组合物及检测方法转让专利
申请号 : CN200880019228.8
文献号 : CN101730847A
文献日 : 2010-06-09
发明人 : D·J·帕克 , Z·卡恩 , K·F·波特
申请人 : 分类生物系统有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.用于检测HPV毒株和/或用于区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合,其中所述珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与珠粒子集中其它被标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出一种或多种特异性HPV毒株。
2.权利要求1的珠粒集合,其中所述珠粒尺寸选自:3.0μm、3.5μm、4.1μm、5.0μm、
5.6μm和6.8μm。
3.权利要求1的珠粒集合,其中所述珠粒尺寸选自:3.0μm、3.5μm、3.77μm、5.0μm、
5.6μm和6.8μm。
4.权利要求1-3中任一项的珠粒集合,其中所述被标记的珠粒用选自以下的荧光染料标记:羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、cascade蓝、萤光黄、NBD、藻红蛋白(PE)、PerCP、别蓝蛋白、Hoechst33342、DAP1、SYTOX蓝、Hoechst 33258、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、SYTOX绿、SYTOX橙、7-AAD、吖啶橙、TOTO-1、To-PRO-1、噻唑橙、TOTO-3、TO-PRO-3、LDS 751、Alexa Fluro-350、AlexaFluro-430、Alexa Fluro-488、Alexa Fluro-532、Alexa Fluro-546、AlexaFluro-555、Alexa Fluro-556、Alexa Fluro-594、Alexa Fluro-633、AlexaFluro-647、Alexa Fluro-660、Alexa Fluro-680、Alexa Fluro-700和AlexaFluro-750、BoDipy 630/650和BoDipy 650/665、CY染料Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7、6-FAM(荧光素)、PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT、六氯荧光素(Hex)、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、Oregon绿染料488-X和514、罗丹明染料X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX、TRITC、四甲基罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、四氯荧光素(TET)、Red 6B、FluorX、BODIPY-FL、SYBR绿I染料和德克萨斯红。
5.权利要求4的珠粒集合,其中所述被标记的珠粒用TMR标记。
6.权利要求1的珠粒集合,其包含2-17个珠粒家族。
7.权利要求1-6中任一项的珠粒集合,其中所述珠粒集合包含17个珠粒家族。
8.权利要求1的珠粒集合,其中所述两种或更多种HPV毒株选自毒株6、11、16、18、31、
33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。
9.权利要求1的珠粒集合,其中所述核酸捕获探针选自表2中的序列名单。
10.用于制备用于检测HPV毒株和/或区分两种或更多种HPV毒株的珠粒集合的方法,所述方法包括基于尺寸、荧光强度或这二者选出多个珠粒家族或珠粒子集,所述方法包括:提供
(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;并且每一珠粒家族对检测HPV毒株都是特异性的,其不同于珠粒集合内的任何其它珠粒家族;和混合
至少两个珠粒家族或至少两个珠粒子集以产生珠粒集合,所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出特异性HPV毒株。
11.用于诊断人受检者HPV感染的方法,所述方法包括:
(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记;
(vi)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与特定反应物的缔合表明HPV感染所述人受检者。
12.用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病风险的方法,所述方法包括:(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记;
(vi)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者中所述疾病风险增加,所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。
13.用于诊断人受检者HPV感染的方法,所述方法包括:
(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合的各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种信号寡核苷酸序列存在下发生;和(vi)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与特定反应物的缔合表明HPV感染所述人受检者。
14.权利要求13的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
15.用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病风险的方法,所述方法包括:(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合的各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种信号寡核苷酸序列存在下发生;和(vi)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者中所述疾病风险增加,所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。
16.权利要求15的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
17.用于诊断人受检者HPV感染的方法,所述方法包括:
(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记;
(vi)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合的各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种阻断寡核苷酸序列存在下发生;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与特定反应物的缔合表明HPV感染所述人受检者。
18.权利要求17的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
