灭活的葡萄球菌全细胞疫苗

摘要

防病原细菌种类、通常地葡萄球菌种类的疫苗，并包括制备所述疫苗和培养病原细菌的方法。

权利要求

1.疫苗组合物，包含灭活的葡萄球菌细胞，其中利用葡萄球菌细胞制备所述组合物，所述葡萄球菌细胞的特征在于，所述细胞：i)是革兰氏阳性球菌；

ii)至少表达过氧化氢酶；

iii)诱导免疫应答，所述免疫应答产生至少与葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白结合的抗体；以及iv)对抗生素青霉素有抗性；

其中所述葡萄球菌细胞是以登录号NCTC 13408保藏的金黄色葡萄球菌细胞。

2.如权利要求1所述疫苗组合物，其中以不超过1.0mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

3.如权利要求1所述疫苗组合物，其中以不超过0.45mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

4.如权利要求2所述疫苗组合物，其中以至少0.0001mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

5.如权利要求2所述疫苗组合物，其中以至少0.1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

6.如权利要求3所述疫苗组合物，其中以至少0.0001mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

7.如权利要求3所述疫苗组合物，其中以至少0.1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

8.如权利要求2所述疫苗组合物，其中以0.0001-1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述金黄色葡萄球菌细胞。

9.如权利要求8所述疫苗组合物，其中以0.1-0.45mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

10.如权利要求9所述疫苗组合物，其中以0.25-0.36mg/ml细菌蛋白提供所述葡萄球菌细胞。

11.如权利要求9所述疫苗组合物，其中以0.35mg/ml细菌蛋白提供所述葡萄球菌细胞。

12.如权利要求1-11中任一项所述疫苗组合物，其中所述疫苗包含佐剂和/或赋形剂。

13.如权利要求1-11中任一项所述疫苗组合物，其中所述组合物包括至少一种其它抗细菌剂，以提供组合疗法。

14.如权利要求12所述疫苗组合物，其中所述组合物包括至少一种其它抗细菌剂，以提供组合疗法。

15.如权利要求13所述疫苗组合物，其中所述抗细菌剂是另一不同的疫苗和/或免疫原性剂。

16.如权利要求14所述疫苗组合物，其中所述抗细菌剂是另一不同的疫苗和/或免疫原性剂。

17.如权利要求1-11和14-16中任一项所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于作为鼻喷雾剂施用。

18.如权利要求12所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于作为鼻喷雾剂施用。

19.如权利要求13所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物适于作为鼻喷雾剂施用。

20.如权利要求17所述疫苗组合物，其中所述组合物于吸入器中提供，并作为气雾剂递送。

21.如权利要求18或19所述疫苗组合物，其中所述组合物于吸入器中提供，并作为气雾剂递送。

22.吸入器，包含权利要求1-21中任一项所述的疫苗组合物。

23.权利要求1-16中任一项所述组合物在制备用于预防和/或治疗葡萄球菌性乳腺炎的疫苗中的用途。

24.制备产生与葡萄球菌细菌多肽结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，所述方法包括如下步骤：i)给免疫活性哺乳动物接种权利要求1-16中任一项所述的疫苗组合物；

ii)将所述接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞；

iii)筛选步骤(ii)中杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的有关葡萄球菌细菌多肽的结合活性；

v)克隆所述杂交瘤细胞并培养所述细胞，以便增殖并分泌所述单克隆抗体；以及vi)从培养物上清液中回收所述单克隆抗体。

25.如权利要求24所述方法，其中所述免疫活性哺乳动物是小鼠。

26.如权利要求24所述方法，其中所述免疫活性哺乳动物是大鼠。

说明书

灭活的葡萄球菌全细胞疫苗

[0001] 本发明涉及防病原菌种类、通常地葡萄球菌种类的疫苗，并包括制备所述疫苗和培养病原菌的方法。

[0002] 疫苗可防种类繁多的感染性疾病。许多疫苗由注射入个体的灭活或减毒病原体产生。免疫的个体通过产生体液(如抗体)应答和细胞(如溶细胞的T细胞)应答而应答。例如，一些流感疫苗通过甲醛化学处理以灭活病毒而制备，同样，索尔克脊髓灰质炎疫苗(Salk polio vaccine)包含用丙内酯灭活的全病毒。对许多病原体来说，尽管化学或热灭活可以产生导致保护性免疫的疫苗免疫原，但其也引起如发烧和注射部位反应的副作用。如果是细菌，灭活的生物往往是如此毒性的，以致副作用限制了此类粗疫苗免疫原(如细胞百日咳疫苗)的应用，因而疫苗开发滞后于药物开发。这是令人遗憾的，因为药物抗性菌的出现不利于当前的抗生素治疗。

