一种利用胶体金相互聚集检测生物素标记的DNA的方法

摘要

一种基于不同修饰的胶体金聚集和银染信号扩增的DNA测定方法，属于分析生物化学技术领域。该发明主要内容是使两种修饰不同生物分子的胶体金发生结合，将DNA信号放大。首先将生物素标记的单链DNA通过共价交联固定到基片表面上，再加入链霉亲和素修饰的胶体金，使之结合到生物素标记的单链DNA上，然后加入生物素修饰的胶体金，使两种修饰不同生物分子的胶体金发生结合，重复这一过程，将DNA信号放大，最后，利用银染方法进一步放大信号。通过使用该方法，发现在一定的物质的量范围内，点样处生成的灰度值与物质的量的对数值具有较好的线性关系。该方法是一种灵敏度高，特异性好的可视化检测DNA的方法，在诸多领域有应用潜力。

权利要求

1.一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集的检测生物素标记的DNA的方法，其特征是步骤为：(1)胶体金的制备；(2)DNA修饰的胶体金的制备；(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备；(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验；(5)扫描及数据分析；

(1)胶体金的制备：利用Frens法制备13nm的胶体金；

所用的玻璃仪器使用铬酸洗液浸泡后，双蒸水清洗，烘干备用；制备时向500mL烧杯中加入1％氯化金溶液7.5mL，再加入超纯水至250mL，加热；将溶液加热至沸腾后，立即加入

6.25mL1％柠檬酸三钠溶液，继续加热，搅拌，沸腾15分钟后，停止加热；这一过程中可观察到溶液的颜色由黄色变为深紫色，进而变为透明的深红色；冷却至室温后，将胶体金用微孔滤膜进行过滤，4℃保存；

(2)biotin标记的DNA修饰的胶体金的制备：利用巯基与胶体金的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到胶体金表面；

向1mL的AuNP中加入30μL100μM的5’巯基修饰的ssDNA，避光摇一段时间，然后向+ +溶液中加入10.8μL 0.5M的磷酸缓冲液和2M的NaCl溶液使其Na 浓度递增，当Na 浓度升至0.1M，停止反应，再加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心；离心结束后，弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBST中；然后向溶液中加入30μL100μM的5’biotin修饰的ssDNA，16h后离心，弃上清，沉淀溶解于PBS中；

(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备：利用蛋白质与胶体金的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到胶体金表面；

向1mL的AuNP中加入40μL 0.5μg/μL的链霉亲和素(SA)，避光摇一段时间，向溶液+中加入2M的NaCl溶液使其Na 浓度递增，升至0.1M后，加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心；弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBS缓冲液中；

(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验：利用生物素与链霉亲和素的相互作用，使两种不同修饰的胶体金发生聚集，使信号放大，然后进行银染进一步增强信号；

3.0 2.5 2.0 1.5

将5’biotin修 饰 的ssDNA稀 释 成 1×10 nM，1×10 nM，1×10 nM，1×10 nM，

1.0 0.5

1×10 nM，1×10 nM，，分别取1μL点于醛基基片上，对照组使用无修饰的ssDNA；将基片置于恒温恒湿环境中反应16h；然后将基片置于鲑精DNA封闭液中封闭；封闭结束后用PBST洗三次；向反应池中加入1ml的链霉亲和素修饰的胶体金(SA-AuNP)，孵育2h；之后用PBST洗三次；再向反应池中加入1ml的biotin标记的DNA修饰的胶体金(DNA-AuNP)，孵育

2h；之后用PBST洗三次；重复上述孵育过程，孵育结束后对基片进行银染；对照组分别仅使用AuNP，DNA-AuNP和SA-AuNP孵育；

(5)扫描及数据分析；

将银染后的基片进行扫描，使用ImageJ软件分析其灰度值，使用oringe6.0软件分析其线性相关系数及相对标准偏差。

说明书

一种利用胶体金相互聚集检测生物素标记的DNA的方法

技术领域

[0001] 一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集检测生物素标记的DNA的方法，属于分析生物化学技术领域。

