一种用于肿瘤化疗的纳米微球制剂及其制备方法

摘要

本发明属医药制药技术领域，涉及一种用于胰腺癌等肿瘤化疗的吉西他滨-白蛋白纳米微球制剂及其制备方法。本发明用乙醇沉淀-戊二醛交联变性法，制备缓释吉西他滨的可生物降解的白蛋白纳米微球。经动物试验，结果证实：能明显提高该药的缓释性和组织滞留性，有效提高肿瘤和其他靶器官内的吉西他滨浓度，延长吉西他滨的有效作用时间，并减少药物的副作用。本发明纳米微球能用于胰腺癌、非小细胞肺癌的化疗和介入化疗，适合于吉西他滨适应症肿瘤患者的静脉化疗、动脉介入治疗、肿瘤局部注射间质化疗、腹腔化疗和口服化疗。

权利要求

1.一种用于肿瘤化疗的纳米微球制剂的制备方法，其特征是通过下述步骤：

将吉西他滨、白蛋白按重量比比例分别溶于注射用水或氯化钠溶液中，用氢氧化钠溶液调节pH至6-11，二者混合后，搅拌下恒速加入脱水剂，蓝色乳光产生后，加入交联剂，连续搅拌10-13小时使纳米微球的交联固化，将所得的吉西他滨白蛋白纳米微球胶体混悬液，控温30℃-50℃减压去除后，冷冻干燥即得吉西他滨白蛋白纳米微球制剂，所述纳米微球制剂的平均粒径为405.6±3.5nm，载药量为13.40％，所述制剂由下述重量比的材料组成：其中，所述的白蛋白为骨架材料制作纳米微球，包裹携带吉西他滨原料药。

2.按权利要求1所述的用于肿瘤化疗的纳米微球制剂的制备方法，其特征是所述的脱水剂选自乙醇、甲醇或丙酮中的一种；所述的交联剂选自戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷、双醛淀粉、甲醛或京尼平中的一种。

说明书

一种用于肿瘤化疗的纳米微球制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属医药制药技术领域，涉及肿瘤化疗药物新剂型-纳米微球，具体涉及一种用于胰腺癌等肿瘤化疗的吉西他滨-白蛋白纳米微球制剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 吉西他滨[gemcitabine，GCB；2’-脱氧-2’，2’-二氟胞苷单盐酸盐(β异构体)；dFdC]属嘧啶类细胞周期特异性抗肿瘤药，分子量为263.1。GCB是目前临床胰腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤的主要化疗药物，是迄今为止唯一由FDA批准治疗晚期胰腺癌的一线药物，有关研究公开了与传统的5-FU疗效比较结果为：23.8％vs 4.8％，P＝0.0022，显示GCB化疗具有明显优势。

[0003] 目前临床应用的吉西他滨制剂均为盐酸吉西他滨冻干粉针，临床实践显示，该剂型存在着三个较严重的缺点：(1)代谢快，血浆半衰期短，仅17min左右，缓释性不够；(2)分子量小，亲水性强，组织滞留性和针对肿瘤、胰腺、肝脏、脾脏、肺脏等重要器官的靶向性差；(3)上述两个特点结合导致了吉西他滨用药量大，临床疗效达不到满意水平，全身毒副作用也随之增大。

[0004] 研究表明，纳米微球可用作为靶向给药系统的载体，目前已作为国内外学者研究的热点，具有相当好的临床应用前景。

[0005] 纳米微球包含纳米球和微球两个连续的概念，所述纳米球(nanospheres)是纳米粒(nanoparticles，Ne)的一种，其粒径大小介于10～1000nm；所述微球(microspheres)是指粒径大于1微米的纳米微球。纳米微球的主要组成部分之一是骨架材料。较理想的骨架材料要求生物相容性好，可生物降解、安全无毒，可药物缓释、靶向明确。现有技术公开的骨架材料有：人工合成聚乳酸、聚羟基乙醇酸聚乳酸共聚物，聚氰基丙烯酸酯、脂质体，聚磷酸酯共聚物，聚磷酸酯与PLA、聚苯丙生、PLGA等的共聚或共混物，聚苯丙生、双脂肪酸与癸二酸共聚物、EVAc，等。尽管这些材料大多可以生物降解且药物解吸附性良好，但均为人工合成，经血管给药的安全性还有待于评价。