19.用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病风险的方法,所述方法包括:(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多种扩增子进行标记;
(vi)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合的各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种阻断寡核苷酸序列存在下发生;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者中所述疾病风险增加,所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。
20.权利要求19的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
21.用于诊断人受检者HPV感染的方法,所述方法包括:
(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中所述珠粒集合的各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种信号寡核苷酸序列和至少一种阻断寡核苷酸序列存在下发生;和(vi)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与特定反应物的缔合表明HPV感染所述人受检者。
22.权利要求13的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
23.用于测定人受检者发展与一种或多种HPV毒株有关的疾病风险的方法,所述方法包括:(i)从被推定包含HPV的所述人受检者获得生物学样品;
(ii)从所述样品分离出核酸;
(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株是独特的;
(iv)任选地扩增来自所述人受检者基因组DNA的对照核酸序列;
(v)使所述一种或多种被标记的扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合,并且其中所述杂交在至少一种信号寡核苷酸序列和至少一种阻断寡核苷酸序列存在下发生;和(vi)测定反应物中哪一种与扩增子结合;
其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者所述疾病风险增加,所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。
24.权利要求13的方法,其中所述反应物珠粒集合包含多个珠粒家族或多个珠粒子集,所述珠粒集合含有:(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;并且其中:
所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
25.用于靶向致癌HPV的寡核苷酸扩增引物对,其中所述引物对的正向引物选自:TR TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY A;
CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GAT A;
CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA;
AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTK GT;
TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG;
TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG;
GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC和
GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA;
而所述引物对的反向引物选自:
TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCATG;
CAY ARY TGA AAA ATA AAY TGY AAA TC;
TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG;和
TR CAY ARY TGA AAA ATA AA;
其中所述正向引物和反向引物各自任选地在所述引物5’端与后跟缀合。
26.权利要求25的引物对,其中所述正向引物和反向引物中至少之一在所述引物的5’端与后跟缀合。
27.权利要求25的引物对,其中所述正向引物后跟选自:
CAATCAGC、ACAAT、GGAACAAT、GGAAC、CAGCTT、ATTACC、CTGTT、/5Phos/CAATCAGC、/5Phos/ACAAT、/5Phos/GGAACAAT、/5Phos/GGAAC、/5Phos/CAGCTT、5Phos/ATTACC和/5Phos/CTGTT。
28.权利要求25的引物对,其中所述反向引物后跟选自:
ACTCACTATAGG、AATACGACTCACTATAGG、TCTAATACGACTCACTATAGG、AATTCTAATACGACTCACTATAGG、/5AmMC6/ACTCACTATAGG、/5AmMC6/AATACGACTCACTATAGG、/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG和/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGG。
29.权利要求25的寡核苷酸扩增引物对,其含有任选的后跟核酸序列,其中所述引物对的正向引物选自:CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA,其任选地具有与所述引物的5’端缀合的ACAAT、/5Phos/ACAAT、GGAACAAT或/5Phos/GGAACAAT;和GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA,其任选地具有与所述引物的5’端缀合的CTGTT或/5Phos/CTGTT。
30.权利要求25的寡核苷酸扩增引物对,其含有任选的后跟核酸序列,其中所述引物对的反向引物选自:TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCATG,其任选地具有与所述引物的5’端缀合的ACTCACTATAGG或/5AmMC6/ACTCACTATAGG;
TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG,其任选地具有与所述引物的5’端缀合的TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG;和TR CAY ARY TGA AAA ATA AAY TG,其任选地具有与所述引物的5’端缀合的TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG。
说明书 :
组合物及检测方法
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发明领域
发明背景
发明简述
结合的样品中的分析物。
HPV毒株。
酸捕获探针缀合,或任选与对照核酸序列缀合;(c)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记,以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物;和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合,其中可由基于尺寸、荧光强度和序列区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身,从而鉴定出HPV毒株。
