一种降解苦马豆素的节杆菌HW08及其应用

摘要

本发明公开了一种降解苦马豆素的节杆菌(Arthrobacter sp.)HW08，该菌株于2009年9月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.3313。该菌株的菌落呈圆形，随着培养时间的延长由乳白色逐渐转变为淡黄色，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，不透明。在无机盐培养基中培养48h以内，基本属于杆状细胞，大小为0.3～0.5μm×0.5～1.0μm；培养48h以后逐渐变为球形，直径约为0.6～0.8μm。该菌株从埋置有黄花棘豆(疯草)的上壤中分离、筛选获得，该菌株具有高效降解疯草毒素苦马豆素的能力。

权利要求

1.节杆菌(Arthrobacter sp.)HW08，于2009年9月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：3313。

说明书

一种降解苦马豆素的节杆菌HW08及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种节杆菌(Arthrobacter sp.)，具体涉及一种能够高效降解疯草毒素——苦马豆素(Swainsonine，SW)的节杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称，是世界范围内危害草原畜牧业生产可持续发展最严重的毒草。我国现有疯草类有毒植物45种(黄芪属22种，棘豆属23种)，构成严重危害的有12种，包括黄花棘豆、小花棘豆、甘肃棘豆、毛瓣棘豆、急弯棘豆、冰川棘豆、包头棘豆、宽苞棘豆、华西棘豆、变异黄芪、茎直黄芪、多花黄芪等，主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏、陕西、四川等省区，2
分布面积超过1100万hm，约占全国草场总面积的2.8％、西部草场面积的3.3％。疯草抗逆性很强，在荒漠草原上生长旺盛，而且返青早，枯萎迟，放牧动物在其它植物缺少或长势不好的情况下，长期或大量采食，可引起以慢性神经机能障碍为特征的中毒，甚至引起家畜大批中毒死亡。造成大批家畜中毒死亡。近年来疯草迅速蔓延生长，每年以3.5％的速度蔓延，现已成为影响我国西南、西北牧区危害草原畜牧业可持续发展的主要毒草，已形成典型的“生态经济病”。

[0003] 大量实验证明，苦马豆素(Swainsonine，SW)是疯草的主要毒性成分(Colegate，1979；Molyneux，1982；Tulsiani等，1984；曹光荣，1989；黄有德等，1992)，是疯草类植物体内含有的一种水溶性吲哚兹定生物碱，分子式为C8H15NO3，化学名称为1，2，8-三羟基八氢吲哚里西定(trihydroxyoctahydro-indolizidine)。在动物体内，SW能抑制细胞中α-甘露糖甙酶的活性，影响细胞糖蛋白的合成，导致低聚糖类堆积，造成细胞空泡化，从而使细胞失去正常功能，甚至造成细胞死亡；还能抑制高尔基甘露糖苷酶II，影响糖蛋白合成、处理和转移，导致细胞粘附、激素转运及细胞表面受体功能障碍。动物中毒后，临床表现包括精神沉郁、感觉迟钝、神经过敏、四肢无力、恶病质、生殖机能受损等，慢性中毒常造成神经系统持久性或不可恢复的损害。

[0004] 但疯草是豆科草本植物，具有丰富的营养价值，据报道，其干物质含量为90％以上，粗蛋白含量高达20％，营养价值与优良牧草苜蓿相当。如果能采取相应的措施将毒草变为可利用的牧草资源，既可以保护生态环境，防止草地退化，又可促进当地畜牧业的发展，对社会、牧民、生态都有着较为深远的意义。

[0005] 近年来，在疯草的危害、有毒成分及产生机理、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制疯草蔓延和防止动物采食疯草中毒的特效方法，致使动物疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。对于疯草中毒病的治疗目前尚无特效疗法，关键在于预防。国内学者曾尝试用浸泡、生物控制、生态控制、免疫注射、饲料添加剂、投放缓释丸等方法进行疯草毒素的控制，但仍然在特定地区或季节实施，且效果并不理想。王凯等研制出“棘防E号”等系列解毒剂，能有效推迟疯草中毒症状出现时间；童德文等SW与大分子载体蛋白BSA连接合成SW-BSA，以SW-BSA免疫原接种动物，使动物获得免疫力并在采食疯草时得到保护，这两项研究已取得一定进展，为防除动物疯草中毒病带来了希望。但对疯草毒素SW的产生机理和导致动物中毒的分子机理仍不清楚，因而不能从根本上防除动物疯草中毒病。