[0006] 目前普通的给药系统制造工艺，多为利用吉西他滨前体、吉西他滨衍生物、吉西他滨化合物，然后再将其包载进微粒给药系统。这种改变化学结构的方法，固然能够提高吉西他滨微粒系统的载药量和稳定性，同时能部分保持吉西他滨的药物毒性，但是改变结构后的吉西他滨，其药效学、药代动力学、安全性均需要重新评价，临床治疗实践表明，上述给药系统尚不能代替原始的吉西他滨。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供肿瘤化疗药物新剂型-纳米微球，具体涉及一种用于肿瘤化疗的吉西他滨-白蛋白纳米微球制剂及其制备方法。

[0008] 本发明采用沉淀-交联法纳米粒制备技术，进行试剂选择、处方确定及优选，以白蛋白为骨架材料，在不改变吉西他滨结构分子结构的前提下，改变吉西他滨的剂型，通过缓释性良好的纳米至微米级颗粒——白蛋白纳米微球载体——包裹携带吉西他滨原料药，实现高载药量和良好的稳定性。

[0009] 所述的白蛋白是人血浆中的水性蛋白之一，以白蛋白为骨架材料制作纳米微球能克服现有技术存在的溶血性和免疫源性的缺陷，且具有生物相容性好、安全无毒、可生物降解，可保护药物缓释、增加靶向性、减少药物副作用等优点。

[0010] 本发明采用白蛋白为骨架材料制作纳米微球，包裹携带吉西他滨原料药制备用于肿瘤化疗的吉西他滨-白蛋白纳米微球制剂。

[0011] 本发明所述的“吉西他滨-白蛋白”纳米微球由下述重量比的制备材料组成：

[0012] 吉西他滨 0.1-40mg

[0013] 白蛋白 5-200mg

[0014] 注射用水或氯化钠溶液 1-20mL

[0015] 脱水剂 2-100mL

[0016] 交联剂 0.01-0.3mL

[0017] 氢氧化钠 适量

[0018] 上述脱水剂选自乙醇、甲醇或丙酮中的一种；

[0019] 所述的交联剂选自戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷、双醛淀粉、甲醛或京尼平中的一种。

[0020] 本发明采用乙醇沉淀-戊二醛交联变性法通过下述步骤制备“吉西他滨-白蛋白”纳米微球：

[0021] 1、溶解混和：将吉西他滨、白蛋白按所述重量配比分别溶于注射用水或氯化钠溶液中，采用氢氧化钠溶液调节pH至6-11；

[0022] 2、脱水：二者混合后，搅拌下恒速加入脱水剂，

[0023] 所述脱水剂选自乙醇、甲醇或丙酮；

[0024] 3、交联固化：蓝色乳光产生后，加入适量交联剂连续搅拌10-13小时，促进纳米微球的交联固化，

[0025] 所述交联剂选自戊二醛、甲基聚乙烯-右旋糖苷、双醛淀粉、甲醛或京尼平；

[0026] 4、冻干：将所得的吉西他滨白蛋白纳米微球胶体混悬液，控温30℃-50℃减压去除后，冷冻干燥即得到吉西他滨白蛋白纳米微球。

[0027] 本发明制得的纳米微球因加入的吉西他滨、白蛋白、脱水剂、交联剂的比例及交联的时间不等，其粒径既可为50-1000nm范围内(纳米球)，或为1000nm以上(微球)。本发明优选的是峰值为406nm，分布于200-1000nm范围内的吉西他滨白蛋白纳米微球。