[0003] 获得抗生素抗性的病原生物的实例是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。金黄色葡萄球菌是正常栖息地为约20-40％正常健康人群鼻子的上皮内衬(lining)且也通常见于人的皮肤上而不引起伤害的细菌。然而，在某些情况下，特别是皮肤受到损伤时，这种病原体可引起感染。在患者可能具有外科手术程序和/或正服用免疫抑制药物的医院中，这是值得注意的问题。因为已接受的治疗，这些患者更加易于感染金黄色葡萄球菌。近年来，已经出现金黄色葡萄球菌的抗性菌株。二甲氧基苯青霉素抗性菌株很普遍，且这些抗性菌株中的许多菌株也对若干其它抗生素有抗性。目前，对金黄色葡萄球菌没有有效的接种程序。

[0004] 金黄色葡萄球菌因而是能引起种类繁多的疾病的主要人类病原体，其中的一些疾病是威胁生命的疾病，包括败血病、心内膜炎、关节炎和毒性休克。这种能力由生物的多功能性和其与毒力有关的组分库决定。在感染发作和发展时，生物的需求和环境发生变化，并且这由金黄色葡萄球菌所产生的毒力因子(virulence determinant)的相应改变反映。在感染之初，病原体粘附于宿主组织非常重要，因此产生大量细胞表面相关附着蛋白。这些蛋白包括胶原蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白和纤连蛋白结合蛋白。病原体也能通过产生减少吞噬作用或干扰细胞被循环抗体识别的能力的因子来逃避宿主防御。通常感染的中心发展为脓肿，且生物的数量增加。金黄色葡萄球菌能通过产生群体感应肽(quorum sensingpeptide)监控自身细胞密度。肽的聚集(其与细胞饥饿开始所导致的生理变化有关)引发毒力因子的产生从黏附素转变到与侵入和组织渗透有关的组分。这些包括种类繁多的溶血素、蛋白酶和其它降解酶(也可参阅Manualof Clinical Microbiology Fourth Edition(临床微生物学手册第四版).EditorsEdwin H Lennette，Albert Balows，William J Hausler Jr，H Jean Shadomy；published by the Americal Society for Microbiology1985)。

[0005] 利用选为金黄色葡萄球菌菌株谱代表的金黄色葡萄球菌临床分离物，我们公开了开发的氯仿灭活的全细菌疫苗，所述金黄色葡萄球菌菌株谱用许多标准进行了检测。称为SA75的疫苗的抗原性已经用兔超免疫血清(hyperimmune rabbit serum)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法(western blotting)证实，并且该疫苗在雄性和雌性兔中都产生了剂量相关免疫应答。来自疫苗在男性志愿者中的安慰剂对照的双盲I期临床试验的初步数据表明，疫苗是安全的且是免疫原性的。它也与许多其它病原菌交叉反应，因而提供了防种类繁多的细菌病原体的疫苗。另外，我们描述了基本上不含动物来源的产物的细胞培养条件，和这些条件在疫苗生产中的用途。

[0006] 本发明一方面提供了包含灭活的葡萄球菌细胞的疫苗组合物，其中利用葡萄球菌细胞制备所述组合物，所述葡萄球菌细胞的特征在于，所述细胞：

[0007] i)是革兰氏阳性球菌；

[0008] ii)至少表达过氧化氢酶；

[0009] iii)诱导免疫应答，所述免疫应答产生至少与葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白结合的抗体；以及

[0010] iv)对抗生素青霉素有抗性。

[0011] 葡萄球菌细菌细胞的特征在于许多生物学和生物化学特征，其包括选择基因(如脲酶和精氨酸双水解酶)的表达、对许多抗生素的敏感性，以及包括能代谢碳水化合物源，减少硝酸盐和甲基甲醇(methyl carbinol)。

[0012] 在本发明优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞还表达凝固酶和/或DNA酶(DNase)。

[0013] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞诱导免疫应答，所述免疫应答产生与胶原蛋白结合蛋白结合的抗体。

[0014] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述灭活的葡萄球菌细胞诱导免疫应答，所述免疫应答产生与二甲氧基苯青霉素抗性、万古霉素抗性和万古霉素中度抗性葡萄球菌种类交叉反应的抗体。

[0015] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞是抗生素邻氯青霉素、红霉素、四环素和庆大霉素敏感的。

[0016] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞选自：上皮葡萄球菌(S.epidermidis)、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌(S.hominis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、头状葡萄球菌(S.capitis)、解糖葡萄球菌(S.saccharolyticus)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)、沃氏葡萄球菌、猪葡萄球菌(S.hyicus)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、鸡葡萄球菌(S.gallinarum)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、人葡萄球菌。

[0017] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞是金黄色葡萄球菌或上皮葡萄球菌。

[0018] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞是抗生素抗性葡萄球菌细胞。

[0019] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述抗生素抗性葡萄球菌细胞是二甲氧基苯青霉素抗性葡萄球菌细胞(MRSA)。

[0020] 在本发明可选的优选实施方案中，所述抗生素抗性葡萄球菌细胞是万古霉素抗性葡萄球菌细菌(VRSA)。

[0021] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述葡萄球菌细胞是称为P/DFO 75的金黄色葡萄球菌细胞(国家典型培养物保藏中心(NationalCollection of Type Cultures(NCTC))，保藏于2007年6月19日；登录号13408；根据1980年修订的关于国际微生物保藏认可的布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the deposit ofMicro-organisms)保藏)。

