团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法

摘要

本发明公开了一种团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交方法，包括以下步骤：首先挑选性腺成熟、无病无伤、体征良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对亲鱼进行人工催产，选择催产效果好的亲鱼进行人工干法授精，授精完成后的胚胎进行培养皿静水孵化，对孵化完成后的鱼苗进行饲养，再用流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对饲养后的实验鱼进行检测，获得团头鲂与翘嘴红鲌杂交形成的三倍体鱼和二倍体鱼。本发明的远缘杂交方法不仅获得了性状改善的二倍体和三倍体鱼，而且显著提高了远缘后代的受精率和孵化率，开辟了一种生产改良二倍体和三倍体鱼的新途径，在鱼类遗传育种方面具有重要生物学意义。

权利要求

1.一种团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法，包括以下步骤：首先挑选性腺成熟、无病无伤、体征良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，选择催产效果良好的亲鱼进行人工干法授精，授精完成后的胚胎进行培养皿静水孵化，对孵化完成后的鱼苗进行饲养，再对饲养后的实验鱼进行检测、筛分，获得团头鲂与翘嘴红鲌杂交三倍体鱼和二倍体鱼；

所述方法具体包括以下步骤：

1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前5～6个月，挑选体重1kg以上、性成熟特征明显、体征良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为远缘杂交的亲鱼进行专池培育，在繁殖期前一个月每隔2～3天流水刺激一次，以促进所述亲鱼的性腺发育成熟；

2)人工催产：在所述繁殖期当年的5月下旬至6月下旬，水温稳定在23℃～25℃时，为所述亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，先注射母本亲鱼，所述黄体素释放激素类似物的用量为10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为

600IU/kg；4～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶(1.5～2

2.5)的数量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为80m 的产卵池中，然后根据水情及时向池中冲水，在产卵前3～4h注入一定水量后，停止注水，让所述亲鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；

3)授精孵化：挑选产卵量大、产卵质量高的母本亲鱼和产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，受精卵置于水温为23℃～24℃的培养皿中进行静水孵化；

4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，3～4天后泼洒豆浆，每天泼洒2～3次，实验鱼长成后经检测、筛分获得团头鲂与翘嘴红鲌杂交三倍体鱼和二倍体鱼。

2.根据权利要求1所述的团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法，其特征在于：对所述长成后的实验鱼进行检测的具体方法是指利用流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对实验鱼进行DNA含量和染色体数目的检测。

说明书

团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鱼类杂交方法，尤其涉及一种鲤科鲌亚科鱼类中的远缘杂交方法。

背景技术

[0002] 杂交技术是改良鱼类性状常用的方法，亲缘关系在种间或种间以上的杂交一般称为远缘杂交。远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法，它可以整合整套外源基因，从而改变杂交后代基因的表达调控，使得杂交后代可能在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出杂种优势。如红鲫与湘江野鲤的属间远缘杂交形成的杂交后代具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗病力强、存活率高等优点；红鲫与团头鲂的亚科间远缘杂交形成的杂交后代除具有鲫鲤杂交鱼以上优点外，体背还明显增高，外形优美，具有良好的经济效应。如何利用和改进现有的生物学技术和方法来对现有的自然鱼种进行遗传改良以获得形状更为优良、品种更加丰富和对遗传研究更有意义的新型多倍体鱼，就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种受精率高、孵化率高、后代性状优良、对遗传育种具有重要意义的团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法，包括以下步骤：首先挑选性腺成熟、无病无伤、体征良好的雌性团头鲂(母本亲鱼)和雄性翘嘴红鲌(父本亲鱼)作为亲鱼进行专池培育，然后在繁殖季节对所述亲鱼进行人工催产，选择催产效果良好的亲鱼进行人工干法授精，授精完成后的胚胎进行培养皿静水孵化，对孵化完成后的鱼苗进行饲养，再对饲养后的实验鱼进行检测、筛分，获得团头鲂与翘嘴红鲌杂交三倍体鱼和二倍体鱼。

[0005] 上述团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法，具体包括以下步骤：

[0006] 1)亲鱼的选择和培育：在繁殖期前5～6个月，挑选体重1kg以上、性成熟特征明显、体征良好的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为远缘杂交的亲鱼进行专池培育，在繁殖期前一个月左右每隔2～3天流水刺激一次，以促进所述亲鱼的性腺发育成熟；体征良好的亲鱼一般表现为体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤；