[0028] 本发明采用动物试验验证“吉西他滨-白蛋白”药代作用和进行药效评估，结果显示：所述的纳米微球制剂应用于肿瘤治疗可通过肿瘤的EPR效应(enhancedpermeability and retention effect，渗透及潴留效应)增加靶向性。临床实践表明，胰腺癌区域性动脉灌注即将动脉导管插入肿瘤血供动脉，并经导管注入化疗药物，动脉灌注可使吉西他滨在胰腺内、肿瘤局部、肝脏，甚至区域淋巴结等靶器官组织的药物浓度明显提高，体内滞留时间明显延长，对全身其他脏器的毒副作用减少。较之目前应用的普通吉西他滨注射剂的代谢快、血浆半衰期短、缓释性不足，分子量小、亲水性强、组织滞留性和重要器官靶向性不足，用药量大、毒副作用大等缺点，本发明的吉西他滨-白蛋白纳米微球应用于区域动脉灌注介入化疗，可达到灌注给药、首过效应、循环滞留、微血管壁高通透、肿瘤细胞高吞噬、淋巴潴留等“多级靶向”的效果。该制剂不仅可应用于胰腺癌、非小细胞肺癌等相关肿瘤的静脉化疗、区域动脉灌注介入化疗，还可以应用于相关肿瘤的间质化疗、腹腔化疗等其他化疗方式，在肿瘤化疗方面具有良好的应用前景。

[0029] 本发明通过基础研究和动物试验，结果证实：改变吉西他滨的剂型，通过缓释性良好的纳米至微米级颗粒——白蛋白纳米微球载体——包裹携带吉西他滨原料药，能明显提高该药的缓释性和组织滞留性，有效提高肿瘤和其他靶器官内的吉西他滨浓度，延长吉西他滨的有效作用时间，并减少药物的副作用。

附图说明

[0030] 图1是吉西他滨白蛋白纳米微球的大体形态，其中A：冻干粉，B：水溶液。

[0031] 图2是吉西他滨白蛋白纳米微球的粒径分布图和透射电镜照片(*1万倍)。

[0032] 图3是吉西他滨白蛋白纳米微球的体外药物释放曲线。

[0033] 图4是吉西他滨白蛋白纳米微球在大鼠体内的药物组织分布和缓释。

[0034] 图5是吉西他滨白蛋白纳米微球的药效学：BXPC-3细胞株抑制率-给药浓度曲线。

[0035] 图6是吉西他滨白蛋白纳米微球的药效学：裸鼠种植瘤生长曲线。

[0036] 图7是吉西他滨白蛋白纳米微球Beagle犬介入化疗试验组织药物分布图。具体实施方式：

[0037] 现结合实施例，对本发明作详细描述

[0038] 实施例1

[0039] 将20mg白蛋白溶于1mL注射用水中，用1M NaOH溶液调节pH值至8.5，将1.25mg盐酸吉西他滨溶于100μL注射用水中，用1M NaOH溶液调节pH值至9.0左右，搅拌下将药物溶液加入至白蛋白溶液中，搅拌情况下以1.0mL/min的速度加入3.0mL乙醇，至形成蓝色乳光，搅拌10min后，加入2.5μL交联剂戊二醛，连续搅拌12h促使纳米粒交联固化，40℃下减压蒸发除去乙醇，冷冻干燥，即得吉西他滨白蛋白纳米微球。

[0040] 实施例2

[0041] 将50mg白蛋白与10mg盐酸吉西他滨溶解于2mL生理盐水中，用1M NaOH溶液调节pH值至9.0，搅拌情况下以1.0mL/min的速度加入5.0mL无水乙醇，形成乳状胶体混悬液，搅拌情况下加入15μL戊二醛，连续搅拌6h促使白蛋白纳米粒交联固化，30℃下减压蒸除乙醇，冷冻干燥，即得吉西他滨白蛋白纳米微球。