背景技术

[0002] 纳米材料在生物分析中的应用成为一个快速发展的领域，胶体金以其独特的光学、电学性质以及生物亲和效应，在催化、传感器和DNA分析检测等方面表现出很多潜在的应用价值，受到了化学、物理及生命科学等相关领域的广泛关注。1996年，Mirkin等首次报道了胶体金在DNA的交联作用下的聚集现象，用来对生物大分子进行检测分析，之后，相关方面的研究逐渐增多。但大多数利用胶体金检测DNA的方法是利用生物分子修饰的胶体金与固定在固相表面的生物分子相互作用的单层结合，或是不同DNA修饰的胶体金在液相发生空间上聚集。本方法先将biotin修饰的ssDNA固定到醛基基片上，然后，将链霉亲和素修饰的胶体金以及连接上5’biotin修饰的DNA的胶体金依次加入到反应体系中，并重复这一过程，利用biotin与链霉亲和素的相互作用，使两种修饰不同生物分子的胶体金发生结合，发生聚集，将DNA信号放大，实现在基片表面的空间上对DNA信号进行放大，最后，0.5
利用银染方法进一步放大信号。实验结果表明发现在1×10 fmol(约为3.162fmol)至
3.0
1×10 fmol物质的量范围内，灰度值与物质的量的对数值具有良好的线性的线性关系和精密度。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集的检测生物素标记的DNA的方法，这种方法具有较宽的线性范围、较低的检测限以及较高的精密度。 [0004] 本发明的技术方案：一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集的检测生物素标记的DNA的方法，步骤为(1)胶体金的制备；(2)DNA修饰的胶体金的制备；(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备；(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验；(5)扫描及数据分析。

[0005] (1)胶体金的制备：利用Frens法制备13nm的胶体金；

[0006] 所用的玻璃仪器使用铬酸洗液浸泡后，双蒸水清洗，烘干备用；制备时向500mL烧杯中加入1％氯化金溶液7.5mL，再加入超纯水(电阻率≥18.2MΩ·cm)至250mL，加热。将溶液加热至沸腾后，立即加入6.25mL1％柠檬酸三钠溶液，继续加热，搅拌，沸腾15分钟后，停止加热。这一过程中可观察到溶液的颜色由黄色变为深紫色，进而变为透明的深红色。冷却至室温后， 将胶体金用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，4℃保存。 [0007] (2)biotin标记的DNA修饰的胶体金的制备：利用巯基与胶体金的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到胶体金表面；

[0008] 向1mL的AuNP(pH＝7.0)中加入30μL100μM的5’巯基修饰的ssDNA，避光摇+16h，然后向溶液中加入10.8μL0.5M的磷酸缓冲液和一定量2M的NaCl溶液使其Na 浓度+
递增，当Na 浓度升至0.1M，8h后停止反应，再加入0.3mL10％小牛血清白蛋白，1h后离心，
20000g，4℃，1h。离心结束后，弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入
30μL100μM的5’biotin修饰的ssDNA，避光摇16h后离心，20000g，4℃，1h。弃上清，沉淀溶解于PBS中。

[0009] (3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备：利用蛋白质与胶体金的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到胶体金表面；

[0010] 向1mL的AuNP(pH＝9.0)中加入40μL0.5μg/μL的链霉亲和素(SA)，避光+摇16h，向溶液中加入一定量的2M的NaCl溶液使其Na 浓度递增，升至0.1M 8h后，加入
0.3mL10％BSA，1h后离心，20000g，4℃，60min。弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBS缓冲液中。

[0011] (4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验：利用生物素与链霉亲和素的相互作用，使两种不同修饰的胶体金发生聚集，使信号放大，然后进行银染进一步增强信号；

[0012] 将5’biotin修饰的ssDNA稀释成1×103.0nM，1×102.5nM，1×102.0nM，1×101.5nM，1.0 0.5
1×10 nM，1×10 nM分别取1μL点于醛基基片上，对照组使用无修饰的ssDNA。将基片置于37℃，恒湿环境中，16h。然后将基片置于10μg/mL的鲑精DNA封闭液中，室温封闭24h。
封闭结束后用0.5％PBST洗三次，每次10min。向反应池中加入一定量的SA-AuNP，孵育3h。
之后用PBST洗三次，每次10min。再向反应池中加入一定量的DNA-AuNP，孵育3h。之后用PBST洗三次，每次10min。重复上述孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。其他3组分别仅使用AuNP，DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。由于5’biotin-ssDNA具有大量的碱性基团，当其被点到醛基基片上后碱性基团会与醛基反应，从而将biotin标记的ssDNA固定到基片上。
当反应中依次加入SA-AuNP和DNA-AuNP后，点样处出现了红色圆点。说明当用SA-AuNP孵育时，其上面的SA会与基片上ssDNA的biotin结合，这样就将SA-AuNP固定到基片上，再加入DNA-AuNP，DNA-AuNP上的DNA带有biotin，它会与SA-AuNP上的SA相互结合，重复这一过程，更多的SA-AuNP和DNA-AuNP会聚集到点样处，形成建立在SA与biotin相互作用基础上的多层次的网络结构，从而实现对信号的放大，达到肉眼可见的程度。从而实现了对信号的放大。如果反应中，仅加入没有任何修饰的AuNP，点样处没有出现红色圆点，但出现了较高的红色背景，这是由于没有包被的AuNP与基片上的封闭剂鲑精DNA相互作用，AuNP 被吸附到基片上，从而产生了较深的红色的背景。当反应中只加入DNA-AuNP，也没有出现红色圆点。当反应中只加入SA-AuNP，理论上应该结合上一层SA-AuNP，但由于密度过低，无法观察到。仅加入SA-AuNP或DNA-AuNP都不会形成基于SA与biotin相互作用的两种不同修饰的AuNP的聚集。在所有基片上，对照组(点样处为未修饰的ssDNA)均未出现红色圆点。