[0007] 2)人工催产：在所述繁殖期当年的5月下旬至6月下旬，水温稳定在23℃～25℃时，为所述亲鱼注射黄体素释放激素类似物(LRH-A)与绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，先注射母本亲鱼，所述LRH-A的用量为10μg/kg，HCG的用量为600IU/kg；4～5h后再注射父本亲鱼，父本亲鱼的注射剂量减半；注射完毕后按1∶(1.5～2.5)的
2
数量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为80m 左右的产卵池中，然后根据水情及时向池中冲水，在产卵前3～4h注入一定水量后，停止注水，让所述亲鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；注射时优选采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率；

[0008] 3)授精孵化：挑选产卵量大、产卵质量高的母本亲鱼和产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，受精卵置于水温为23℃～24℃的培养皿中进行静水孵化；

[0009] 4)饲养：鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，3～4天后泼洒豆浆，每天泼洒2～3次，泼洒时力求细、匀，实验鱼长成后经检测、筛分获得团头鲂与翘嘴红鲌杂交三倍体鱼和二倍体鱼。

[0010] 上述团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交的方法中，对所述长成后的实验鱼进行检测的具体方法是指利用流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对实验鱼进行DNA含量和染色体数目的检测。本技术方案中用流式细胞DNA含量测定法和外周血细胞培养的染色体倍性检测方法来检测实验鱼具有不杀死实验鱼、准确、快速、试验结果清晰的优点。

[0011] 上述技术方案中的团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤科、鲌亚科，鲂属中的二倍体鱼(2n＝48)，体高侧扁，尾柄高而短，体型优美，草食性，生长速度快，肉质细嫩、腴美，脂肪丰富；翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis Bleeker)隶属于鲤科，鲌亚科，鲌属中的二倍体鱼(2n＝48)，为大型淡水经济鱼类，生长迅速，耐低氧，适应性与抗病力极强，常年摄食(含严冬季节)，肉质洁白鲜嫩，营养价值高，深受人们的青睐。本发明通过反复实验最终选择团头鲂为母本，翘嘴红鲌为父本进行远缘杂交获得了具备多种杂交优势的新型三倍体、二倍体杂交鱼类。相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著提高。杂交后代整合了父母本体形优美、生长迅速、肉质细嫩、营养价值高等优良性状，并且成功地解决了远缘杂交后代不能存活或存活率较低的问题。

[0012] 此外，本发明方法获得的新型多倍体杂交鱼在鱼类多倍体育种和生物进化方面也具有重要意义。

附图说明

[0013] 图1为本发明实施例中团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中二倍体鱼的外形照片；

[0014] 图2为本发明实施例中团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中二倍体鱼的染色体图(2n＝48)；

[0015] 图3为本发明实施例中团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中三倍体鱼的外形照片；

[0016] 图4为本发明实施例中团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中三倍体鱼的染色体图(3n＝72)；

[0017] 图5为本发明实施例中测定的团头鲂的DNA含量图；

[0018] 图6为本发明实施例中测定的团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中二倍体鱼的DNA含量图；

[0019] 图7为本发明实施例中测定的团头鲂(♀)×翘嘴红鲌 后代中三倍体鱼的DNA含量图。

具体实施方式

[0020] 实施例：

[0021] 在繁殖期前5～6个月，挑选体重1kg以上、性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤的雌性团头鲂和雄性翘嘴红鲌作为远缘杂交的亲鱼进行专池培育，合理投喂饲料，特别是在繁殖期前一个月左右每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺良好发育。

[0022] 在繁殖期当年的5月下旬至6月下旬，当水温稳定在23～25℃时，挑选体征良好、性腺发育良好的上述亲鱼注射LRH-A与HCG的混合催产剂进行催产，先注射雌性团头鲂，LRH-A的用量为10μg/kg，HCG的用量为600IU/kg；4～5h后再注射雄性翘嘴红鲌，剂量减2
半；注射完毕后立即按1∶2左右的数量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为80m 左右的产卵池中，以增加母、父本亲鱼的接触机会，提高产卵率。然后据水情及时向池中冲水，尤其在产卵前3～4h，注入一定水量后，终止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精。同时，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情况。注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率。