[0022] 在本发明优选的实施方案中，以不超过约1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0023] 在本发明优选的实施方案中，以不超过约0.45mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0024] 在本发明另一个优选的实施方案中，以至少0.0001mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0025] 在本发明另一个优选的实施方案中，以至少0.1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0026] 在本发明另一个优选的实施方案中，以0.0001-1mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0027] 在本发明另一个优选的实施方案中，以0.1-0.45mg/ml细菌蛋白的蛋白浓度提供所述葡萄球菌细胞。

[0028] 在本发明又一个优选的实施方案中，以0.25-0.36mg/ml细菌蛋白提供所述葡萄球菌细胞。

[0029] 在本发明另一个优选的实施方案中，以约0.35mg/ml细菌蛋白提供所述葡萄球菌细胞。

[0030] 在本发明优选的实施方案中，所述疫苗组合物包含佐剂和/或赋形剂。

[0031] 佐剂是通过调节免疫细胞的活性，增大针对抗原的特定免疫应答的物质或程序。佐剂的实例包括，仅作为实例的，共刺激分子的激动性抗体、弗氏佐剂(Freunds adjuvant)、胞壁酰二肽(muramyl dipeptides)、脂质体。因此，佐剂是免疫调节剂。

[0032] 本发明的疫苗组合物可以经由任何常规途径施用，包括注射、经例如气雾剂或滴鼻液吸入的鼻内喷雾，或随时间输注。施用可以是例如静脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下或透皮。本发明的疫苗组合物以有效量施用。“有效量”是单独或与其它剂量一起产生期望的应答的疫苗组合物的量。在治疗特定细菌疾病的情况下，期望的应答在受到感染剂(infective agent)攻击(challenge)时提供保护。

[0033] 在本发明优选的实施方案中，所述疫苗适于作为鼻喷雾剂施用。

[0034] 在本发明优选的实施方案中，将所述疫苗提供于吸入器中并作为气雾剂递送。

[0035] 本发明另一方面提供了包含本发明疫苗组合物的吸入器。

[0036] 当然，此类疫苗的量，取决于个体患者的参数，包括年龄、身体状况、身高和体重、治疗持续时间、并存治疗(如果有)的性质、具体施用途径以及健康执业者学识和技能范围内的类似因素。这些因素对本领域技术人员而言是公知的，且至多仅常规实验即可处理。

[0037] 通常优选的是，使用足以激发免疫的单个组分或其组合的最大剂量；即，健康医疗判断的最安全剂量。然而，本领域技术人员应当理解，出于医疗原因、心理原因或几乎任何其它原因，患者可以坚持较低剂量或耐受剂量。

[0038] 上述方法中所用的疫苗组合物优选是无菌的，且以适于施用于患者的重量单位或体积单位含有产生期望应答的有效量葡萄球菌。施用于个体的疫苗剂量可以根据不同的参数，特别是根据所用的施用模式和个体状态来选择。其它因素包括期望的治疗时期。如果在所用的初始剂量下，个体的应答不充分，则可以使用的更高剂量(或经不同的、更局限的递送途径的有效更高剂量)的程度是患者耐受允许的程度。

[0039] 通常，根据本领域任何标准程序，以0.1-0.45mg并优选0.15-0.4mg的剂量，配制并施用疫苗剂量。施用疫苗组合物的其它方案对本领域普通技术人员而言是已知的，其中，剂量、注射计划、注射部位、施用模式等随前述而变化。在基本上与上文所述相同的条件下，将疫苗组合物施用于除人以外的哺乳动物(例如，出于检测目的或兽医治疗目的)。本文所用个体是哺乳动物，优选人，并包括非人灵长类动物、牛(cow)、马、猪、绵羊、山羊(goat)、犬、猫或啮齿动物。

[0040] 当施用时，本发明的疫苗组合物以治疗上可接受的量并以治疗上可接受的组合物应用。术语“治疗上可接受的”意指不干扰活性成分生物学活性效力的非毒性材料。此类制剂可以常规地含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体和任选地其它抗菌剂。疫苗组合物可以含有适当的缓冲剂，包括：乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。

[0041] 疫苗组合物也可以任选地含有合适的防腐剂，如氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞(thiomerosal)。

[0042] 适宜非肠道施用的疫苗组合物便利地包含疫苗的无菌水性或非水性制剂，其优选与受体的血液等渗。使用适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂，根据已知的方法，可以配制这种疫苗。无菌可注射制剂也可以是非毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，通常使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单或双甘油酯。另外，可以利用脂肪酸如油酸制备注射剂。适宜皮下、静脉内、肌肉内等施用的载体制剂可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。

[0043] 本发明的优选实施方案提供了本发明的疫苗组合物，其包括至少一种其它抗菌剂。

[0044] 在本发明优选的实施方案中，所述试剂是另一不同的疫苗和/或免疫原性剂(如细菌多肽和/或多糖抗原)。

[0045] 本发明另一方面提供了葡萄球菌细胞，用于制备用于有关细菌感染的动物个体接种的疫苗组合物，其中所述感染不是由葡萄球菌细菌细胞引起的，并且所述葡萄球菌细胞的特征在于，所述细胞：