的与所述珠粒结合的扩增子(amplicon),从而鉴定出或区分两种或更多种HPV毒株。
(a)至少两个珠粒子集,其中每一珠粒子集可基于至少尺寸与任何其它珠粒子集从物理化学上区分开;或(b)至少一个具有至少两个家族的珠粒子集,其中所述珠粒子集中的珠粒彼此尺寸均一,并可基于各自含有的标记水平从物理化学上区分为两个或更多个珠粒家
族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;和其中:所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶
联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与珠粒子集中其它被标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对HPV毒株的检测都是特异性的,其不同于所述珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定一种或多种特异性HPV毒株。
族;或(c)所述珠粒家族与所述珠粒子集的组合;和其中:所述子集的各珠粒家族内的珠粒每一个都与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域的任选被标记的核酸捕获探针偶
联,或任选与至少一种对照核酸序列偶联,前提是任何核酸捕获探针或对照核酸序列用与所述珠粒子集中其它标记的捕获探针或对照核酸序列相同的标记物标记,并且在任何单个珠粒子集内,其各珠粒家族具有不同荧光强度;和每一珠粒家族对检测HPV毒株都是特异性的,其不同于珠粒集合内的任何其它珠粒家族;其中所述珠粒集合能够通过用流式细胞术分析至少一个珠粒家族或珠粒子集的珠粒尺寸、荧光强度或序列差异来鉴定出一种或多种特异性HPV毒株。
39、45、51、52、56、58、59、66和68的至少16个珠粒子集及通常一个对照珠粒集合。合适的捕获探针为列入表2中的探针。
FITC 异硫氰酸荧光素
HEX 六氯荧光素
HIV 人免疫缺陷病毒
缩写 说明
HPV 人乳头瘤病毒
JOE 7’-二甲氧基荧光素
PCR 聚合酶链式反应
PE 藻红素
PMT 光电倍增管
QD 量子点
TAMRA 羧基四甲基罗丹明
TET 四氯荧光素
TMR 四甲基罗丹明
VRE 万古霉素耐药肠球菌
GP5+ TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GP6+ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
GP5d+ TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC
GP6d+ GAAAHATAAAYTGYAADTCATAYTC
GP5+(5Phos) /5Phos/TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
GP6+(5AmMC6) /5AmMC6/GAAAAATAAACTGTAAATCAT
ATTC
GP5d+(5Phos) /5Phos/TTTKTTACHGTKGTDGATACYAC
GP6d+(5AmMC6) /5AmMC6/GAAAHATAAAYTGYAADTCATAY
TC
PCR引物序列
GP5d2+ TTTKTTACHGTKGTDGATACHAC-3′
T7aGP6d+(后跟GP6d+) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGA
AAHATAAAYTGYAADTCATAYTC
GP5d3+ TTTGTTACHGTDGTDGAYACHAC
T7aGP6d+*(后跟GP6d+) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGA
AAHATAAAYTGYARDTCAWAYTC
GP5d2+(5Phos) /5Phos/TTTKTTACHGTKGTDGATACHAC-
3′
T7aGP6d+(后跟GP6d+) /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT
(5AmMC6) AGGGGAAAHATAAAYTGYAADTCA
TAYTC
GP5d3+(5Phos) 5PhosTTTGTTACHGTDGTDGAYACHAC
T7aGP6d+*(5AmMC6) /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT
AGGGGAAAHATAAAYTGYARDTCA
WAYTC
mlc1_95f GGCACCCAGACAATACAC
T7amlc1_275r(后跟MLCR) AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTA
AGTTGAAGAGGTGAAGAA
mlc1_95f(5Phos) /5Phos/GGCACCCAGACAATACAC
T7amlc1_275r(后跟MLCR) /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT
(5AmMC6) AGGGTAAGTTGAAGAGGTGAAGAA
GBHPVf1 /5Phos/caatcagcTRTTTGTTACTGTKGTD
GATACYA
GBHPVf2 /5Phos/acaatCARYTRTTTGTTACTGTKGTD
GATA
GBHPVf3 /5Phos/acaatCARYTRTTTGTTACTGTKGTD
GA
GBHPVf3+ /5Phos/ggaacaatCARYTRTTTGTTACTGTK
GTDGA
GBHPVf4 /
5Phos/ggaacAAYCARYTRTTTGTTACTGTK
GT
GBHPVf5 /5Phos/cagcttTTTGTTACTGTKGTDGAT
ACYACHCG
GBHPVf6 /5Phos/cagcttTTTGTTACTGTKGTDGAT
ACYACHCGYAG
GBHPVf7 /5Phos/attaccGTKGTDGATACYACHCG
YAGTAC
GBHPVf8 /5Phos/ctgttGTDGATACYACHCGYAGTAC
HAA
GBHPVr1 /5AmMC6/actcactataggTGAAAAATAAAY
TGYAAATCATATTCYTCMMCATG
GBHPVr2 /5AmMC6/aatacgactcactataggCAYARYTGA
AAAATAAAYTGYAAATC
GBHPVr3 /5AmMC6/tctaatacgactcactataggTRCAYARY
TGAAAAATAAAYTG
GBHPVr4 /5AmMC6/aattctaatacgactcactataggTRCAYARY
TGAAAAATAAA
捕获探针序列
探针6: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACATCCGTAACTACATCTTCCACAT
ACACCAA
探针11: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACATCTGTGTCTAAATCTGCTACAT
ACACTAA
探针16: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACGTCATTATGTGCTGCCATATCTA
CTTCAGA
探针18b: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACCTCCTGTACCTGGGCAATATGA
TGCTACCA
