一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白

摘要

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白的制备。该融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。该融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。本发明为炭疽抗毒素和疫苗的制备与应用创造了新的生物材料。

权利要求

1.一种融合蛋白的编码基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.一种融合蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

3.权利要求1所述的融合蛋白的编码基因在制备炭疽抗毒素和炭疽疫苗中的应用。

4.权利要求2所述的融合蛋白在制备炭疽抗毒素和炭疽疫苗中的应用。

说明书

一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白的制备。

[0002] 发明背景

[0003] 炭疽病(Anthrax)是由革兰氏阳性的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的人、家畜和野生动物共患的一种急性、热性、败血性传染病，在农牧业上造成巨大的经济损失。此外，炭疽杆菌产生的芽胞具有很强的耐高温，抗消毒剂，抗辐射，不易清除的特性。这一特点使得炭疽杆菌成为传统生物武器和生物恐怖袭击的首先材料。因此，世界各国尤其是欧美发达国家近几年都加速了炭疽药物或者疫苗的开发。

[0004] 炭疽病的致病因子主要包括由内生质粒pOX-1编码的细菌荚膜和由质粒pOX-2编码的外毒素。前者的组成为带负电荷的多聚D谷氨酸，它能够抵御吞噬细胞的吞噬作用以及血清中的阳离子的降解，从而使菌体细胞能够在体能大量繁殖。后者是炭疽芽胞杆菌主要的致病因子，由保护性抗原(PA，83KDa)，致死因子(LF，90KDa)和水肿因子构成(EF，89KDa)构成的AB型外毒素。A PA主要作用是与细胞表面特定的受体结合，并转运LF和EF进入细胞。LF是有776个氨基酸残基构成的锌离子依赖型的金属蛋白酶，能够特异性结合并且切割有丝分裂蛋白激激酶家族(MAPPK)的N端，如MEK1，MEK2，MKK3，MKK4，MKK6，和MKK7。MAPKK的切割进一步阻断了包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和JNK等细胞信号转导途径，进而导致细胞裂解(Duesbery and Vande Woude 1999；Vitale，Blanset et al.2006)。EF是由767个氨基酸组成的一种依赖与钙离子的腺苷酸环化酶，能够催化细胞内的ATP转化为cAMP(Collier and Young 2003)，使得细胞内外水份失衡进而导致水肿。
在致病时，炭疽毒素的单一成分不能发挥作用，水肿因子或致死因子必须与保护性抗原结合成水肿毒素(EF+PA，EdTx)或致死毒素(LF+PA，LeTx)才具有致病作用。炭疽毒素致病的过程为：保护性抗原与细胞表面的受体肿瘤内皮标志物8(TEM-8)或毛细管形态生成蛋白
2(CMG-2)结合(Bradley，Mogridge et al.2001；Scobie，Rainey et al.2003)后，被细胞表面弗林类酶特异性地切割后释放出氨基酸20千道尔顿(PA20)的多肽片段，剩下的结合于受体的63千道尔顿(PA63)形成一个七聚体，该七聚体自发地结合LF或EF或同时结合LF和EF，形成一个多聚体复合物。该复合物在细胞表面辅助受体LPR6的协助下，内吞入胞内。内吞体在胞内酸性环境的诱导下，PA63发生构象重排，插入到内吞体膜中，形成一个通道。此时，结合于七聚体的EF或者LF在离子梯度和跨膜正电势差的作用下被拉入孔道，进入受体细胞，进而发挥致病作用(Young and Collier 2007)。

[0005] 目前针对炭疽病治疗的药物主要是抗生素和保护性抗原特异性的抗血清。前者主要包括青霉素，四环素，链霉素，脱氧土霉素，乙酰红霉素，环丙沙星等，后者主要是来源于志愿者的血清。这些传统的药物和治疗手段存在诸多的缺陷：第一抗生素治疗只能杀掉体内感染的炭疽芽胞杆菌菌体，而对于存在巨大潜在危害的芽胞却无能力；第二，对于感染后期的人，因大量的外毒素已经分泌到血液中，抗生素并不能将其清除；第三，因为目前大量的抗生素的使用导致病原菌都出现了很强的耐药性；第四，对于治疗炭疽病，这些抗生素都需要很大的剂量，并不适用于那些对抗生素过敏的特殊人群。而抗血清治疗虽然能够清除分泌到血液中的炭疽外毒素，但也存在譬如血清来源有限，患者注射后出现过敏反应等诸多问题。因此开发新型高效安全的炭疽病治疗药物已成为全球面临的挑战和各个国家研究的热点(Baillie 2006)。