[0006] 近些年来，应用微生物降解有毒物质一直是国内外研究的热点，涉及的领域十分广泛，在微生物降解植物毒素方面的研究也取得一定成果。周斌从菜籽饼中分离到能够降解芥子甙的微生物70多株，降解能力较强的菌株鉴定为白色球拟酵母(Torulopsis candida)、华 根 霉(Rhizopus chinensis)、总 状 毛 霉 (Mucorracemosus)、米 曲 霉(Aspergillus oryzae)等，通过发酵试验确定其脱毒率可达80％。谭蓓英等从广西涠洲岛的黄牛瘤胃中分离出4株厌氧细菌，经鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)(2株)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，上述菌株对含羞草素和二羟基吡啶类毒素具有降解活性，这些脱毒菌生活在瘤胃中，可以保护宿主动物免受银合欢的毒害。孙君社等(2004)、Aidong Ruan等(2005)、袁勇军等(2005)、夏振远等(2006)、李雪梅等(2006)也分别分离出了降解烟碱的降解菌。赵兴华等(2008)应用这些研究方法，分离筛选出2株可以降解SW的降解菌(YLZZ-1和YLZZ-2)，但降解能力较低，对后续酶基因的筛选与研究较为困难。若能筛选获得一株高效降解SW的细菌，且降解特性稳定，将有利于降解SW的差异表达基因的筛选，甚至将降解SW的基因转入动物胃肠道正常菌群或动物机体进行表达，从根本上解决动物疯草中毒问题，无论是对草原疯草的利用，对草原毒草的生物学控制，还是对草原生态学研究都可起到极为重要的作用。

发明内容

[0007] 针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种节杆菌HW08，它能有效降解疯草毒素苦马豆素，降低对动物的毒害。

[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

[0009] 节杆菌(Arthrobacter sp.)HW08，于2009年9月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：3313。保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

[0010] 本发明还有一个目的在于提供节杆菌HW08在降解疯草毒素苦马豆素中的应用。

[0011] 本发明的节杆菌HW08具有下述性质：

[0012] 1.形态与生理生化特征

[0013] HW08菌株的菌体随培养基不同、培养时间的改变，其生长循环过程中的形状经历一个显著的改变。在无机盐培养液中培养48h以内，基本属于杆状细胞，大小为0.3～0.5μm×0.5～1.0μm，有的呈不规则分枝杆状或特有的“V”形或“Y”形排列；培养48h以后逐渐变为球形，直径约为0.6～0.8μm。一旦转移到新鲜培养液上，球形细胞又开始出芽生长，再次变为生长活跃的杆菌，有雏形分枝，但无真正的菌丝体，无荚膜，无芽孢，不运动；
在生长所有阶段染色均为革兰氏阳性。该菌株的菌落呈圆形，起初为乳白色，随着培养时间的延长逐渐转变为淡黄色，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，不透明。其生理生化特征见表
1。

[0014] 表1HW08菌株的生理生化特征

[0015]

[0016] 注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性。

[0017] 2.HW08菌株16S rDNA序列分析

[0018] HW08菌株16S rDNA序列如序列表1(SEQ ID NO：1)所述，其GenBank登录号为GQ921838。

[0019] 经16S rDNA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《伯杰细菌学手册(第八版)》，最终确定HW08菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)。

[0020] 本发明的节杆菌HW08，具有高效降解苦马豆素的细菌，且降解特性稳定，有利于降解苦马豆素的差异表达基因的筛选，可以将降解SW的基因转入动物胃肠道正常菌群或动物机体进行表达，从根本上解决动物疯草中毒问题，对草原疯草的利用，对草原毒草的生物学控制，对草原生态学研究都起到极为重要的作用，为彻底解决疯草的毒害奠定基础。

附图说明

[0021] 图1是HW08菌株的单个菌落形态；

[0022] 图2是HW08菌株在电镜下的形态；

[0023] 图3是HW08菌株在电镜下的“V”形结构；

[0024] 图4是HW08菌株革兰氏染色在显微镜下的形态；

[0025] 图5是利用Neighbor-Joining法构建的系统发育树；

[0026] 图6是HW08菌降解SW的0h气相色谱图；

[0027] 图7是HW08菌降解SW的4h气相色谱图。

具体实施方式

[0028] 以下结合发明人给出的附图和具体实施例及具体试验例来进一步说明本发明菌节杆菌HW08的分离和制备方法及其应用。

[0029] 实施例1：节杆菌HW08的分离

[0030] 1)将采自于宁夏回族自治区海原县南华山的黄花棘豆500g埋置于土壤中，埋置深度50cm，埋置时间6个月。

[0031] 2)取出草样周围的土壤500g，充分混匀；取10g充分混合的土壤样品，PBS(pH7.2)50ml溶解，并用磁力搅拌器搅拌混匀，上清液作为富集接种物(Harder，1981；Cook et al，1983)。