探针31: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTGTTTGTGCTGCAATTGCAA
ACAGTGATAC
探针33: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTTTATGCACACAAGTAACTA
GTGACAGTAC
探针35: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACGTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTT
CTAGTGA
探针39: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTCTACCTCTATAGAGTCTTCCAT
ACCTTCT
探针45: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACACACAAAATCCTGTGCCAAG
TACATATGAC
TATGGACCTCCTGTACCTGGGCAATATGA
TGCTACCA
探针51: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACAGCACTGCCACTGCTGCGGT
TTCCCCAACA
探针52: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTGCTGAGGTTAAAAAGGAAA
GCACATATAA
探针56: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACGTACTGCTACAGAACAGTTA
AGTAAATATG
探针58b: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACGCACTGAAGTAACTAAGGAAGG
TAC
探针59: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA
TGTATAC
探针66: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTATTAATGCAGCTAAAAGCA
CATTAACTAA
探针68: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTCTACTACTACTGAATCAGCTGT
ACCAAAT
探针68b: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACTCCACTACTACAGACTCTACTG
TACCA
探针MLC_Int: /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGC
TATGGACCAAACACAGACACAGAGAGA
CCCACAGACA
*其中
阴影碱基对应于差异。
信号寡核苷酸序列
HPV信号a: /5AmMC6/TTTTTTCATGKKGARGAR
TATGA/3Phos/
HPV信号b: /5AmMC6/TTTTTTCATGKKGARGAR
TAT/3Phos/
MLC信号a: /5AmMC6/TTTTTTACAGACACAGAC
AAC/3Phos/
MLC信号b: /5AmMC6/TTTTTTACAGACACAGAC
AACA/3Phos/
HPV信号a: /5AmMC6/TTTTTTCATGKKGARGAR
TATGA/3Phos/
MLC信号c: /5AmMC6/TTTTTTACAGACACAGAC
AACAC/3Phos/
附图简述
为对照。引物GP6+和LC1_R包含掺入到所产生的扩增子中的荧光标记物。
子宫颈癌)的风险的方法。
物结合的样品中的分析物。
spp.)、反刍动物细菌)、昆虫的共生微生物(例如链霉菌(Streptomyces spp.)、沃尔巴克氏体(Wolbachia spp.))、海绵动物的共生微生物(例如绿藻、沟鞭藻类、蓝细菌)等;植物的内生物(例如菌根、根瘤菌(Rhizobium spp.)、弗兰克氏菌(Frankia spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.));等等。此外,分析物可为与多细胞生物体不相关的分析物。这样的分析物包括细菌、真菌、病毒、原生生物、线虫等,它们群集在特定的环境中,包括:“自然”环境,例如土壤、海洋、淡水、冰、岩石、热水流火山口和空气;卫生保健环境,包括医院、医院设施、手术设备、卫生保健人员工作服等;“工业”环境,包括制造厂、药厂、酿酒厂、葡萄酒酿酒厂等;“实验室”环境,包括发酵罐、培养物、实验台、设备等。
HLTV-IV在内的HIV、一般慢病毒、肝炎病毒等;性传播疾病病原体,例如衣原体、淋病、支原体(Mycoplasma spp.)和梅毒;食物传源性病原体,例如李斯特氏菌(Listeria spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌(E.coli)(特别是大肠杆菌HO 567)、志贺氏
菌(Shigella spp.)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus);医院感染性病原体,例如包括甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌(MRSA)在内的金黄色葡萄球菌和包括万古霉素耐药性肠球菌(VRE)在内的肠球菌;环境获得性病原体,例如军团菌(Legionella spp.)、贾第虫(Giardia spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium
spp)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthacis)(炭疽)等。
发生树。
导致形成最高级别的可发展为癌的上皮内病灶,尤其是在肛门生殖器和/或粘膜类别中的HPV。
发生感染。一直都没有研究表明HPV感染是溶细胞的,更合适地说是毒粒由于脱落细胞
(desquamating cell)退化而释放。此外,HPV病毒可在没有宿主时在低温下存活很多个
月。
因组通常整合到宿主细胞DNA中。然而,本发明延伸至任何HPV毒株,包括但不限于毒株
6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。病毒基因组整合到宿主细胞基因组被认为是恶性转化的特征。已经证明高危血清型HPV蛋白E6和E7使宿主肿瘤抑制蛋白
p53和Rb失活,从而导致宿主细胞增殖失控和恶性转化。
反应物包被的珠粒集合杂交,其中珠粒集合的每一成员都包含与特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,所述核酸分子与可从物理化学上区分的珠粒结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;其中扩增子与特定反应物的缔合表明样品中存在特定HPV毒株。
RNA(在利用反转录酶情况下)。因此,本发明涵盖了含RNA或DNA或其化学类似物的珠粒。
分析物“毒株”的实例包括分析物的亚种、具不同毒力水平的分析物变种、当感染或群集于宿主时显示不同预后的分析物变种、分析物的生化变种等。
者癌症(包括子宫颈癌)有关的任何HPV毒株。如上所述,决不限制本发明的例示性高危
HPV毒株包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。用于这些HPV毒株的珠粒上的合适的捕获探针如表2所示。术语“探针”和“引物”在本文中可交互使用。“低危”HPV毒株包括与增加人受检者癌症风险无关或关系不大的毒株。通常低危HPV毒株为