[0046] i)是革兰氏阳性球菌；

[0047] ii)至少表达过氧化氢酶；

[0048] iii)诱导免疫应答，所述免疫应答产生至少与葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白结合的抗体；

[0049] iv)对抗生素青霉素有抗性。

[0050] 在本发明优选的实施方案中，所述细菌感染是由选自下述的至少一种细菌细胞引起的：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculsis)、B群链球菌(Streptococcus group B)、肺炎链球菌(Streptoccocus pneumoniae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoea)、A群链球菌(Streptococcus group A)、伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)、粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)、荚膜组织孢浆菌(Histoplasma sapsulatum)、爱氏克雷伯氏菌(Klebsiella edwardii)、B型脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis type B)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、沙眼衣原体(Chalmydiatrachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)或类鼻疽伯克氏菌(B.pseudomallei)。

[0051] 本发明另一方面提供了葡萄球菌细胞，用于制备用于有关酵母感染的动物个体接种的疫苗组合物，所述葡萄球菌细胞的特征在于，所述细胞：

[0052] i)是革兰氏阳性球菌；

[0053] ii)至少表达过氧化氢酶；

[0054] iii)诱导免疫应答，所述免疫应答产生至少与葡萄球菌胶原蛋白结合蛋白结合的抗体；

[0055] iv)对抗生素青霉素有抗性。

[0056] 在本发明优选的实施方案中，所述酵母感染是由病原酵母种类如白色念珠菌(Candida albicans)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)引起的。

[0057] 在本发明优选的实施方案中，所述酵母感染与免疫抑制状态有关，例如，HIV感染或施用免疫抑制药物所导致的免疫抑制状态。

[0058] 在本发明优选的实施方案中，所述动物个体是人。

[0059] 本发明另一方面提供了针对细菌感染给动物接种的方法，包括施用有效量本发明的疫苗组合物。

[0060] 在本发明优选的方法中，所述动物是人。

[0061] 在本发明优选的方法中，所述细菌感染是由选自下述的细菌病原体引起的：粪肠球菌、结核分枝杆菌、B群链球菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟菌、A群链球菌、伯氏疏螺旋菌、粗球孢子菌、荚膜组织孢浆菌、爱氏克雷伯氏菌、B型脑膜炎奈瑟菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、大肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、土拉弗朗西斯菌、铜绿假单胞菌、炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌、鼠疫耶尔森菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌或类鼻疽伯克氏菌。

[0062] 在本发明优选的方法中，所述细菌感染是由选自下述的细菌细胞引起的：上皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、头状葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、科氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、猪葡萄球菌、山羊葡萄球菌、鸡葡萄球菌、中间葡萄球菌、人葡萄球菌。

[0063] 在本发明另一个优选的方法中，所述细菌种类是金黄色葡萄球菌或上皮葡萄球菌。

[0064] 在本发明另一个优选的方法中，所述细菌感染是由抗生素抗性细菌细胞优选葡萄球菌细菌细胞引起的。

[0065] 在本发明优选的方法中，所述抗生素抗性葡萄球菌细胞是二甲氧基苯青霉素抗性葡萄球菌种类(MRSA)。

[0066] 在本发明可选的优选方法中，所述抗生素抗性葡萄球菌细胞是万古霉素抗性葡萄球菌细胞(VRSA)。

[0067] 优选的施用途径是皮内、皮下、肌肉内或鼻内(如作为气雾剂)；然而，接种方法并不限于特定的施用模式。

[0068] 在本发明优选的方法中，所述细菌感染导致与葡萄球菌感染有关的疾病。

[0069] 葡萄球菌相关病症可以包括，例如肺结核、细菌相关食物中毒、血液感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、败血症、皮肤病症、脑膜炎、肺炎、胃溃疡、淋病、链球菌性咽喉炎(strep throat)、葡萄球菌相关毒性休克、坏死性筋膜炎、脓疱病、组织胞浆菌病、莱姆病(Lyme disease)、胃肠炎、痢疾、志贺氏菌病以及关节炎。

[0070] 在本发明可选的优选方法中，所述动物是牲畜动物。

[0071] 在本发明优选的方法中，针对革兰氏阳性球菌优选葡萄球菌和/或链球菌细菌细胞引起的细菌性乳腺炎，给所述牲畜动物接种。

[0072] 在本发明优选的方法中，所述细菌性乳腺炎是由金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)引起的。

[0073] 在本发明优选的方法中，所述牲畜动物是山羊(caprine)动物(如绵羊、山羊(goat))。

[0074] 在本发明优选的方法中，所述牲畜动物是牛科动物(如牛)。

[0075] 葡萄球菌乳腺炎是严重的状况，其可以侵袭牲畜并可以导致有关通过施用抗生素控制疾病以及有关乳产量损失的相当大的代价。本发明的疫苗提供了对细菌特别是葡萄球菌乳腺炎的成本有益控制。