[0013] (5)扫描及数据分析；

[0014] 将银染后的基片进行扫描，使用ImageJ软件分析其灰度值，使用oringe6.0软件0.5
分析其线性相关系数及相对标准偏差。实验结果证明在1×10 fmol(约为3.162fmol)至
3.0
1×10 fmol物质的量范围内，点样处生成的灰度值与物质的量的对数值具有较好的线性关系，经分析其线性相关系数为0.99218，相对标准偏差为1.732％(n＝6)。该方法是一种灵敏度高，特异性好的可视化检测DNA的方法。

附图说明

[0015] 图1胶体金的电子显微镜图片。

[0016] 图2胶体金的紫外可见吸光光谱图。

[0017] 图3AuNP，DNA-AuNP及SA-AuNP的紫外可见吸光光谱图。

[0018] 图4基片实验结果(对照组点样处为未修饰的ssDNA)。A组仅使用AuNP孵育，B组仅使用DNA-AuNP孵育，C组仅使用SA-AuNP孵育，D组交替使用DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。

[0019] 图5银染后的基片反相图片。

[0020] 图6基片上5′biotin-ssDNA物质的量取对数值后与灰度值的线性关系标准曲线。

具体实施方式

[0021] (1)胶体金的制备：利用Frens法制备13nm的胶体金；

[0022] 所用的玻璃仪器使用铬酸洗液浸泡后，双蒸水清洗，烘干备用；制备时向500mL烧杯中加入1％氯化金溶液7.5mL，再加入超纯水(电阻率≥18.2MΩ·cm)至250mL，加热。将溶液加热至沸腾后，立即加入6.25mL1％柠檬酸三钠溶液，继续加热，搅拌，沸腾15分钟后，停止加热。这一过程中可观察到溶液的颜色由黄色变为深紫色，进而变为透明的深红色。冷却至室温后，将胶体金用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，4℃保存。 [0023] (2)biotin标记的DNA修饰的胶体金的制备：利用巯基与胶体金的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到胶体金表面；

[0024] 向1mL的AuNP(pH＝7.0)中加入30μL100μM的5’巯基修饰的ssDNA，避光摇+16h，然后向溶液中加入10.8μL0.5M的磷酸缓冲液和一定量2M的NaCl溶液使其 Na 浓度+
递增，当Na 浓度升至0.1M，8h后停止反应，再加入0.3mL10％小牛血清白蛋白，1h后离心，
20000g，4℃，1h。离心结束后，弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入
30μL100μM的5’biotin修饰的ssDNA，避光摇16h后离心，20000g，4℃，1h。弃上清，沉淀溶解于PBS中。

[0025] (3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备：利用蛋白质与胶体金的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到胶体金表面；

[0026] 向1mL的AuNP(pH＝9.0)中加入40μL0.5μg/μL的链霉亲和素(SA)，避光+摇16h，向溶液中加入一定量的2M的NaCl溶液使其Na 浓度递增，升至0.1M 8h后，加入
0.3mL10％小牛血清白蛋白，1h后离心，20000g，4℃，60min。弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBS缓冲液中。

[0027] (4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验：利用生物素与链霉亲和素的相互作用，使两种不同修饰的胶体金发生聚集，使信号放大，然后进行银染进一步增强信号；

[0028] 将5’biotin修饰的ssDNA稀释成1×103.0nM，1×102.5nM，1×102.0nM，1×101.5nM，1.0 0.5
1×10 nM，1×10 nM分别取1μL点于醛基基片上。将基片置于37℃，恒湿环境中，16h。然后将基片置于10μg/mL的鲑精DNA封闭液中，室温封闭24h。封闭结束后用0.5％PBST洗三次，每次10min。向反应池中加入一定量的SA-AuNP，孵育3h。之后用PBST洗三次，每次
10min。再向反应池中加入一定量的DNA-AuNP，孵育3h。之后用PBST洗三次，每次10min。
重复上述孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。

[0029] (5)扫描及数据分析；

[0030] 将银染后的基片进行扫描，使用ImageJ软件分析其灰度值，使用oringe6.0软件分析其线性相关系数及相对标准偏差。