[0006] 接种炭疽疫苗是预防炭疽芽胞杆菌感染的主要手段。目前人用的炭疽疫苗主要是以PA为主要成份的疫苗。其主要制备方法是从无荚膜的炭疽杆菌V2770NP1R菌株培养的上清液中提取，然后与Al(OH)3佐剂混合形成的制剂。该疫苗的主要免疫原是PA，但因其从炭疽杆菌的发酵液中提取，操作过程可能会残留一些未除尽的致死因子和水肿因子，这些大大的降低了传统疫苗的安全性。同时，这种疫苗因其主要成份是活性的PA，若给已感染炭疽杆菌的人接种这种疫苗，其中的PA同样可以参与LF或EF的运输，进而增强炭疽毒素的致病作用。此外，传统的PA疫苗主要产生抗PA抗体，而不产生中和LF或者EF的抗体。因此，我们亟待开发重组的，无活性的且能够刺激机体同时产生抗PA，抗LF或EF的新的炭疽疫苗。

发明内容

[0007] 本发明的目的是构建一种新型的融合基因并利用此基因表达一种可用于炭疽病预防和抗毒素治疗的蛋白。发明的主要技术路线如图1所示，首先利用重叠延伸PCR技术将炭疽芽胞杆菌致死因子LF的结合功能域LFn编码区和具有显性抑制功能的保护性抗原的突变体DPA(PA含有427F→D点突变)的编码区融合后插入到表达载体pGEX-6p-1，形成重组载体pGEX-LFn-DPA。将该载体转入大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中，利用IPTG诱导后发现目标蛋白主要以可溶的形式表达。我们进一步纯化了融合蛋白LFn-DPA，并在体内和体外评估了该融合蛋白作为一种更安全的抗毒素和疫苗的潜力。体外抗毒素分析表明，LFn-DPA能够同时抑制LF和EF对细胞的毒性。体内小鼠保护分析表明，当该融合蛋白LFn-DPA与PA的比例为1∶8时，能够完全抵抗5倍的半致死量的LeTx对小鼠的攻击。表明该融合蛋白可作为一种新型抗炭疽毒素制剂。此外该无活性的融合蛋白免疫小鼠后能够刺激小鼠产生抗炭疽外毒素PA，LF，EF三种抗体，且与PA相比，LFn-DPA能够刺激机体产生更强的抗PA的免疫反应。综上，该融合蛋白可以作为一种抗毒素制剂和炭疽疫苗。

附图说明

[0008] 序列表SEQ ID NO：1是本发明制备融合蛋白的核苷酸序列；

[0009] 图1：是本发明的技术路线示意图；

[0010] 图2：是本发明所用的质粒图谱；其中图2-A：是质粒pGEX-6p-1的图谱；图2-B：是质粒pGEX-KG-PAF427D的图谱；图2-C：是质粒pGEX-6p-LF的图谱；

[0011] 图3：是质粒pGEX-LFn-DPA的构建流程与图谱；

[0012] 图4：是LFn-DPA蛋白示意图；

[0013] 图5：是LFn-DPA蛋白的表达与纯化分析；

[0014] 图6：是LFn-DPA蛋白的活性分析；

[0015] 图7：是LFn-DPA蛋白体外抗致死毒素活性分析；

[0016] 图8：是LFn-DPA蛋白体外抗水肿毒素活性分析；

[0017] 图9：是抗体滴度检测；图中：A.抗PA抗体滴度；B.抗LF抗体滴度；C.抗EF抗体滴度；D.抗PA抗体亚型；E.抗LF抗体亚型；F.抗EF抗体亚型。

具体实施方式

[0018] 实施例1融合体的构建与相关蛋白的制备

[0019] 本发明中所用到的生化试剂或生物材料样品除作特殊说明外，均购自Sigma公司。

[0020] 本发明所用到的质粒pGEX-6p-1(见图2-A)购自GEHealthcare公司；质粒pGEX-6p-LF(见图2-C)，pGEX-KG-PAF427D(见图2-B，参考文献：Cao等.2008，Cao等，2009)。

