猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它包括400μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，1000μL裂解液，1500μL TE缓冲液，250μLPCR酶，170μL超纯水，50μL的MarkerDL2000，40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，20μL阴性对照以及20μL阳性对照。本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品是否含有猪传染性胸膜肺炎的目的。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。

权利要求

1.一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：它包括400μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，1000μL裂解液，1500μL的TE缓冲液，250μL的PCR酶，170μL超纯水，

50μL的Marker DL2000，40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，引物P1、P2的序列分别为P1：5’-ATGAGGATTTGTTTCTCGGTGGTG-3’,P2:5-TATTTCCGTCCGGTTTATTCAGGTC-3；20μL阴性对照以及20μL阳性对照。

2.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：裂解液为由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：TE缓冲液包括Tris-HcL100mM及EDTA1mM组成的混合溶液，混合溶液的PH值为8.0。

4.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2 、25mM 的dNTP Mixture以及0.05U的Poymerase/uL。

5.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。

6.根据权利要求1所述的猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为重组pMD18-T-apxIVA质粒。

说明书

猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒。

背景技术

[0002] 猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumoniae，PCP)是胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP)引起的猪呼吸道疾病，以出血性、坏死性肺炎和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征，该病可引起猪死亡或生长缓慢，给世界各地的养猪业造成巨大的经济损失(Sebunya T N K等，1983，Macinnes J L等，1988，Gram T等，2000)。80年代在我国开始流行，近年来形成广泛的流行并且成上升趋势。根据是否依赖NAD可分为生物I型和生物II型两个生物型。生物I型中的1、5、9、10等血清型致病力最强。据统计，我国流行的血清型为1、2、3、5、7、10等型，以1、3、7型为主，主要血清型缺乏交叉免疫性。现在缺少一种能对临床样品的猪传染性胸膜肺炎进行简便、快捷、灵敏、准确的检测的试剂盒。

发明内容

[0003] 本发明的目的是：提供一种猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它可以在快速检测到猪传染性胸膜肺炎，并且简便、灵敏、准确。

[0004] 本发明是这样实现的：猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它包括400μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，1000μL裂解液，1500μL的TE缓冲液，250μL的PCR酶，170μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为
20μM，20μL阴性对照以及20μL阳性对照。

[0005] 裂解液为由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5％的SDS组成的混合溶液。

[0006] TE缓冲液包括Tris-HcL100mM及EDTA1mM组成的混合溶液，混合溶液的PH值为8.0。

[0007] PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/uL。

[0008] 引物P1、P2的序列分别为P1：5’-ATGAGGATTTGTTTCTCGGTGGTG-3’，P2：

[0009] 5-TATTTCCGTCCGGTTTATTCAGGTC-3。

[0010] 阴性对照为超纯水。

[0011] 阳性对照为重组pMD18-T-apxIVA质粒。

[0012] PCR方法的建立

[0013] PCR反应在50μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，Taq DNA polymerase1U，引物浓度20μmol/L用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为600bp，无非特异性片段产生(见图1)。结果表明APP的PCR检测方法建立成功。

[0014] 敏感性试验

[0015] 在PCR反应中，5CFU/mL～5×107CFU/mL稀释的APP细菌进行PCR，APP的最低检测量为50CFU(见图2)。结果表明建立的PCR敏感性高。

[0016] 特异性试验

[0017] 以APP1～10型、金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌进行PCR反应。APP1～10型均为阳性，而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性(见图3)。结果表明建立的PCR特异性强。

[0018] 应用建立的PCR方法，重复检测APP DNA样品3次，结果均一致。

[0019] 从实验结果可以知道猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR检测试剂盒能够对APP的临床样品进行快捷、灵敏、准确的检测。

[0020] 由于采用了上述技术方案，本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品是否含有猪传染性胸膜肺炎的目的。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。

附图说明

[0021] 附图1为APP的PCR试验图；

[0022] M：DL2000；1：APP PCR结果；

[0023] 附图2为PCR敏感性试验图；

[0024] M：DL2000；1～7：5CFU/mL～5×107CFU/mL稀释的APP PCR结果；

[0025] 附图3为PCR特异性试验图；

[0026] M：DL2000；1～10：APP 1～10型；11：金黄色葡萄球菌PCR产物；12：链球菌PCR产物；13：多杀性巴氏杆菌PCR产物；14：鼠伤寒沙门氏菌PCR产物；15：副猪嗜血杆菌PCR产物；16：大肠杆菌PCR产物。

具体实施方式

[0027] 本发明的实施例：猪传染性胸膜肺炎PCR诊断试剂盒，它包括400μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，1000μL裂解液，解液为由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM；
1500μL的TE缓冲液，TE缓冲液包括Tris-HcL100mM及EDTA1mM组成的混合溶液，混合溶液的PH值为8.0；250μL的PCR酶，PCR酶为天根生化科技(北京)有限公司PCR MasterMix产品，其具体组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2、25mM的dNTP Mixture以及0.05U的Poymerase/uL；170μL超纯水，50μL的Marker DL2000，40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，引物P1、P2的序列分别为P1：

[0028] 5’-ATGAGGATTTGTTTCTCGGTGGTG-3’，P2：5-TATTTCCGTCCGGTTTATTCAGGTC-3；采用20μL的超纯水作为阴性对照；采用20μL重组pMD18-T-apxIVA质粒作为阳性对照。