形成疣的毒株,包括HPV6和HPV11。
(a)各子集的珠粒尺寸均一;(b)各子集内的珠粒与能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性
区域的核酸捕获探针偶联,或任选与对照核酸序列偶联;(c)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记,以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物;和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合,其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区分的流式细胞术来鉴定出所述子集本身,从而鉴定出HPV毒株。
增子,所述扩增子与所述珠粒结合从而鉴定出或区分两种或更多种HPV毒株。
况下分离DNA,但例如当目标分析物为RNA病毒时,更优选分离RNA。若分离RNA,则可扩增RNA,或可用标准方法将RNA逆转录为cDNA,用于随后的扩增和分析。
1992)。基于胍的溶解液也可从供应商例如Qiagen(例如QIAamp)、PAXgene等市购。然而,溶解方法可视样品和分析物的性质而变化。例如,对于检测环境样品例如土壤或沉淀样品中的分析物而言,基于玻璃珠的细胞溶解系统更适当,例如Kuske等的方法(Appl.Environ.Microbiol.64(7):2463-2472,1998)。在任何情况下,本领域一般技术人员不用经历不恰当实验就能轻易地决定用于既定分析物和样品的适当的溶解方案。
剂(例如但不限于二氧化硅)来纯化DNA。通过使用有限量的DNA结合剂,可从不同样品分
离出一致量的DNA,因为在每种情况下回收的DNA量都等于可由所述有限量的DNA结合剂
所结合的DNA的最大量。随后可回收与DNA结合剂结合的DNA,或用任何方便的手段从DNA
结合剂洗脱DNA。
术包括Ambion TechnicalBulletin#183中提出的技术(www.ambion.com/techlib/tb/tb
183.html)。此外,在www.ambion.com/techlib/basics/products/rnaisol compchart.
html中提出适用于多种样品类型的大量例示性的RNA分离试剂盒。然而,应该理解,本发明决不受这些用于RNA分离和纯化的特定方法和试剂盒的限制,本发明可使用本领域技术人员显而易见的任何RNA分离方法。
(a)各子集的珠粒尺寸均一;(b)各子集内的珠粒与选自表2所列的核酸捕获探针偶联,所述探针能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域或任选的对照核酸序列;(c)各珠粒上
的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记,以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物;和(d)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合,其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身,从而鉴定出HPV毒株。
偶联,该探针能够结合HPV基因组的HPV毒株特异性区域或任选的对照核酸序列;(iii)各珠粒上的捕获探针用具有不同荧光强度的与各珠粒子集相同的标记物来标记,以形成基于荧光强度不均一的珠粒混合物;和(iv)至少两个珠粒子集混合以形成珠粒集合,其中可由基于尺寸、荧光强度和分析物区别的流式细胞术来鉴定出所述子集本身,从而鉴定出HPV毒株;(b)使所述珠粒集合与所述样品在以下条件下孵育一段时间:所述条件足以使所述引物与被扩增以产生包含毒株特异性区域的复制子的HPV基因组结合;和(c)检测和/或
区分样品中产生的扩增子,所述扩增子与所述珠粒结合从而鉴定出或区分两种或更多种
HPV毒株。
94、95、96、97、98、99和100%。
跟的5’端与5Phos或5AmMC6部分缀合。在某些优选实施方案中,与正向引物缀合的后
跟选自:caatcagc、acaat、ggaac、cagctt、attacc和ctgtt,更优选acaat和ctgtt。在其它优选实施方案中,与反向引物缀合的后跟选自:actcactatagg、aatacgactcactatagg、tctaatacgactcactatagg 和 aattctaatacgactcactatagg, 更 优 选 actcactatagg 和
tctaatacgactcactatagg。
/5Phos/ggaac AAY CAR YTR TTT GTT ACT GTK GT;/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCG;/5Phos/cagctt TTT GTT ACT GTK GTD GAT ACY AC HCGYAG;/5Phos/
attacc GTK GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC;和/5Phos/ctgtt GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA;引物对的反向引物选自:/5AmMC6/actcactatagg TGA AAA ATA AAY TGY AAA
TCATAT TCY TCM MCA TG;/5AmMC6/aatacgactcactatagg CAY ARY TGA AAA ATA AAYTGY AAA TC;/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg TR CAY ARY TGA AAA ATAAAY TG;和/5AmMC6/aattctaatacgactcactatagg TR CAY ARY TGA AAAATA AA。如上所示,引物以大写字母表示,在每种情况下任选的后跟以下划线的小写字母表示。优选引物对的正向引物选自:/5Phos/acaat CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA和/5Phos/ctgttGTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA。在其它优选实施方案中,引物对的反向引物选自:/5AmMC6/actcactatagg TGA AAA ATA AAYTGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG和/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg TR CAY ARY
TGA AAA ATA AAYTG。
物 后 跟 选 自:CAATCAGC、ACAAT、GGAACAAT、GGAAC、CAGCTT、ATTACC、CTGTT、/5Phos/CAATCAGC、/5Phos/ACAAT、/5Phos/GGAACAAT、/5Phos/GGAAC、/5Phos/CAGCTT、5Phos/
ATTACC和/5Phos/CTGTT。优选当反向引物以所述反向引物的5’端与后跟缀合时,该
反向 引物 后跟 选自:ACTCACTATAGG、AATACGACTCACTATAGG、TCTAATACGACTCACTATAGG、AATTCTAATACGACTCACTATAGG、/5AmMC6/ACTCACTATAGG、/5AmMC6/AATACGACTCACTATAGG、
/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG和/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGG。在含有任选