[0021] 本发明利用重叠延伸PCR技术构建融合体LFn-DPA(如图3所示)。

[0022] 制备方法如下：

[0023] (1)采用PCR扩增LFn DNA片段。引物序列如下：

[0024] LF-5’，5’---GCGGATCCGCGGGCGGTCATGGTGATGT---3’(包含BamH I位点，下划线标示)；

[0025] LFn-3’，5’--- AGGAGAACC---3’(包含GTCGAC接头，下划线标示，重叠区用方框标示)；

[0026] 上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。以质粒pGEX-6p-LF为模版，按照如下的反应体系和反应条件扩增LF的结合功能域LFn。

[0027] PCR体系如下：

[0028] 10×PCR缓冲液(北京全式金公司) 10μL

[0029] dNTP(10mM) 1μL

[0030] 模板 1μL

[0031] 引物LF-5’(10μM) 1μL

[0032] 引物LFn-3’(10μM) 1μL

[0033] Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司) 1μL

[0034] 去离子水(ddH2O) 35μL

[0035] PCR条件：95℃预变性2min；95℃、20s，55℃、20s；72℃、30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃、5min。

[0036] (2)用PCR扩增DPA DNA片段。引物序列如下：

[0037] PA-5’，5’--- TTTCTTGTTC---3’(含GTCGAC接头，下划线标示，重叠区用方框标示)；

[0038] PA-3’，5’---ACCGCTCGAGTTATCCTATCTCATAGCC---3’(包含Xho I位点，用下划线标示)。

[0039] 上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。以质粒pGEX-KG-DPA为模版，按照如下的反应体系和反应条件扩增DPA编码区。

[0040] PCR体系如下：

[0041] 10×PCR缓冲液(北京全式金公司) 10μL

[0042] dNTP(10mM) 1μL

[0043] 模板 1μL

[0044] 引物PA-5’(10μM) 1μL

[0045] 引物PA-3’(10μM) 1μL

[0046] Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司) 1μL

[0047] 去离子水(ddH2O) 35μL

[0048] PCR条件：95℃预变性2min；95℃、20s，55℃、30s；72℃、1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃、5min。

[0049] (3)将步骤(1)和(2)中扩增的片段用试剂盒(商品名称：QIAquick GEL ExtractionKit，购自德国Qiagen公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化。将纯化的LFn和DPA片段用重叠延伸PCR拼接。具体PCR体系和扩增条件为：

[0050] 10×PCR缓冲液(北京全式金公司) 10μL

[0051] dNTP(10mM) 1μL

[0052] LFn 2μL

[0053] PA 2μL

[0054] 引物PA-5’(10μM) 1μL

[0055] 引物PA-3’(10μM) 1μL

[0056] Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司) 1μL

[0057] 去离子水(ddH2O) 32μL

[0058] PCR条件：95℃预变性2min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、1.5min，30个循环；72℃延伸8min，4℃、5min。

[0059] (4)将步骤(3)中扩增的DNA片段纯化后克隆到载体pGEX-6p-1，形成pGEX-LFn-DPA。

[0060] 具体操作为：纯化的LFn-DPA用限制性内切酶Bam HI-Xho I(购自TAKARA公司)酶切，酶切反应体系为：酶解缓冲液，5μL；BamHI，，2μL；Xho I，2μL；PCR产物，41μL。

[0061] 混匀后置于37℃保温6小时。质粒载体pGEX-6p-1酶解体系和条件同上一致。利用试剂盒(商品名称：QIAquick GEL Extraction Kit，购自德国Qiagen公司)纯化酶切后的载体片段和基因片段，并将二者用连接酶连接。

[0062] 连接体系：

[0063] 10X连接酶缓冲液 1μL

[0064] 双酶切的PCR产物 6μL

[0065] 双酶切的载体 2μL

[0066] T4DNA连接酶(购自TAKARA公司) 1μL

[0067] 混匀后，16℃保温过夜，然后将连接混合物与100L大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800μL LB培养基(其中1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，pH7.0)，37℃保温45min，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素固体LB平皿，37℃保温14小时，挑取转化子并且抽提质粒，将又插入片段的质粒送交购自上海生工生物工程技术有限责任公司测序验证，将获得的含有融合基因LFn-DPA的质粒命名为pGEX-LFn-DPA。该质粒于2009年11月16日送交位于湖北省武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏名称为大肠杆DH5α/pGEX-LFn-DPA，其保藏号为CCTCC NO：M 209270。