[0076] 本发明的另一方面提供了制备杂交瘤细胞系的方法，所述杂交瘤细胞系产生与葡萄球菌细菌多肽结合的单克隆抗体，所述方法包括以下步骤：

[0077] i)给免疫活性哺乳动物接种本发明的疫苗组合物；

[0078] ii)将接种的免疫活性哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；

[0079] iii)筛选步骤(ii)的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的有关葡萄球菌细菌多肽的结合活性；

[0080] iii)克隆杂交瘤细胞并培养所述细胞，以便增殖并分泌所述单克隆抗体；以及[0081] iv)从培养物上清液中回收单克隆抗体。

[0082] 优选地，所述免疫活性哺乳动物是小鼠。可选地，所述免疫活性哺乳动物是大鼠。

[0083] 利用杂交瘤细胞产生单克隆抗体在本领域内是公知的。用来产生单克隆抗体的方法由Kohler和Milstein公开于Nature 256，495-497(1975)中，还由Donillard和Hoffman公开于Schwartz在1981年出版的Compendium of Immunology V(免疫学纲要V)第二版中的“Basic Factsabout Hybridomas(有关杂交瘤的基本事实)”内，将上述文献通过引用并入。

[0084] 本发明一方面提供了由本发明方法所形成的杂交瘤细胞系。

[0085] 本发明的又一方面提供了本发明的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。

[0086] 在本发明优选的实施方案中，所述单克隆抗体是调理素抗体。

[0087] 吞噬作用受巨噬细胞和多形白细胞介导，并涉及微生物、受损或死亡细胞、细胞碎片、不溶性颗粒以及激活的凝血因子的摄取和消化。调理素是促进上述外来物吞噬作用的试剂。调理素抗体因而是提供相同功能的抗体。调理素的实例是抗体的Fc部分或C3补体。

[0088] 在本发明另一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体或优选调理素抗体是嵌合的或者人源化的，其通过重组技术将所述抗体的互补决定区与人抗体恒定(C)区和可变(V)区的框架区两者结合。

[0089] 嵌合抗体是重组抗体，其中，所有小鼠或大鼠抗体的V区都与人抗体的C区结合。人源化的抗体是重组杂交抗体，其将啮齿动物抗体V区的互补决定区与人抗体V区的框架区融合。还使用了人抗体的C区。互补决定区(CDRs)是抗体重链和轻链两者N末端的结构域中的区域，V区的大多数变异限于所述区域。这些区域在抗体分子表面形成环。这些环在抗体和抗原间提供结合表面。非人动物的抗体激发对外源抗体的免疫应答并且将其从循环中移除。当注射于人个体时，嵌合抗体和人源化抗体都具有减少的抗原性，因为重组杂交抗体内啮齿动物(即外源)抗体的量减少，而人抗体区不诱发免疫应答。这导致较弱的免疫应答且抗体的清除减少。

[0090] 本发明另一优选的实施方案提供了所述单克隆抗体的活性结合片段。

[0091] 抗体的各种片段在本领域内是已知的，即Fab、Fab2、F(ab’)2、Fv，Fc、Fd、scFvs等。Fab片段是由免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的免疫活性部分组成的多聚体蛋白，所述活性部分共价偶联在一起，并能特异性结合抗原。Fab片段经完整免疫球蛋白分子的蛋白水解切割(如用木瓜蛋白酶)而产生。Fab2片段包含两个连接的Fab片段。当这些片段由免疫球蛋白铰链区连接时，产生F(ab’)2。Fv片段是由免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的免疫活性部分组成的多聚体蛋白，所述活性部分共价偶联在一起并能特异性结合抗原。片段也可以是单链多肽，该单链多肽含有仅一轻链可变区，或含有轻链可变区3个CDRs的它的片段，而无结合的重链可变区，或含有重链可变区3个CDRs的它的片段，而无结合的轻链部分；以及抗体片段形成的多特异性抗体，这在例如美国专利第
6,248,516号中已有描述。Fv片段或单区(结构域)片段通常经相关确定区(identified regions)在宿主细胞系中表达而产生。这些片段和其它免疫球蛋白或抗体片段在本发明的范围内，并且描述于标准的免疫学教科书中，如Paul，Fundamental Immunology(免疫学基础)或Janeway et al.Immunobiology(免疫生物学)(上文所述)。现在，分子生物学允许(经由细胞内表达或化学方式)直接合成这些片段，以及合成这些片段的组合。抗体的片段也可以具有上文所述的双特异性功能。

[0092] 本发明的优选实施方案提供了通过给人个体接种本发明的疫苗组合物而获得的人血清。

[0093] 本发明的优选实施方案提供给了通过给人个体接种本发明的疫苗组合物而获得的人抗体。

[0094] 在本发明优选的实施方案中，所述人抗体是选自IgA、IgM、IgD、IgE和IgG的同种型。

[0095] 本发明另一方面提供了通过接种本发明的疫苗组合物而获得的人血清在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。

[0096] 在本发明的优选实施方案中，所述细菌感染是葡萄球菌感染。

[0097] 本发明另一方面提供了通过接种本发明的疫苗组合物而获得的人抗体在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。