的后跟核酸序列的寡核苷酸扩增引物对的某些更优选实施方案中,所述引物对的正向引物选自:CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA,其任选地具有与所述引物5’端缀合的ACAAT、/5Phos/ACAAT、GGAACAAT或/5Phos/GGAACAAT;和GTD GAT ACY AC HCG YAG TAC HAA,
其任选地具有与所述引物5’端缀合的CTGTT或/5Phos/CTGTT。在某些含有任选的后跟
核酸序列的寡核苷酸扩增引物对的更优选实施方案中,所述引物对的反向引物选自:TGA AAA ATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCATG,其任选地具有与所述引物5’端缀合的
ACTCACTATAGG或/5AmMC6/ACTCACTATAGG;TR CAY ARY TGA AAA ATA AAYTG,其任选地具有与所述引物5’端缀合的TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG;
和TR CAY ARY TGAAAA ATA A(SEQ ID NO:12),其任选地具有与所述引物5’端缀合的
TCTAATACGACTCACTATAGG或/5AmMC6/TCTAATACGACTCACTATAGG。
序列掺入到扩增产物中。随后,5′后跟序列起夹子作用以使扩增子同源物间的扩增效率均等。
包括但不限于PCR线性聚合酶反应、NASBA、滚环扩增等,其公开于以下参考文献(在此引作参考)中:Mullis等,美国专利第4,683,195号;第4,965,188号;第4,683,202号;第
4,800,159(PCR)号;Gelfand等,美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq”[注册商标]探针进行的实时PCR);Wittwer等,美国专利第6,174,670号;Kacian等,美国专利第5,399,491号(“NASBA”);Lizardi,美国专利第5,854,033号;Aono等,日本专利公开第JP 4-262799号(滚环扩增);等等。
25、甚至更优选约10-约20个碱基。
或缺失进行比对和比较)时,认为这两条单独的RNA或DNA分子链基本上互补。或者,当例如DNA链在选择性杂交条件下能与其互补物杂交时,就存在基本上互补。当在至少为14-25个核苷酸的片段内存在至少约65%互补、优选至少约75%、更优选至少约90%互补时,通常发生选择性杂交。参见Kanehisa Nucleic Acids Res.12:203,1984,该文以其整体在此引作参考。
千个核苷酸(例如1000-10,000或1000-3000)。在某些上下文中,遗传基因座可指基因组
内核苷酸的位置。
通常寡核苷酸或多核苷酸为单链,并通常由5′-端或3′-端与固相支持体共价连接。微
2 2
阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm,更优选大于1000/cm。微阵列技术
公开于以下参考文献中:Schena编辑的Microarrays:A PracticalApproach(IRL Press,Oxford,2000);Southern,Current Opin.Chem.Biol.,2:404-410,1998,其全部内容通过引用结合到本文中。
拷贝或复制物的反应,这样的反应包括以下步骤的一次或多次重复:(i)使靶核酸变性,(ii)使引物退火至引物结合位点和(iii)在三磷酸核苷存在下通过核酸聚合酶延伸引
物。反应通常在热循环仪中通过最适合每一步的不同温度来循环。具体温度、每一步的
持续时间以及各步之间的变化速率取决于本领域一般技术人员熟知的多种因素,例如由
以下文献举例的因素:McPherson等(编辑),PCR:A Practical Approach and PCR2:A PracticalApproach(IRL Press,Oxford,分别1991和1995)。例如,在使用TaqDNA聚合酶的常规PCR中,双链靶核酸可在>90℃的温度变性,引物在35-90℃范围的温度退火。术语“PCR”包括所述反应的衍生形式,其包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套式PCR、定量PCR、多重PCR、强化固相PCR(enhanced solid phase PCR)等。对于强化固相PCR的更详细资
料,参见例如Park等,Analytical Biochemistry,375(2008),第391-393页,其全部内容以其整体在此引作参考。在本发明某些实施方案中,优选使用强化固相PCR用于产生和/或扩增例如与HPV毒株相关的核酸分子。在强化固相PCR扩增与HPV毒株相关的核酸分子中,
更优选使用本文所述的一对或多对正向/反向引物对。
团也是任选的,其可用作用荧光团进行标记以产生信号的优选手段。然而,也可用很多备选的信号产生手段,其中无需任何官能团或备选的官能团。例如,PCR引物可为非荧光标记的,并且可采用与信号缀合的单独的“信号寡核苷酸”。在另一实例中,当使用ESP-PCR形式时,可在无官能团的情况下使用所有‘水性’PCR引物,而信号则可借助掺入标记的核苷酸类似物的方法来备选地引入。在其它实施方案中,当使用ESP-PCR形式时,可在无官能团的情况下使用所有‘水性’PCR引物,而信号则可借助标记的固相引物来引入,以使双链产物中的信号增强。
开。除去一条链使得可回收所期需的链并消除其互补链,例如Nikiforov等(美国专利第
5,518,900号)阐述了通过在经修饰的引物的5′端掺入硫代磷酸核苷酸衍生物,来修饰用于扩增的两条引物中的一条,使得其抵抗核酸外切酶的消化。在用聚合酶链式反应(PCR)扩增靶序列后,dsDNA受到核酸外切酶消化。未受保护的链优先被5’-3′核酸外切酶消
化,留下由另一条链组成的单链产物。相似策略使用核酸外切酶抗性的分支引物(branch primer)(Shchepinov等,Nuc.Acids.Res.25:4447-4454 1997)或偏爱λ核酸外切酶的荷有5’磷酸基的底物(Higuchi等,Nucl.Acids Res.25:5685,1989)。
在热循环期间产生ssDNA。由过量引物引发产生这种偏爱的ssDNA产物。
反应。也参见美国专利第6,887,664号,例如对于异步PCR(asynchronous PCR)的阐述。
“实时PCR”意即其中反应产物即扩增子的量随反应进行而受到监测的PCR。有很多种形式的实时PCR,它们主要的不同在于用于监测反应产物的检测化学,例如Gelfand等,美国专利第5,210,015号(“taqman”);Wittwer等,美国专利第6,174,670号和第6,569,627号(插入染料);Tyagi等,美国专利第5,925,517号(分子信标);这些专利以其整体在此引作参考。用于实时PCR的检测化学综述于Mackay等,Nucleic AcidsResearch,30:1292-1305、
2002中,该文也以其整体在此引作参考。“嵌套式PCR”意即两步PCR,其中第一次PCR的扩增子成为第二次PCR的样品,第二步PCR使用一套新引物,所述引物中的至少一个结合第一步的扩增子的内部位置。
酸特异性结合,所述方式例如为Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen型或反Hoogsteen型碱基配对等等。
2003),该文献以其整体在此引作参考。
和T3启动子测序引物,24聚体GCG CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG。
HPV毒株间可变区(在图2中定义为X)两者。
aattctaatacgactcactatagg。或者,所述正向引物和反向引物选自与上述引物相似的引物,但其与上述正向或反向引物可不同,不同之处在于:不同HPV毒株之间存在核苷酸取代的位点处有0-约5个核苷酸取代,优选0-约2个取代,但排除了在3′端处取代最后两个核