[0068] (3)蛋白的表达、纯化与分析

[0069] (1)重组蛋白的表达

[0070] 将重组质粒pGEX-LFn-DPA转化到表达宿主细胞E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(购自GE Healthcare公司，操作参照实施例1中的转化步骤)。将过夜活化的转化子以体积比为1％的接种量转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使OD600达到0.8，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，18℃200转/分钟培养
6小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(pH 7.4，140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)洗涤一次，再用50mL PBS悬浮，然后用高压细胞破碎仪破碎细胞(购自美国THERMO公司)。细胞破碎液于4℃、12000转/分钟离心30分钟，分离上清和沉淀并用SDS-PAGE检测目标蛋白的表达定位(见图5)。

[0071] (2)蛋白的纯化

[0072] 利用亲和层析纯化重组LFn-DPA。具体操作步骤如下(所有操作均在4℃下进行)：首先用Gutathione(GSH)-Sepharose(购自GE Healthcare公司)亲和柱纯化蛋白，用缓冲液PBS平衡柱，样品1mL/min上样。用150mLPBS洗涤杂蛋白，然后用PreScission蛋白酶(购自GE Healthcare公司)4℃酶解16小时后，收集目的蛋白。含有LFn-DPA的洗脱液用Millipore50-kDa cut-off Ultra-4Centrifugal Filter Units(购自美国Millipore公司)浓缩并置换缓冲液，进一步用Mono Q Sepharose column(购自GE Healthcare公司)进行精纯。获得的PA蛋白分装后置-80℃保存备用，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定纯度(见图5)。

[0073] (3)所用的保护性抗原蛋白(PA)，致死因子蛋白(LF)参见考文献：Cao，S.，A.Guo，etal，Investigation of New Dominant Negative Inhibitors of Anthrax Protective AntigenMutants for use in Therapy and Vaccination，Infect Immun.和Cao，S.，Z.Liu，etal，Efficient production and characterization of Bacillus anthracis lethal factorand a novel inactive mutant rLFm-Y236F，Protein Expr Purif 59(1)：25-30。水肿因子蛋白(EF)的制备方法同上述致死因子蛋白(LF)的制备方法。

[0074] (4)纯化蛋白的检测和定量

[0075] 蛋白的检测均使用12％的SDS-PAGE分析。配方如下：

[0076] 浓缩胶浓度为5％：

[0077] H2O 1.4mL

[0078] 30％Acr-Bis(29∶1) 0.33mL

[0079] 1M Tris-HCL，pH8.8 0.25mL

[0080] 10％SDS 0.02mL

[0081] 10％过硫酸铵 0.02mL

[0082] TEMED 0.002mL

[0083] 分离胶浓度为 12％：

[0084] H2O 1.6mL

[0085] 30％Acr-Bis(29∶1) 2mL

[0086] 1M Tris-HCL，pH8.8 1.3mL

[0087] 10％SDS 0.05mL

[0088] 10％过硫酸铵 0.05mL

[0089] TEMED 0.002mL

[0090] 检测方法：取10μL纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2×)，沸水浴5-10min，然后上样10μL。LFn-DPA的纯化结果见图2.

[0091] (5)蛋白浓度的测定

[0092] 蛋白质的定量均使用Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，按照试剂盒的说明书操作)。具体步骤如下：

[0093] 1)取4μL蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限公司)加PBS稀释至100μL，使终浓度为200μg/mL；

[0094] 2)取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15μL分别加到96孔板中，加PBS补足到20μL，每孔蛋白含量分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3μg，每个梯度重复3次；

[0095] 3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μL，重复3次；

[0096] 4)各孔加入200μL Bradford Reagent，混匀，室温放置5min；

[0097] 5)用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定A595读数；

[0098] 6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

[0099] 实施例2融合蛋白抗毒素活性分析

[0100] (1)细胞培养与细胞毒性检测

[0101] 小鼠的单核细胞系RAW264.7(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)用含10％胎牛血清(购自杭州四季青公司)的无酚红DMEM高糖(美国Promega公司)培养液(含50U/mL青霉素和50μg/mL庆大霉素)在37℃，含5％CO2，95％空气的培养箱(日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液消化细胞后接种于4
96孔培养板(购自CORNING公司)，待细胞长密度长至每孔1.5×10 个细胞时，吸弃培养液，再加入100μL含有待检测样品的新鲜培养液，继续培养三小时，然后每孔加入荧光染TM
料ALamarBLue (AbDSerotec)10μL，将培养板用铝箔包裹后置于培养箱中继续培养4h。采用酶标仪(BioTek，USA)在读取每孔的荧光值。读数参数为：激发光530nm，发射光590nm。
细胞相对活性按照如下公式计算：

