求收获病毒液的病毒滴度不低于8.0LgLD50/ml。

6.根据权利要求5所述的人用二倍体细胞人用狂犬灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)纯化通过Sepharose 4FF柱层析法或高速区带离心来实现。

说明书

一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体地是涉及人用狂犬灭活疫苗，特别是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒毒种得到的狂犬病灭活纯化疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 狂犬病是一种由狂犬病毒引起的人兽共患病，该病是以侵犯中枢神经系统为主的急性传染病，一旦发病，死亡率高达100％。尽管这是一个古老的疾病，但人类至今仍然无法消灭它，在我国曾一度得到有效控制，但近年来狂犬病疫情快速回升，研制并推广使用安全高效的人用狂犬病疫苗是控制狂犬病疫情的有效手段。

[0003] 1885年法国科学家巴斯德首次将狂犬病病毒在兔脑连续传代和干燥减毒而制成的疫苗，奇迹般的救治了一名被疯狼严重咬伤的9岁小孩，开辟了人用狂犬病疫苗的新纪元。100多年以来，特别是近二三十年现代细胞培养技术和分子生物学的发展，狂犬病疫苗取得了重大进展。

[0004] 目前世界上大量生产的狂犬疫苗有四种：第一种以法国为代表的Vero细胞为培养狂犬病毒，制备冻干灭活疫苗，但不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的残余DNA。第二种和第三种以中国为代表的地鼠肾和日本的鸡胚、鸭胚这几种疫苗细胞来源于普通动物，无法保证细胞不携带外源因子也不能保证细胞基质的致瘤性和细胞的残余DNA。第四种以美国为代表的二倍体细胞，经过浓缩超离制备的狂犬疫苗；

[0005] 人二倍体细胞疫苗(HDCV)是在人用二倍体细胞上培养狂犬病毒，经澄清、加热和β-丙内酯灭活、冻干制备而成。该疫苗在1974年首次获准生产，1978年开始商品化。该疫苗不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质，因而可以解释它在重复注射后较好的耐受。采用NIH法检测疫苗的稳定性证实，疫苗在4℃和37℃放置1个月后，无明显差异。进一步将5批效价4.3-5.6的疫苗4℃存放3年半，所有批号效价均大于2.5IU/剂。

[0006] 该疫苗已在欧洲、北美以及世界各国应用二十年，证实是安全且高效的。早期调查研究发现，HDCV预防接种后1月或3月达到抗体峰值(10IU左右)，随后逐渐降低，但1-2年内滴度始终大于0.5IU。通过1-3年内加强免疫后，抗体滴度迅速增加10-15倍，肌肉注射和皮下注射途径相近。人二倍体细胞(HDC)为正常核型，无致癌性，具有高免疫原性和良好的耐受性。在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和HDCV相比。

[0007] 本发明经过研究，利用细胞工厂和微载体在这些人用二倍体细胞WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5、2BS上培养狂犬病毒，所制备的疫苗价格低廉，安全性高，免疫效果好，使用方便，纯度高，适合大规模化生产和应用。

发明内容

[0008] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高的人用二倍体细胞狂犬病毒灭活纯化疫苗。

[0009] 本发明的另一个目的是提供了一种适合大规模工业化生产且可满足国内外市场对狂犬疫苗需求的人用二倍体细胞狂犬疫苗的制备方法。

[0010] 为实现上述第一个目的，本发明的技术方案是该疫苗在制备过程中是在人用二倍体细胞上接种培养PM狂犬病毒株，经灭活纯化得到的狂犬疫苗，所述的人用二倍体细胞是WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5、2BS。公知，源于人体组织的人用二倍体细胞来源清楚，包括捐献者的年龄、性别、种族、地域、体能及健康状况、细胞直接来源的组织或器官、细胞世代数等。人用二倍体细胞系经过数十年研究，其生长特性、遗传稳定的特性、外源因子(细菌、真菌、支原体及病毒)污染检查、致肿瘤阴性等特征被充分验证。更为重要的是人用二倍体细胞本身源于人体细胞，当用于疫苗制造时人用二倍体细胞的残余成分不会成为超敏反应原，基本不会引起接种者超敏反应。因此，从质量控制以及安全性角度看，相较于鼠脑组织、原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞和Vero细胞系等外源细胞系，人用二倍体细胞没有潜在的不安全隐患，是制备疫苗理想的细胞系。本发明采用人用二倍体细胞作为疫苗制备的病毒培养所用的细胞系，显著的提高现行狂犬病毒疫苗的质量和安全性，有利于质量控制。