[0032] 3)以SW作为惟一碳源加入到无机盐培养液中，使其中SW的终浓度为10％。

[0033] 4)取1ml接种物加入到250ml含10％SW的无机盐培养液中，30℃、120rpm培养7d；取0.5ml接种至50ml新鲜培养液中，培养4d；如此反复8次；最后转接于含10％SW的固体无机盐培养基和营养平板，培养后挑取单菌接种于含10％SW的无机盐培养液中培养。

[0034] 5)应用薄层色谱法和气相色谱法对培养液中SW含量进行检测，用SW标准品作对照，从而筛选得到一株能够有效降解SW的节杆菌HW08。

[0035] 所述的无机盐培养液，其组分及配比为：NH4NO3 1.0g，MgSO4 0.15g，(NH4)2SO40.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO4 1.5g，酵母提取物0.05g，蒸馏水1L；pH值为7.0～
7.2，121℃高压灭菌20min。

[0036] 所述的含10％SW的无机盐培养液制备方法为：向1000ml无机盐培养液中加入SW100mg，调pH值至7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

[0037] 所述的含10％SW的固体无机盐培养基的制备方法为：向1000ml无机盐培养液中加入琼脂13g、SW 100mg，调pH值至7.0～7.2，121℃高压灭菌20min；待温度降至60℃左右时，取10ml倒入直径60mm的平板中，凝固后备用。

[0038] 所述的营养平板制备方法为：取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、KH2PO41g、琼脂13g、蒸馏水1L，调pH值至7.0～7.2，121℃高压灭菌20min；待温度降至60℃左右时，取
10ml倒入直径60mm的平板中，凝固后备用。

[0039] 实施例2：节杆菌HW08的鉴定

[0040] 1.形态学特征

[0041] HW08菌株的菌落呈圆形，起初为乳白色，随着培养时间的延长逐渐转变为淡黄色，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，不透明(图1)。菌体随培养基不同、培养时间的改变，其生长循环过程中的形状经历一个显著的改变。在无机盐培养基中培养48h以内，基本属于杆状细胞，大小为0.3～0.5μm×0.5～1.0μm，有的呈不规则分枝杆状或特有的“V”形或“Y”形排列(图2，图3)；培养48h以后逐渐变为球形，直径约为0.6～0.8μm。一旦转移到新鲜培养基上，球形细胞又开始出芽生长，再次变为生长活跃的杆菌，有雏形分枝，但无真正的菌丝体，无荚膜，无芽孢，不运动；在生长所有阶段染色均为革兰氏阳性(图4)。

[0042] 2.生理生化特征

[0043] 该菌株严格需氧；不发酵葡萄糖，可利用蔗糖；木糖、侧金盏花醇、乳糖、棉子糖不产酸，D-甘露糖产酸；可产生吲哚，不产生H2S；M.R试验阴性，V.P试验弱阳性，不水解淀粉，不还原硝酸盐，不分解纤维素，不能利用柠檬酸盐，不利用尿素，利用碳水化合物；液化明胶，接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阴性，苯丙二酸脱氢酶阴性，脂肪酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性；半乳糖、石蕊牛乳检测阴性；在7％NaCl中生长，但较缓慢，10％NaCl中不生长，麦康凯琼脂试验不生长。

[0044] 3.HW08菌株的16S rDNA序列鉴定

[0045] 利用PCR方法获得HW08菌株的16S rDNA序列，测序并注册登录入GenBank中(NO：GQ921838)(序列表1)，用Blast软件与GenBank中已注册的16S rDNA序列进行比较，发现与其序列同源性高的均为放线菌目微球菌亚目微球菌科中的节杆菌属，选取部分相似序列，应用ClustalX 1.83version和MEGA4.0软件采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树(图5)，HW08菌株的遗传进化距离与节杆菌属最近，与Arthrobacter sp.00-0248(Genbank No：EU086777)同源性为100％，说明该菌在分子系统发育分类学上为节杆菌。

[0046] 根据形态学特征、培养特性、系统发育分析，并结合文献报道，该菌定名为节杆菌HW08。

[0047] 试验例：节杆菌HW08降解SW试验

[0048] 采用气相色谱法测定该菌对SW的降解率。将LB斜面冲下的降解菌接种到含有100mg/L SW的无机盐培养液中，使菌液最终OD600为0.1，30℃，180r/min振摇培养，以培养
0h的SW无机盐培养液为对照，培养4h取样，以α-甘露糖苷为内标，用气相色谱仪测定苦马豆素的含量(图6，图7)，并计算降解率。