[0102]

[0103] 说明：对照孔为致死毒素(各1.0μg)处理孔；活细胞孔为不加毒素孔。

[0104] (2)融合蛋白的活性分析

[0105] 浓 度 分 别 为 1.25nM，2.5nM，5.0nM，10nM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM 的LFn-DPA与含有50nM LF的DMEM培养基混匀后，作用于RAW264.7细胞，分析LFn-DPA活性，并设同样浓度的PA作为对照，按照实施例3所述检测细胞活性，结果见图6所示，融合蛋白完全丧失活性。

[0106] (3)体外抗致死毒素(LeTx)活性分析

[0107] PA与LF结合称为致死毒素(lethal toxin，LeTx)，在体外可导致敏感细胞(如小4
鼠巨噬细胞RAW264.7)的死亡。实验前16小时，将RAW264.7以3×10 个/孔接种于96孔培养板中，细胞长至80％满时，吸弃96孔板中培养基加入新鲜的含有固定浓度的LeTx(20nM PA和5nM LF)和不同浓度的LFn-DPA(0nM，0.125nM，0.25nM，0.5nM，1.0nM，2.0nM，4.0nM，
8.0nM，16.0nM)，同时设不加LFn-DPA的细胞孔做对照。细胞活性按照实施例3所述检测，并利用软件GraphPad Prism 5中的非线性拟合计算半抑制量IC50，结果如图7所示，LFn-DPA能够抑制致死毒素对细胞的毒性，保护细胞存活。

[0108] (4)体外抗致水肿毒素活性分析

[0109] 中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)培养用含有10％新生牛血清，50U/mL青霉素和50μg/mL庆大霉素的DMEM/F12(1∶1)细胞培养基(购自Hyclone公司)，在37℃，含5％CO2，95％空气的培养箱(日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液消化细胞后接种于96孔培养板(CORNING公司)，待细胞长密度长至每孔80％满时，加入100μL含有固定浓度的EdTx(20nM PA和5nMEF)和梯度浓度LFn-DPA(浓度依次为：0.625nM，1.25nM，2.5nM，5.0nM，10.0nM，20.0nM)，37℃培养2h后，细胞内的环腺苷酸的浓度利用Cyclic AMP Assay Kit进行检测(购自R&D Systems公司)，单独用EdTx(20nM PA和5nM EF)和不处理的细胞分别用来做正对照和负对照，检测结果如图8，表明LFn-DPA能够抑制EdTx对敏感细胞的毒性作用。

[0110] (5)体内检测LFn-DPA抗毒素活性

[0111] 取5-6周龄雌性BALB/c小鼠52只(购自湖北省疾病预防与控制中心)，平均分为7组，4只/组。其中分别将0.72nM，0.36nM，0.18nM，0.09nM，0.045nM的LFn-DPA与0.27nM LF+0.72nM PA混合后尾静脉注射五组小鼠。同时设两组对照：一组小鼠单独注射200μl PBS，另一组注射27nM LF+0.72nM PA。小鼠在48h内的症状以及存活率被观察并记录。如表格1，当LFn-DPA与PA的比例大于1/8时，小鼠完全被保护。

[0112] 表1LFn-DPA体内抗毒素活性分析

[0113]

[0114] 实施例3动物免疫保护分析

[0115] (1)动物免疫

[0116] 取6-8周龄雌性BALB/c鼠24只(购自湖北省疾病预防与控制中心)，平均分为3组，每组8只分为PA免疫组，LFn-DPA免疫组及1组PBS对照组。分别将50μL含20μg的重组蛋白PA，LFn-DPA与等体积的0.18mg的AL(OH)3混合后腹腔免疫小鼠。对照组是将
50μL PBS与等体积的AL(OH)3混合后腹腔注射小鼠。分别于1，3，5周免疫小鼠，，第0，2，
4，6周断尾采血。将收集的免疫小鼠血液分离血清后于-20℃冻存，用于抗体的检测。