[0098] 在本发明的优选实施方案中，所述细菌感染是葡萄球菌感染。

[0099] 本发明另一方面提供了制备细菌病原体疫苗的方法，包括如下步骤：

[0100] i)形成细胞培养物制剂，其包含至少一种细菌病原体和包含植物来源产物的营养培养液；

[0101] ii)培养所述细胞培养物制剂；以及

[0102] iii)使所述细胞培养物制剂与灭活所述细菌病原体的试剂接触。

[0103] 在本发明优选的方法中，所述细菌病原体选自：金黄色葡萄球菌、上皮葡萄球菌、粪肠球菌、结核分枝杆菌、B群链球菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、淋病奈瑟菌、A群链球菌、伯氏疏螺旋菌、粗球孢子菌、荚膜组织孢浆菌、爱氏克雷伯氏菌、B型脑膜炎奈瑟菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、大肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、土拉弗朗西斯菌、铜绿假单胞菌、炭疽芽孢杆菌、肉毒梭菌、鼠疫耶尔森菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌或类鼻疽伯克氏菌。

[0104] 在本发明优选的方法中，所述细菌病原体选自：上皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、头状葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、科氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、猪葡萄球菌、山羊葡萄球菌、鸡葡萄球菌、中间葡萄球菌、人葡萄球菌。

[0105] 在本发明优选的方法中，所述细菌病原体是金黄色葡萄球菌或上皮葡萄球菌。

[0106] 在本发明可选的优选方法中，所述细菌病原体选自肺炎链球菌、铜绿假单胞菌或大肠埃希氏菌。

[0107] 在本发明另一个优选的方法中，所述植物来源产物是植物蛋白胨。优选所述植物蛋白胨包括豌豆粉和/或胰蛋白胨大豆(tryptone soya)。

[0108] 在本发明另一个优选的方法中，用氯仿灭活所述细菌病原体。

[0109] 在本发明又一个优选的方法中，从所述细胞培养物制剂中分离所述细菌病原体并冷冻干燥。

[0110] 本发明另一方面提供了产生疫苗的方法，包括如下步骤：

[0111] i)形成包含葡萄球菌细菌细胞的制剂；

[0112] ii)使所述制剂与灭活葡萄球菌细菌细胞的试剂接触；

[0113] iii)分离灭活的葡萄球菌细菌细胞；

[0114] iv)剪切所述制剂以便解聚灭活的细菌；以及任选地

[0115] v)冷冻干燥所述灭活的葡萄球菌细菌细胞。

[0116] 在本发明优选的方法中，所述葡萄球菌细胞选自：上皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、头状葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生葡萄球菌、科氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、猪葡萄球菌、山羊葡萄球菌、鸡葡萄球菌、中间葡萄球菌、人葡萄球菌。

[0117] 在本发明优选的方法中，所述葡萄球菌细菌细胞是金黄色葡萄球菌或上皮葡萄球菌。

[0118] 在本发明另一个优选的方法中，所述试剂是氯仿。

[0119] 在本发明优选的方法中，剪切力(shear force)由杜恩斯匀浆器提供。

[0120] 本发明另一方面提供了以登录号13408保藏的金黄色葡萄球菌。

[0121] 本发明又一方面提供了包含以登录号13408保藏的金黄色葡萄球菌细胞的细菌细胞培养物。

[0122] 在整个本申请文件的说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”以及其变形如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”意指“包括但不限于”，并且非意欲(而且也没有)排除其它部分、添加物、组分、整数或步骤。

[0123] 在整个本申请文件的说明书和权利要求书中，单数包含复数，除非上下文另有要求。特别是，如果使用了不定冠词，本申请文件可以理解为考虑了复数以及单数，除非上下文另有要求。

[0124] 所述特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团，连同本发明的特定方面、实施方案、实施例，应该理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与之冲突。

[0125] 下面仅示例性地，并参考下述附图，对本发明的实施方案进行描述。

[0126] 图1图示安慰剂个体经由蛋白质印迹法的免疫应答。第1天-接种前；第15天-1次接种后；第29天-2次接种后；第43天，3次接种后，以及第57天-4次接种后；

[0127] 图2图示经由蛋白质印迹法的给予0.15mg剂量的个体的免疫应答。第1天-接种前；第15天-1次接种后；第29天-2次接种后；第43天-3次接种后；以及第57天-4次接种后；

[0128] 图3图示经由蛋白质印迹法的给予0.36mg疫苗的个体的免疫应答。第1天-接种前；第15天-1次接种后；第29天-2次接种后；第43天-3次接种后；以及第57天-4次接种后；

[0129] 图4图示经由蛋白质印迹法的给予0.45mg疫苗的个体免疫应答。第1天-接种前；第15天-1次接种后；第29天-2次接种后；第43天-3次接种后；以及第57天-4次接种后；

[0130] 图5图示经由血清蛋白质印迹法的接种前后接种个体和安慰剂个体自基线的平均变化。第1天-接种前；第15天-1次接种后；第29天-2次接种后；第43天-3次接种后；以及第57天-4次接种后；