苷酸。本发明还涵盖了如上述对正向或反向引物的取代一样对任选的后跟序列的类似取
代,所述任选后跟结合上述任何正向或反向引物的5′端。在某些优选实施方案中,正向引物选自:CAR YTR TTT GTT ACT GTK GTD GA,其任选地具有与所述引物5’端缀合的acaat或/5Phos/acaat;和GTD GAT ACY ACHCG YAG TAC HAA,其任选地具有与所述引物5’端缀合的ctgtt或/5Phos/ctgtt。在某些其它优选实施方案中,反向引物选自:TGA AAAATA AAY TGY AAA TCA TAT TCY TCM MCA TG,其任选地具有与所述引物5’端缀合的actcactatagg或/5AmMC6/actcactatagg;和TRCAY ARY TGA AAA ATA AAY TG,其任选地具有与所述引物
5’端缀合的tctaatacgactcactatagg或/5AmMC6/tctaatacgactcactatagg。
Applications”(Demidov和Broude编辑,Horizon Bioscience,2004)中。
定技术,例如基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton,Nature 350:91-92、1991;Kievits等,J.Virol.Methods 35:273-286,1991)和转录介导的扩增(TMA)(Hill,J.Clin.Ligand Assay 19:43-51,1996)。等温测定技术可再细分,所依据的是:(i)它们是否复制和扩增靶序列,例如TMA、NASBA和自动维持序列复制(3SR)(Guatelli等,Proc.Natl Acad.Sci.USA87:1874-1878、1990;Chadwick等,J.Virol.Methods 70:59-70,1998;综述参见Chan和Fox,Rev.Med.Microbiol.10:185-196,1999);或(ii)它们是否产生可被进一步扩增的靶标依赖性信号,例如侵入检测(invader assay)(Lyamichev等,Nat.Biotechnol.17:
292-296,1999;Ryan等,Mol.Diagn.4:135-144,1999)。有多种不易适合这些类别的其它扩增技术,例如Q β复制酶(Lizardi等,Biotechnology 6:1197-1202,1988)和分支DNA(Todd等,J.AIDS Hum.Retrovirol.10:S35-S44,1995;Pawlotsky等,J.Virol.Methods
79:227-235,1999)。然而,应该理解,本发明涵盖了本领域技术人员显而易见的任何RNA扩增方法。此外,应该理解,本发明还涵盖了逆转录酶或其功能等同物的应用,以将RNA转化为可随后扩增的DNA。
在该方法中,标记物通常连接在适于扩增扩增子的引物的5’端,但也涵盖了在引物内的其它位置标记,例如3’标记或非末端标记。
长大约为476nm的蓝光二极管激光器。(iii)氦氖激光器:发射红633nm谱线。(iv)氦镉
激光器:发射波长325nm。(v)100W汞弧灯:用于激发UV染料例如Hoechst和DAPI的最有
效的光源。
00和-750;BoDipy染料,包括BoDipy 630/650和BoDipy 650/665;CY染料,特别是Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy 5.5和Cy7;6-FAM(荧光素);PE-Cy5、PE-Cy7、荧光素dT;六氯荧光素(Hex);
6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE);Oregon绿染料,包括488-X和514;
罗丹明染料,包括X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、罗丹明绿、罗丹明红和ROX;TRITC、四甲基罗丹明(TMR);羧基四甲基罗丹明(TAMRA);四氯荧光素(TET);红6B、FluorX、BODIPY-FL、SYBR绿I染料和德克萨斯红。在本发明特别优选实施方案中,标记为对实施本发明特别方便的Cy5。
便的放射性标记物包括 P和 H。可用任何方便的手段将这些标记物掺入到扩增子和/或
引物中。还可使用多种非放射性标记方法。决不限制本发明的例示性的非放射性标记方法阐述于Speel(Histochem.Cell Biol.112:89-113、1999)中。
性为约25-30℃至约52℃,例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52℃。可改变温度,并且可使用较高的温度来代替甲酰胺和/或提供备选的严格性条件。需要时可施用备选的严格性条件,例如:中等严格性,该条件包括和包含至少约16%v/v-至少约30%v/v甲酰胺,包括16%、17%、18%、
19%、20%、21%、22%、23%、24%、24%、26%、27%、28%、29%和30%v/v甲酰胺和至少约0.5M-至少约0.9M用于杂交的盐和至少约0.5M-至少约0.9M用于洗涤条件的盐;或高严
格性,该条件包括和包含至少约31%v/v-至少约50%v/v甲酰胺和至少约0.01M-至少约
0.15M用于杂交的盐和至少约0.01M-至少约0.15M用于洗涤条件的盐。一般而言,在Tm=
69.3+0.41(G+C)%下进行洗涤(Marmur和Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962)。然而,双螺旋DNA的Tm每降低1℃,错配碱基对的数目就增加1%(Bonner和Laskey,Eur.J.Biochem.46:
83,1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是任选的。因此,特别优选的严格性水平如下来限定:
低严格性为6xSSC缓冲液、0.1%w/v SDS、25-42℃;中等严格性为2xSSC缓冲液、0.1%w/v SDS、20℃到小于65℃的温度范围;高严格性为0.1xSSC缓冲液、0.1%w/v SDS、至少65℃的温度。
1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、
2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm、3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、
3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、
4.7μm、4.8μm、4.9μm、5.0μm、5.1μm、5.2μm、5.3μm、5.4μm、5.5μm、5.6μm、5.7μm、
5.8μm、5.9μm、6.0μm、6.1μm、6.2μm、6.3μm、6.4μm、6.5μm、6.6μm、6.7μm、6.8μm、
6.9μm、7.0μm、7.1μm、7.2μm、7.3μm、7.4μm、7.5μm、7.6μm、7.7μm、7.8μm、7.9μm、
8.0μm、8.1μm、8.2μm、8.3μm、8.4μm、8.5μm、8.6μm、8.7μm、8.8μm、8.9μm、9.0μm、
9.1μm、9.2μm、9.3μm、9.4μm、9.5μm、9.6μm、9.7μm、9.8μm、9.9μm、10μm、11μm、
12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、
24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm、30μm。更优选珠粒包括1μm-10μm之间的直径(或非球状颗粒的当量尺寸)。