[0117] (2)特异性IgG及IgG亚型滴度的检测

[0118] 使用实施例1中纯化的PA，LF，EF蛋白各1μg/100μL于4℃过夜包被酶联板，加5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，用洗涤液洗板3次后加入待检小鼠血清，待检血清用洗涤液倍比稀释，第一孔按1∶100稀释，加入100μL/孔。37℃反应30min。洗板3次后加入1∶5,000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(购自SouthernBiotech，USA)，37℃反应30min。洗板5次后加入100μL底物液(该底物液含1mg/mL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和
0.03％H2O2)，避光显色10min后，于630nm读数。取免疫后OD值/免疫前OD值＞2的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度，抗体滴度用以10为低的对数表示。

[0119] 进一步检测IgG亚类IgG1和IgG2a抗体滴度的检测方法同IgG抗体滴度的检测，只是加入二抗时加入HRP-IgG1或HRP-IgG2a(结果如图9)。如图9所示，LFn-DPA免疫小鼠后能够刺激产生抗PA，LF，EF，的抗体，相对于PA免疫组，LFn-DPA能够诱导小鼠产生更高的抗PA的抗体滴度。此外，还发现LFn-DPA诱导小鼠产生的主要是IgG1和IgG2a亚型的抗体，且以IgG1为主。

[0120] (3)免疫小鼠攻毒实验

[0121] 第三次免疫后一周对实施例3中三组免疫后的小鼠进行攻毒试验。具体方法是对每只小鼠通过尾静脉注射炭疽致死毒素(25μg LF+60μgPA，即本发明制备的PA)，观察PA和LFn-DPA对小鼠的免疫保护力。经LFn-DPA m免疫后的小鼠能够完全抵抗炭疽致死毒素的攻击，而对照即未免疫的小鼠全部死亡(结果见表2)。

[0122] 表2LFn-DPA免疫保护能力分析；

[0123]

[0124] 参考文献

[0125] 1、Baillie，L.W.Past，imminent and future human medical countermeasures for anthrax.J Appl Microbiol，2006，101(3)：594-606.

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[0142] <170>PatentIn version 3.1

[0143] <210>1

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[0145] <212>DNA

[0146] <213>人工序列

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[0153] <222>(1)..(2976)

[0154] <223>

[0155] <400>1

[0156] gcg ggc ggt cat ggt gat gta ggt atg cac gta aaa gag aaa gag aaa 48[0157] Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu Lys[0158] 1 5 10 15[0159] aat aaa gat gag aat aag aga aaa gat gaa gaa cga aat aaa aca cag 96[0160] Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Thr Gln[0161] 20 25 30

[0162] gaa gag cat tta aag gaa atc atg aaa cac att gta aaa ata gaa gta 144[0163] Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys Ile Glu Val[0164] 35 40 45

[0165] aaa ggg gag gaa gct gtt aaa aaa gag gca gca gaa aag cta ctt gag 192[0166] Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu Lys Leu Leu Glu[0167] 50 55 60

[0168] aaa gta cca tct gat gtt tta gag atg tat aaa gca att gga gga aag 240[0169] Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys Ala Ile Gly Gly Lys[0170] 65 70 75 80[0171] ata tat att gtg gat ggt gat att aca aaa cat ata tct tta gaa gca 288[0172] Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys His Ile Ser Leu Glu Ala[0173] 85 90 95[0174] tta tct gaa gat aag aaa aaa ata aaa gac att tat ggg aaa gat gct 336[0175] Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala[0176] 100 105 110

[0177] tta tta cat gaa cat tat gta tat gca aaa gaa gga tat gaa ccc gta 384[0178] Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro Val[0179] 115 120 125

[0180] ctt gta atc caa tct tcg gaa gat tat gta gaa aat act gaa aag gca 432[0181] Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys Ala[0182] 130 135 140

[0183] ctg aac gtt tat tat gaa ata ggt aag ata tta tca agg gat att tta 480[0184] Leu Asn Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile Leu[0185] 145 150 155 160[0186] agt aaa att aat caa cca tat cag aaa ttt tta gat gta tta aat acc 528[0187] Ser Lys Ile Asn Gln Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn Thr[0188] 165 170 175[0189] att aaa aat gca tct gat tca gat gga caa gat ctt tta ttt act aat 576[0190] Ile Lys Asn Ala Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr Asn[0191] 180 185 190

[0192] cag ctt aag gaa cat ccc aca gac ttt tct gta gaa ttc ttg gaa caa 624[0193] Gln Leu Lys Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln[0194] 195 200 205

[0195] aat agc aat gag gta caa gaa gta ttt gcg aaa gct ttt gca tat tat 672[0196] Asn Ser Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr Tyr[0197] 210 215 220