[0131] 图6图示接种个体和安慰剂个体接种前后，针对血清的胶原蛋白结合蛋白的自基线的平均变化。

[0132] 图7图示针对许多不相关细菌给兔接种所产生的抗血清的交叉反应性；M：分子量标志物；泳道(track)1：大肠埃希氏菌；泳道2：爱氏克雷伯氏菌；泳道3：奇异变形杆菌；泳道4：金黄色葡萄球菌P/DFO 75；泳道5：白色念珠菌；使用将金黄色葡萄球菌P/DFO 75
4次接种于兔后的免疫前血清和超免疫血清；

[0133] 图8图示接种后调理素抗体的产生；个体2、6、9和21是安慰剂个体；第一天的样品是接种前的样品；第57天是4次接种后。个体19、23、24、29、30是给予0.45mg疫苗的个体。个体3给予了0.15mg疫苗。

[0134] 表1概括了施用于个体的疫苗的局部效果；

[0135] 表2概括了施用于个体的疫苗的全身性效果；

[0136] 表3概括了接种个体和安慰剂个体血清经蛋白质印迹法的免疫反应性。

[0137] 表4说明接种个体和安慰剂个体存在胶原蛋白结合蛋白的抗体。

[0138] 表5说明接种个体中免疫应答的寿命。

[0139] 材料和方法

[0140] 细胞培养和疫苗制备

[0141] 将细菌培养于胰蛋白胨大豆培养液中，并与10％甘油混合、等分试样并在-70℃以液体形式和冷冻干燥后在+4℃储存为主种子库(MasterSeed Bank)和工作种子库(Working Seed Bank)。通过从工作种子库的一小瓶接种细菌并于37℃在胰蛋白胨大豆琼脂平板上培养16小时，制备细菌。随后将细菌生长物收获于小体积胰蛋白胨大豆培养液中，所述小体积胰蛋白胨大豆培养液反过来用于接种更大体积的胰蛋白胨大豆培养液。接种液体培养物，同时37℃下振荡16小时。随后通过离心将细菌浓缩。用胰蛋白胨大豆培养液调整浓度，以培养物和氯仿之比5∶3，用氯仿振荡培养物，并于20℃静置15-20分钟，以允许相分离。收集上层细菌悬浮液，3-4000rpm离心15分钟，并将沉淀重悬浮于无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液中。如上所述，将其再次离心并将沉淀重悬浮。

[0142] 可选地，将葡萄球菌菌株分离于植物蛋白胨琼脂中，并在植物蛋白胨琼脂中传代培养3次。37℃下将细菌的液体培养物在植物蛋白胨培养液中培养16小时，用氯仿振荡，并于20℃静置15-20分钟，以允许相分离。收集上层细菌悬浮液，离心，并将沉淀重悬浮于水或磷酸盐缓冲液中，如上文所述，离心并重悬浮。

[0143] 任选地，将用氯仿灭活、洗涤并重悬浮于相关培养基中的葡萄球菌制剂直接冷冻并冷冻干燥，进行保存。实施例

[0144] 由挪威奥斯陆的挪威公共卫生研究所(Norwegian Institute of PublicHealth)根据良好生产规范(Good Manufacturing Practice，GMP)制备疫苗和安慰剂磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，并由英国梅瑟蒂德菲尔的Simbec Research Limited(Simbec Research Limited，Merthyr Tydfil，UK)进行双盲安慰剂对照I期临床试验。由瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院(Karolinska Institute，Stockholm，Sweden)的Jan-Ingmar Flock教授根据GLP在VRI实验室的房间内进行志愿者血浆检测。

[0145] 将48名年龄18岁至55岁的男性志愿者分成3组，接受皮下剂量的含有0.15mg、0.36mg或0.45mg蛋白的疫苗SA75。在每一组中，12名志愿者接受疫苗，4名志愿者接受相应的安慰剂磷酸盐缓冲液(PBS)。以两周间隔，总计进行4次接种。剂量给药后，志愿者在临床试验单元停留8小时，并在剂量给药当天以及剂量给药后第2、第3和第8天，监控局部反应(红斑、硬化、肿胀、出血、温热、灼热、瘙痒以及疼痛)和全身性反应(不适、疲劳、流感样症状、感觉热或冷、呕吐以及头痛)。也进行血压、ECG、温度、尿检、血液学检测和生化检测。在第一次接种前以及随后4次接种的每次接种2周后，采集用来评估免疫应答的血液样品。

[0146] 针对氯仿灭活的同源全生物，通过ELISA和蛋白质印迹法，检测接种前后志愿者的血清，评估对全生物的免疫应答。也通过ELISA检测血清中胶原蛋白结合蛋白抗体、纤维蛋白原结合蛋白抗体、纤连蛋白结合蛋白抗体以及细胞外黏附蛋白抗体的存在(Jan-Ingmar Flock教授)。

[0147] 如用全细胞疫苗所预料的，在接种个体的注射部位观察到短暂的局部反应。存在明显的剂量相关应答，且0.15mg和0.36mg剂量表明可接受的温和到适中水平的局部反应。基于更显著的局部反应，0.45mg的剂量被认为是最大耐受剂量。0.45mg剂量组的一名个体具有严重的局部反应，这导致其退出本研究(表1)。