[0023] 当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、纱窗网片上沾有适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水中检测)，将催产效果良好的雌性团头鲂与雄性翘嘴红鲌进行人工干法授精，把精卵挤入干净的瓷盆中，用干净的羽毛迅速不停地搅拌2～3min，然后迅速用羽毛将受精卵均匀铺于事先准备好的装有少量水的干净培养皿中，密度控制在约800～1000粒/培养皿，当受精卵粘于培养皿上后用清水轻轻漂洗一遍，然后马上放入室温为23℃～24℃的孵化房中加满清水静水孵化，孵化期间每天换水2～3次。

[0024] 鱼苗全部孵出后，先于网箱中培育1～2天，待鱼苗出现腰点、开始平游后将鱼苗转入预先培肥的池塘中饲养，3～4天后泼洒豆浆，每天泼洒2～3次，力求细、匀，直至鱼苗长到能正常摄食。

[0025] 孵化期间，统计胚胎的受精率和孵化率。团头鲂与翘嘴红鲌远缘杂交鱼的受精率和孵化率分别为78％和62％，相比同类杂交试验，其受精率和孵化率得到了显著地提高。

[0026] 鱼苗饲养3～4个月后，随即抽样、测量分析其生物学形状相关数据，并分别与团头鲂和翘嘴红鲌成体鱼的各项已知数据进行比较，结果如表1所示：

[0027] 表1：团头鲂、翘嘴红鲌及其杂交后代的可数性状比较(单位：片或条)[0028]

[0029] 注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。

[0030] 上述可数性状相关数据表明：两种杂交后代鱼在外型上均基本整合了其父、母本(团头鲂与翘嘴红鲌)的特征，如二倍体鲂鲌与三倍体鲂鲌的侧线鳞数分别为64～68、56～61，介于团头鲂的49～52和翘嘴红鲌的80～92之间；有的则偏父本遗传，如侧线上鳞片数分别为13～15、14～15，均超过了其母本9～10的范围，而靠近父本的16～20。
另外，这两种杂交后代鱼的外形照片如图1(二倍体)和图3(三倍体)所示，从外形上比较可以发现，两种杂交后代鱼的头部均与团头鲂相似，而二倍体鲂鲌的体高、尾鳍偏像于翘嘴红鲌，三倍体鲂鲌的体高、尾鳍则偏像于团头鲂，体形优美，肉质鲜嫩。这些均说明三倍体鲂鲌和二倍体鲂鲌是团头鲂与翘嘴红鲌的杂交后代。

[0031] 再用外周血细胞培养的染色体倍性检测方法对三倍体和二倍体杂交鱼的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现团头鲂与翘嘴红鲌杂交后代中体背较矮者为二倍体(2n＝48)，体背较高者为三倍体(3n＝72)，二者的染色体图分别如图2和图4所示。

[0032] 同时，以普通团头鲂为参照，用流式细胞仪测定二倍体鲂鲌和三倍体鲂鲌红细胞中的DNA含量，结果分别如图5、6、7所示。分析图中数据可知，团头鲂、二倍体鲂鲌和三倍体鲂鲌的DNA平均含量分别为74.55、72.76和107.78，二倍体鲂鲌与对照团头鲂的DNA平均含量比值为0.976，该比值与预计的1∶1理论比值间无显著差异；三倍体鲂鲌与对照团头鲂的DNA平均含量比值为1.446，该比值与预计的1.5∶1理论比值间无显著差异。这些试验结果与外周血细胞培养的染色体倍性检测方法获得的结果是一致的。

[0033] 上述实施例中外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640(1640培养液)，15ml小牛血清，2支植物血凝素(PHA)，1ml 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO3(无菌)或1NHCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃5％的二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72h，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为
0.05～0.07μg/ml。以上步骤均需无菌操作。

[0034] 上述实施例中染色体制备步骤为：1)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1000rpm离心5min，弃上清液；2)向离心管中加入低渗液9ml，混匀，低渗25～30min；3)加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5min，弃上清液；4)加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20min后1000rpm离心5min，弃上清液；5)重复步骤4一次；6)视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1～2ml)后，吸取细胞悬液自20～30cm高处滴片，轻吹散，空气中自然干燥；7)Giemsa染液染色20～40min，细水流冲洗载玻片背面去除染液，气干后镜检、拍照。

[0035] 上述实施例中流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。

[0036] 本实施例方法获得的三倍体、二倍体杂交鱼，不仅整合了父母本亲鱼的多项优良性状，还显著提高了远缘杂交的受精率和孵化率，在生物进化研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。