[0198] atc gag cca cag cat cgt gat gtt tta cag ctt tat gca ccg gaa gct 720[0199] Ile Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala[0200] 225 230 235 240[0201] ttt aat tac atg gat aaa ttt aac gaa caa gaa ata aat cta gtc gac 768[0202] Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Val Asp[0203] 245 250 255[0204] gaa gtt aaa cag gag aac cgg tta tta aat gaa tca gaa tca agt tcc 816[0205] Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser[0206] 260 265 270

[0207] cag ggg tta cta gga tac tat ttt agt gat ttg aat ttt caa gca ccc 864[0208] Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro[0209] 275 280 285

[0210] atg gtg gtt acc tct tct act aca ggg gat tta tct att cct agt tct 912[0211] Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser[0212] 290 295 300

[0213] gag tta gaa aat att cca tcg gaa aac caa tat ttt caa tct gct att 960[0214] Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile[0215] 305 310 315 320[0216] tgg tca gga ttt atc aaa gtt aag aag agt gat gaa tat aca ttt gct 1008[0217] Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala[0218] 325 330 335[0219] act tcc gct gat aat cat gta aca atg tgg gta gat gac caa gaa gtg 1056[0220] Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val[0221] 340 345 350

[0222] att aat aaa gct tct aat tct aac aaa atc aga tta gaa aaa gga aga 1104[0223] Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg[0224] 355 360 365

[0225] tta tat caa ata aaa att caa tat caa cga gaa aat cct act gaa aaa 1152[0226] Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys[0227] 370 375 380

[0228] gga ttg gat ttc aag ttg tac tgg acc gat tct caa aat aaa aaa gaa 1200[0229] Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu[0230] 385 390 395 400[0231] gtg att tct agt gat aac tta caa ttg cca gaa tta aaa caa aaa tct 1248[0232] Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser[0233] 405 410 415[0234] tcg aac tca aga aaa aag cga agt aca agt gct gga cct acg gtt cca 1296[0235] Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro[0236] 420 425 430

[0237] gac cgt gac aat gat gga atc cct gat tca tta gag gta gaa gga tat 1344[0238] Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr[0239] 435 440 445

[0240] acg gtt gat gtc aaa aat aaa aga act ttt ctt tca cca tgg att tct 1392[0241] Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser[0242] 450 455 460

[0243] aat att cat gaa aag aaa gga tta acc aaa tat aaa tca tct cct gaa 1440[0244] Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu[0245] 465 470 475 480[0246] aaa tgg agc acg gct tct gat ccg tac agt gat ttc gaa aag gtt aca 1488[0247] Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr[0248] 485 490 495[0249] gga cgg att gat aag aat gta tca cca gag gca aga cac ccc ctt gtg 1536[0250] Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val[0251] 500 505 510

[0252] gca gct tat ccg att gta cat gta gat atg gag aat att att ctc tca 1584[0253] Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser[0254] 515 520 525

[0255] aaa aat gag gat caa tcc aca cag aat act gat agt caa acg aga aca 1632[0256] Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr[0257] 530 535 540

[0258] ata agt aaa aat act tct aca agt agg aca cat act agt gaa gta cat 1680[0259] Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His[0260] 545 550 555 560[0261] gga aat gca gaa gtg cat gcg tcg ttc ttt gat att ggt ggg agt gta 1728[0262] Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val[0263] 565 570 575[0264] tct gca gga ttt agt aat tcg aat tca agt acg gtc gca att gat cat 1776[0265] Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His[0266] 580 585 590

[0267] tca cta tct cta gca ggg gaa aga act tgg gct gaa aca atg ggt tta 1824[0268] Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu[0269] 595 600 605

[0270] aat acc gct gat aca gca aga tta aat gcc aat att aga tat gta aat 1872[0271] Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn[0272] 610 615 620

[0273] acc ggg acg gct cca atc tac aac gtg tta cca acg act tcg tta gtg 1920[0274] Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val[0275] 625 630 635 640[0276] tta gga aaa aat caa aca ctc gcg aca att aaa gct aag gaa aac caa 1968[0277] Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln[0278] 645 650 655[0279] tta agt caa ata ctt gca cct aat aat tat tat cct tct aaa aac ttg 2016[0280] Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu[0281] 660 665 670

[0282] gcg cca atc gca tta aat gca caa gac gat gac agt tct act cca att 2064[0283] Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Asp Ser Ser Thr Pro Ile[0284] 675 680 685