[0148] 不存在可归因于0.15mg和0.36mg蛋白剂量的疫苗的显著的全身性副作用。在0.45mg的更高剂量，发热的发生率增加，报道4名个体体温温和增加。3名接受0.45mg剂量的个体经历一般性不适，其中2个分级为温和，一个分级为严重。在安慰剂组、0.15mg组和0.36mg组中未观察到发热或不适。在本研究的过程中，多次报道了0.45mg剂量组四肢的温和至适中疼痛。仅报道了一次严重疼痛。在包括安慰剂组的所有组中，都报道了总是温和到适中的头痛，并且头痛随着剂量水平的增加而增加(表2)。

[0149] 报道了在接种后几个小时至几天的时间段的所有不利事件，并且所有不利事件都是短暂的，持续几个小时到几天。

[0150] 根据蛋白质印迹法，与安慰剂个体中没有相比，75％的接种个体表现了强反应性(p＜0.0001)，其中，强反应性被认为是，与接种前的血清相比，接种后血清中多肽反应性在强度或数量方面有5次或更多次增加事件。弱反应性被认为是，与接种前的血清相比，接种后血清中多肽反应性在强度或数量方面增加小于4次；表3和图1、图2、图3、图4。

[0151] 应答是剂量相关的且在血清免疫反应性和接种数量间存在明显关联；图5。

[0152] 随着应答者数目随接种数量增加，胶原蛋白结合蛋白抗体的水平在接种个体中显著增加(p0.005)；表4和图6。检测的其它结合蛋白的抗体没有显著增加。

[0153] 当以正规的毒理学试验在兔中检测时，称为SA75的氯仿灭活的金黄色葡萄球菌疫苗经证明是安全的，且产生了利用在兔中进行的ELISA和蛋白质印迹法所证明的免疫应答。这和其它附加数据随后允许在人志愿者的双盲安慰剂对照试验中施用该疫苗。SA75疫苗经证明是安全的且在男性志愿者中产生了免疫应答。

[0154] 在临床试验过程中所观察的生命体征、ECG参数或实验室安全检测中，没有临床上显著的变化。通常，对于接种数量或给予的剂量，全身性应答并无差异。

[0155] 局部反应性和报道的疫苗剂量水平间存在明显关联，局部反应在任何剂量水平的不同接种间无可辨的差别。接种剂量、频率和红斑性反应(erythematous reaction)程度间也存在关联，但这与所给予的接种数量无关。就安全性而言，0.15mg和0.36mg剂量被认为是可以接受的。

[0156] 与接受安慰剂的个体相比，ELISA和蛋白质印迹所测量的免疫应答表明，接种个体免疫应答的频率明显不同。

[0157] 交叉反应性

[0158] 图7图示免疫印迹，并表示用葡萄球菌疫苗接种前(标记的兔19 PI)和4次接种后(4次接种后标记的兔19)的兔的活性。

[0159] 调理素抗体

[0160] 图8展示接受接种的6名患者和接受安慰剂接种的4名患者的调理素抗体应答。在接种的患者中，调理素抗体水平增加，但仅在1名患者即患者2(安慰剂)中，调理素抗体水平显著些地增加。当然完全有可能是，该患者患有间发的葡萄球菌感染，这可解释该结果。

[0161] 如所预料的，存在针对同源葡萄球菌菌株的非常显著的免疫应答，所述同源葡萄球菌菌株用来制备右侧倒数第二柱中的疫苗。在针对大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌(Klebsiella)和变形杆菌(Proteus)的接种血清中，存在新的免疫反应带，所述大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌(Klebsiella)和变形杆菌是造成包括伤口感染的种类繁多的人类感染的病原体，因此，可以合理地展望，该疫苗提供不但防葡萄球菌伤口感染，而且防所述这3种微生物以及很可能其它否则所有病原微生物造成的其它感染的保护作用。所关心的是，接种的血清已开发了针对白色念珠菌的抗体(白色念珠菌是酵母感染特别是女性个体酵母感染的常见原因)，这是特别关心的，因为白色念珠菌是真核生物，而葡萄球菌和所检测的其它生物是原核生物。基于我们的准备性方法，最后的观察资料增加了通用疫苗可行性的权重。

[0162] 寿命

[0163] 表5说明，接种后3-6个月，由我们认为是免疫应答的最有用指示器的免疫印迹法所判定的免疫应答保持且与疫苗剂量无关。该表未说明一重要方面，即在3个月和6个月，免疫应答非显著地下降，且显然，至该时间，没有个体返回接种前的状态。令人遗憾的是，试验方案不允许评估6个月之后的抗体水平，这可能是我们研究设计中的失误。

[0164] 接受安慰剂接种且当然具有针对葡萄球菌抗原的基线水平的抗体反应性(其在每个个体中都获得)的个体，在3-6个月内无变化，这表明通常在人个体中有趣地缺少可变性，并增加接种个体免疫反应性明确增加的权重。