generabiosystems/technology/AmpaSandBeads/。然而,本发明不应该以任何方式具体受到这些珠粒的使用的限制。
10μm)的标记物。然而,由于可见光易于检测,因而在一个特别优选实施方案中,可光学检测的标记物可在可见光波长的范围内检测。
测的标记物颗粒在本领域中被称为半导体纳米粒、量子点、量子线、量子棒或纳米晶体或Q粒。然而,本文所用术语“量子点”或“QD”应该理解为包含所有这样的颗粒。此外,包含QD的可光学检测的标记物可包含近似球状或类球状颗粒或包覆的(coated)球状或类球状颗
粒。然而,术语QD不应该认为以任何方式限于球状、类球状、环状、圆柱状或任何其它“点”形态。例如,本文所用QD还可包含其它形态,尤其包括棒状、椭圆状或涂覆的棒状或涂覆的椭圆状颗粒。
有大约50-500,000个原子,其包括包含诸如ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、PbS、PbSe、PbTe、HgS、HgSe、HgTe、Si、ZnO等材料的发光的晶体。
565、585和655nm处发射的Qdot缀合物。然而,应该理解,本发明决不受QD(或任何其它可光学检测的标记物)的特定组成的限制,任何QD(市售或其它)均可适合本发明。
生各类具不同荧光标记水平的珠粒。方便使用的比例为1∶5 系列;也就是说,通过用未标记的标志:已标记的标志之比可产生不同的类别。这大体上在以下表4中例示。表4-未标记的标志与已标记的标志之比
类别 未标记标志的相对量 已标记标志的相对量
所有 0 所有
无 所有 0
1/5 5 1
1/25 25 1
1/125 125 1
记,5.0μm直径的珠粒以0%、100%和20%进行标记,5.6μm和6.8μm直径的珠粒以0%、
100%、20%和4%进行标记。
按照其各自的零TMR水平、中等TMR水平和高TMR水平来划分。
比包含在缀合中的寡核苷酸;而中等TMR水平具有以150∶1-80∶1的总寡核苷酸/荧光
标记比包含在缀合中的寡核苷酸,其视珠粒尺寸而定。
烷)。除硅烷之外,诸如非共价连接到玻璃表面并静电吸附多核苷酸磷酸基的聚-L-赖氨酸等化合物也可在本发明范围内。因此,包括适用于将多核苷酸连接到表面的其它硅烷在内的其它化合物将易于为技术人员认识,但本发明不受化合物的选择所限。
3.0μm、约3.5μm、约3.77μm、约5.0μm、约5.6μm和约6.8μm的珠粒。又可区分其它珠粒类别,例如5.0与5.6及5.6与6.8。因此,本发明人业已确定流式细胞术可区分高达至
少6种不同尺寸的珠粒。
被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中珠粒集合的各成员包含与分析物或分析物的特定毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的珠粒结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结
合;其中扩增子与特定反应物的缔合表明受检者受到分析物感染。
(vi)使被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中珠粒集合各成员包含与
HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互补性的核酸分子,
该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;其中扩增子与特定反应物的缔合表明人受检者受到HPV感染。
(ii)从所述样品分离出核酸;(iii)用产生扩增子的引物扩增来自所述样品的核酸,所述扩增子对所述分析物或所述分析物的特定毒株而言是独特的;(iv)任选地扩增来自人受
检者基因组DNA的对照核酸序列;(v)任选对在步骤(iii)和/或(iv)中所述的一种或多
种扩增子进行标记;(vi)使被标记的一种或多种扩增子与反应物珠粒集合杂交,其中珠粒集合各成员包含与HPV核苷酸序列或特定HPV毒株的核苷酸序列或对照核苷酸序列具有互
补性的核酸分子,该核酸分子已与可从物理化学上区分的基材结合或缔合;和(vii)测定反应物中哪一种与扩增子结合;其中扩增子与包含多核苷酸的特定反应物的缔合表明受检者中所述疾病的风险增加,所述多核苷酸和与特定疾病有关的HPV毒株互补。
互补。
具有以150∶1-80∶1的总寡核苷酸/荧光标记比包含在缀合中的寡核苷酸,其视珠粒尺
寸而定。
内光的标准模式图(standingmode pattern)的尖峰。根据本发明,业已确定WGM谱(WGM
profile)对微球颗粒表面变化极为敏感,并且当微球颗粒与其环境内的分析物或分子相互作用时,WGM谱会改变。
针),其中每一颗粒集合具有确定的WGM谱,其中所述分析物与所述固定的结合配偶体的结合导致所述至少一个微球颗粒集合的所述WGM谱改变,这表明存在所述分析物。
filter)的作用。在热变性接着温度缓慢下降的情况下,首先出现大部分有效的杂交事件。
在初期,类型特异性扩增子根据类型来结合匹配的珠粒-探针。阻断寡核苷酸可结合并饱和珠粒-探针,其降低热概况(thermal profile)。这可防止发生类型交叉的杂交事件(其中与阻断寡核苷酸相比,各个类型之间在探针结合区内有更多的差异点)或防止发生其它非特异性杂交(例如其它扩增子,包括引物二聚体产物的非特异性杂交)。可存在用于人对照以及各种HPV类型的阻断寡核苷酸。阻断寡核苷酸的实例如上表2所示。阻断寡核苷酸
和与类型特异性的珠粒探针区(阻断设计所针对的区)互补的序列之间的相似性水平可介
于40%-95%之间。另一相似性水平实例为75%-85%之间。
其使用优点是:排除了在生产期间对荧光标记(并繁琐地处理)PCR引物的需要;对于相同的灵敏度(和成本益处),使用少得多的荧光标记的寡核苷酸;降低荧光本底,使得不经洗涤步骤就能达到更高的灵敏度(处理和风险益处);由于杂交复合体中额外水平的“套嵌
(nesting)”而在缺乏阻断寡核苷酸下提高灵敏度;和在“检测”步骤中可能使用更多的PCR产物。所有这些益处将促成“单管(single tube)”方法。信号寡核苷酸的实例阐述于以上表2中。
使得随后使与结合剂结合的扩增子可视化。产生的病毒扩增子包含在检查的所有HPV毒株间保守的保守区(Y)和在HPV毒株间可变(即毒株特异性)的区域Xn,其中n代表与各HPV
毒株有关的可变区。固定在珠粒上的结合配偶体与HPV毒株特异性基因组特异性结合。
重检测
3多重检测法与传统HPV诊断的比较
HPV诊断方法 通量 报告 对照
本发明 每台仪器每 所有13种“高危” 内部对照、阳性对照、人
天1600例 毒株单独鉴定 gDNA对照
基于组织学的 每天350例 一般鉴定“高危”类 无内部对照、有“低危”阳
方法 别 性对照、“高危”阳性对照
实施例4用于探针方法的灵敏度测试
用各种引物组合从含有HPV类型特异性插入物的质粒扩增后进行的PCR产物的琼脂糖凝胶
电泳分析
44℃的退火温度进行40个扩增循环。泳道中标‘x’表示由于在PCR期间的蒸发损失而未对反应物进行分析。泳道中标‘-’表示无模板的对照。将200个或100个拷贝的类型特异性质粒连同10ng的Jurkat人基因组DNA用作PCR的模板,其采用与MLC1_95f和T7aMLC1_275r
多重化的GBHPVf3+和GBHPVr1。用44℃的退火温度进行58个扩增循环。在λ核酸外切酶
消化并与PapType探针珠粒杂交后,通过流式细胞术进行分析。无模板的对照在所有类型中产生阴性结果。使用200个拷贝的类型特异性质粒,所有测试类型:6、11、16、18、31、45、
51、52、56、58、59、66和68均产生阳性结果。除了类型51和59外,通过使用100个拷贝的类型特异性质粒,以上所有类型均产生阳性结果,表明该方法为非常灵敏并相对无偏差的系统。
等,J.Virol.Methods 70:59-70,1998Chan 和 Fox,Rev.Med.Microbiol.10:185-196,
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