[0285] aca atg aat tac aat caa ttt ctt gag tta gaa aaa acg aaa caa tta 2112[0286] Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu[0287] 690 695 700

[0288] aga ttg gat acg gat caa gta tat ggg aat ata gca aca tac aat ttt 2160[0289] Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe[0290] 705 710 715 720[0291] gaa aat gga aga gtg agg gtg gat aca ggc tcg aac tgg agt gaa gtg 2208[0292] Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val[0293] 725 730 735[0294] gta ccg caa att caa gag aca act gca cgt atc att ttt aat gga aaa 2256[0295] Val Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys[0296] 740 745 750

[0297] gat tta aat ctg gta gaa agg cgg ata gcg gcg gtt aat cct agt gat 2304[0298] Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp[0299] 755 760 765

[0300] cca tta gaa acg act aaa ccg gat atg aca tta aaa gaa gcc ctt aaa 2352[0301] Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys[0302] 770 775 780

[0303] ata gca ttt gga ttt aac gaa ccg aat gga aac tta caa tat caa ggg 2400[0304] Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly[0305] 785 790 795 800[0306] aaa gac ata acc gaa ttt gat ttt aat ttc gat caa caa aca tct caa 2448[0307] Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln[0308] 805 810 815[0309] aat atc aag aat cag tta gcg gaa tta aac gca act aac ata tat act 2496[0310] Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr[0311] 820 825 830

[0312] gta tta gat aaa atc aaa tta aat gca aaa atg aat att tta ata aga 2544[0313] Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg[0314] 835 840 845

[0315] gat aaa cgt ttt cat tat gat aga aat aac ata gca gtt ggg gcg gat 2592[0316] Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn IleAla Val Gly Ala Asp[0317] 850 855 860

[0318] gag tca gta gtt aag gag gct cat aga gaa gta att aat tcg tca aca 2640[0319] Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr[0320] 865 870 875 880[0321] gag gga tta ttg tta aat att gat aag gat ata aga aaa ata tta tca 2688[0322] Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser[0323] 885 890 895[0324] ggt tat att gta gaa att gaa gat act gaa ggg ctt aaa gaa gtt ata 2736[0325] Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile[0326] 900 905 910

[0327] aat gac aga tat gat atg ttg aat att tct agt tta cgg caa gat gga 2784[0328] Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly[0329] 915 920 925

[0330] aaa aca ttt ata gat ttt aaa aaa tat aat gat aaa tta ccg tta tat 2832[0331] Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr[0332] 930 935 940

[0333] ata agt aat ccc aat tat aag gta aat gta tat gct gtt act aaa gaa 2880[0334] Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu[0335] 945 950 955 960[0336] aac act att att aat cct agt gag aat ggg gat act agt acc aac ggg 2928[0337] Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly[0338] 965 970 975[0339] atc aag aaa att tta atc ttt tct aaa aaa ggc tat gag ata gga taa 2976[0340] Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly[0341] 980 985 990

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[0347] Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu Lys[0348] 1 5 10 15[0349] Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Thr Gln[0350] 20 25 30

[0351] Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys Ile Glu Val[0352] 35 40 45

[0353] Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu Lys Leu Leu Glu[0354] 50 55 60

[0355] Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys Ala Ile Gly Gly Lys[0356] 65 70 75 80[0357] Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys His Ile Ser Leu Glu Ala[0358] 85 90 95[0359] Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala[0360] 100 105 110

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[0371] Gln Leu Lys Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln[0372] 195 200 205

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[0375] Ile Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala[0376] 225 230 235 240[0377] Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Val Asp[0378] 245 250 255[0379] Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser[0380] 260 265 270

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[0391] Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg[0392] 355 360 365

[0393] Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys[0394] 370 375 380

[0395] Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu[0396] 385 390 395 400[0397] Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser[0398] 405 410 415[0399] Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro[0400] 420 425 430

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[0441] Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp[0442] 755 760 765

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[0445] Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly[0446] 785 790 795 800[0447] Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln[0448] 805 810 815[0449] Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr[0450] 820 825 830

[0451] Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg[0452] 835 840 845

[0453] Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp[0454] 850 855 860

[0455] Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr[0456] 865 870 875 880[0457] Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser[0458] 885 890 895[0459] Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile[0460] 900 905 910

[0461] Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly[0462] 915 920 925

[0463] Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr[0464] 930 935 940

[0465] Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu[0466] 945 950 955 960[0467] Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly[0468] 965 970 975[0469] Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly[0470] 980 985 990