[0049] 图6、图7中的5.00、5.44分别为α-甘露糖苷和SW的保留时间。结果表明，接种菌液后终浓度为OD600≈0.1时，在含100mg/L SW的无机盐培养液中，pH为7.2、温度为30℃、180r/min振摇培养4h，SW的降解率为72.9804％。

[0050] 序列表1(SEQ ID NO：1)

[0051] <110>西北农林科技大学

[0052] <120>一种降解苦马豆素的节杆菌Hw08及其应用

[0053] <160>1

[0054] <210>1

[0055] <211>1399

[0056] <212>DNA

[0057] <213>Arthrobacter sp.HW08

[0058] <400>1

[0059] ACCTTCGACG GCTCCCCCCA CAAGGGTTAG GCCACCGGCT TCGGGTGTTA CCAACTTTCG 60[0060] TGACTTGACG GGCGGTGTGT ACAAGGCCCG GGAACGTATT CACCGCAGCG TTGCTGATCT 120[0061] GCGATTACTA GCGACTCCGA CTTCATGGGG TCGAGTTGCA GACCCCAATC CGAACTGAGA 180[0062] CCGGCTTTTT GGGATTAGCT CCACCTCACA GTATCGCAAC CCTTTGTACC GGCCATTGTA 240[0063] GCATGCGTGA AGCCCAAGAC ATAAGGGGCA TGATGATTTG ACGTCGTCCC CACCTTCCTC 300[0064] CGAGTTGACC CCGGCAGTCT CCTATGAGTC CCCGCCATAA CGCGCTGGCA ACATAGAACG 360[0065] AGGGTTGCGC TCGTTGCGGG ACTTAACCCA ACATCTCACG ACACGAGCTG ACGACAACCA 420[0066] TGCACCACCT GTAAACCGAC CGCAAGCGGG GCACCTGTTT CCAGGTATTA CCGGTTCATG 480[0067] TCAAGCCTTG GTAAGGTTCT TCGCGTTGCA TCGAATTAAT CCGCATGCTC CGCCGCTTGT 540[0068] GCGGGCCCCC GTCAATTCCT TTGAGTTTTA GCCTTGCGGC CGTACTCCCC AGGCGGGGCA 600[0069] CTTAATGCGT TAGCTACGGC GCGGAAAACG TGGAATGTCC CCCACACCTA GTGCCCAACG 660[0070] TTTACGGCAT GGACTACCAG GGTATCTAAT CCTGTTCGCT CCCCATGCTT TCGCTCCTCA 720[0071] GCGTCAGTTA ATGCCCAGAG ACCTGCCTTC GCCATCGGTG TTCCTCCTGA TATCTGCGCA 780[0072] TTTCACCGCT ACACCAGGAA TTCCAGTCTC CCCTACATCA CTCTAGTCTG CCCGTACCCA 840[0073] CTGCAGAACC GGAGTTGAGC CCCGGTCTTT CACAGCAGAC GCGACAAACC GCCTACGAGC 900[0074] TCTTTACGCC CAATAATTCC GGATAACGCT TGCGCCCTAC GTATTACCGC GGCTGCTGGC 960[0075] ACGTAGTTAG CCGGCGCTTC TTCTGCAGGT ACCGTCACTT TCGCTTCTTC CCTACTGAAA 1020[0076] GAGGTTTACA ACCCGAAGGC CGTCATCCCT CACGCGGCGT CGCTGCATCA GGCTTGCGCC 1080[0077] CATTGTGCAA TATTCCCCAC TGCTGCCTCC CGTAGGAGTC TGGGCCGTGT CTCAGTCCCA 1140[0078] GTGTGGCCGG TCACCCTCTC AGGCCGGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGTAGG CCATTACCCC 1200[0079] ACCAACAAGC TGATAGGCCG CGAGTCCATC CAAAACCACA AAAGCTTTCC ACCACCTGAC 1260[0080] ATGCGTCAGA CGGTCATATC CGGTATTAGA CCCAGTTTCC CAGGCTTATC CCAGAGTCAA 1320[0081] GGGCAGGTTA CTCACGTGTT ACTCACCCGT TCGCCACTAA TCCCCCAGCA AGCTGGGATC 1380[0082] ATCGTTCGAC TTGCATGTG 1399