[0011] 为实现上述第二个目的，本发明的技术方案是

[0012] (1)人用二倍体细胞的复苏、培养及扩增；

[0013] (2)在人用二倍体细胞上接种PM毒株；

[0014] (3)收获病毒液；

[0015] (4)澄清超滤浓缩；

[0016] (5)病毒液灭活、纯化；

[0017] (6)稀释分装并加入保护剂后冻干制成纯化疫苗。

[0018] 进一步设置是所述的人用二倍体细胞是WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5、2BS。首先建立人用二倍体细胞主种子库和工作库，并对细胞库细胞进行系统检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，使细胞量达到生产需要。细胞复苏。本发明中在生长成片的人用二倍体细胞上接种狂犬病毒，狂犬病毒在人用二倍体细胞上的生长繁殖可维持较长时间，因此病毒收获可采取多次收取方式。

[0019] 进一步设置是所述的步骤(1)所使用的细胞培养液为199培养液或MEM培养液，且该细胞培养液中含牛血清的体积分数比为15％-20％、庆大霉素或卡那霉素24-32U/ml，并调PH至8.0-9.2，其培养温度为39-41℃。本设置，可以使用碳酸氢钠调细胞培养液PH到8.0～8.8之间，同时在细胞培养液中加入适量庆大霉素，以防止细菌污染。

[0020] 进一步设置是所述的步骤(3)要求收获病毒液的病毒滴度不低于8.0LgLD50/ml，本设置保证疫苗效力。

[0021] 进一步设置是所述步骤(5)疫苗的纯化通过Sepharose4FF柱层析法或高速区带离心来实现。

[0022] 进一步设置是步骤(1)中人二倍体细胞的培养方式为采用细胞工厂培养或微载体反应器培养。由于本发明中人用二倍体细胞为附着依赖性细胞，细胞在培养过程需附着一定载体生长，则本发明中细胞的培养方式可以采用细胞工厂培养，也可以使用微载体反应器培养。人用二倍体细胞在微载体反应器中培养时，微载体使用量为22～27g/L，转速为55-120转/分钟。

[0023] 本发明利用细胞工厂和微载体在这些人用二倍体细胞WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5、2BS上培养狂犬病毒，所制备的疫苗价格低廉，安全性高，免疫效果好，使用方便，纯度高，适合大规模化生产和应用。

[0024] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步介绍。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

[0026] 【实施例1】

[0027] 使用复苏的人用二倍体细胞WI-38，细胞营养液为MEM培养液，其中含有15％-20％小牛血清和24-32u/ml的庆大霉素，调PH至8.0-9.2，经过10天后，细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.0-7.4的欧式平衡盐液冲洗细胞面，再用吸附法接种狂犬病毒PM株。所使用的PM株工作毒种，毒种用少量细胞维持液即含2％(w/w)人白蛋白的MEM液稀释，其PH为8.4-8.6。31℃-35℃下吸附30分钟后，再补加适量细胞维持液继续在37℃-40℃下培养。收获病毒液取样进行病毒滴度和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到8.0LgLD50/ml以上。收获的合格病毒液分装至冻存管，1ml/管，液氮保存备用。

[0028] 【实施例2】

[0029] 取体重11-13g清洁级昆明种小鼠，按本发明方法制备的人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗(HDCV)与市售原代地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)、纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)和传代Vero细胞狂犬病疫苗进行小鼠腹腔注射免疫2次，每次0.5ml，间隔7天。首次免疫后14天分别按5-100LD50脑内攻击CVS病毒液0.03ml；同时以稀释液脑内注射0.03ml攻击的病毒感染量于相同体重健康小鼠脑内接种，测定病毒滴度(LD50)，攻击后小鼠观察14天，根据动物死亡数计算保护力。

[0030] 表1不同疫苗免疫小鼠对腹腔攻击的保护效果

[0031]

[0032] 注：存活动物数/试验动物数

[0033] 从表1可看出，以腹腔途径免疫后，HDCV能够使小鼠对CVS株获得完全保护，而PHKCV、PCECV、Vero细胞灭活疫苗对CVS株的保护率为80％～90％，经统计学处理有显著性差异(P＜0.001)。试验结果初步表明，按本发明方法制备的人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗(HDCV)的保护效力等同或略高于其他方法生产的狂犬疫苗。

[0034] 狂犬疫苗免疫原性及副反应观察

[0035] 18-60岁之间，无犬、猫等动物咬伤及抓伤史，无狂犬病疫苗与抗狂犬病血清使用