[0042] 实施例3

[0043] 将100mg白蛋白与10mg盐酸吉西他滨溶解于2mL生理盐水中，用1M NaOH溶液调节pH值至9.0，搅拌情况下以1.0mL/min的速度加入5mL丙酮溶液，形成乳状胶体混悬液，搅拌情况下加入30μL戊二醛，连续搅拌8h促使白蛋白纳米粒交联固化，30℃下减压蒸除丙酮，冷冻干燥，即得吉西他滨白蛋白纳米微球。

[0044] 实施例4 吉西他滨白蛋白纳米微球的制备和参数检测

[0045] 将50mg白蛋白溶于2mL注射用水中，用1M NaOH溶液调节pH值至10.0，搅拌情况下以1.0mL/min的速度加入8.0mL无水乙醇，形成乳状胶体混悬液。另将5mg盐酸吉西他滨溶解于0.5mL注射用水中，用1M NaOH溶液调节pH值至10.0后在搅拌情况下加入到空白的乳状胶体混悬液中，搅拌1h使吉西他滨吸附至纳米粒表面平衡后，加入5μL戊二醛交联，搅拌12h，40℃下减压蒸除乙醇，将胶体溶液冷冻干燥，即得白蛋白纳米微球制剂。

[0046] 粒度仪检测平均粒径为405.6±3.5nm，位于200-1000nm范围内。载药量为13.40％，包封率为92.56％，达到纳米微球载药的较高水平；缓释时间达8-12小时，与吉西他滨冻干粉剂溶液在人体内给药后1小时后就降到有效血药浓度以下相比，有明显的提高。给药后1小时内突释率为21.77％，在可接受的范围内。

[0047] 大体观纳米微球的冻干粉为白色蓬松状，水溶液为悬浊状，电镜检测显示圆球形，边缘光滑，部分纳米微球中心见到药物区。表1为吉西他滨白蛋白纳米微球的部分参数。

[0048] 表1

[0049]

[0050] 实施例5：吉西他滨白蛋白纳米微球的安全性、缓释性与靶向性实验[0051] 将吉西他滨白蛋白纳米微球通过股静脉注射到SD大鼠体内(n1＝10)，以吉西他滨原料药纯药注射组为对照(n2＝10)，观察动物的生存状态，不同时间点取血，第6小时取脏器，采用高效液相色谱技术检测血浆和组织药物浓度，探讨吉西他滨纳米微球的安全性、缓释性与靶向性。

[0052] 注射药物后各组动物都于麻醉后1-2小时之内苏醒，实验组和对照组动物生存状态无明显差别，至解剖前仍较活泼，提示新药物新剂型没有明显毒性。两个组在大鼠体内的血浆药物缓释曲线，以原料药组为高，10min、30min、1h无明显差别(p＞0.05)，2小时和4小时差别显著(p＜0.05)，到6小时再次无明显差别(p＞0.05)。从而推断纳米微球小部分分布于血浆，而大部分仍潴留在组织内。

[0053] 给药6小时后，两组在大鼠体内的组织药物分布，纳米微球组在胰腺、肝脏、脾脏三个重要靶器官的分布明显高于对照组(p＜0.05)，而心脏、肺脏、肌肉、肾脏的浓度未见有增大(p＞0.05)，结果体现了优良的靶向性和缓释性。有意义的是吉西他滨本身的胰腺分布也高于其他组织，肝脏和脾脏的分布却极微量，前者是该药的优点，后者却是一个非常严重的不足，必然导致对肝脏、脾脏转移的抑制不够。本发明的纳米微球恰好在此给予了显著的改进，具有非常重要的现实意义。

[0054] 实施例6：吉西他滨白蛋白纳米微球对多个胰腺癌细胞株的抑制试验[0055] 通过体外试验，MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)和流式细胞仪法，检测吉西他滨白蛋白纳米微球相对于吉西他滨原料药和空白纳米微球对肿瘤细胞的抑制效应的差别，及吉西他滨白蛋白纳米微球的制备过程是否有药效减损和纳米微球在细胞水平的生物相容性。

[0056] 选择胰腺癌细胞株PANC-1、BXPC-3、SW-1990、CFPAC-1和非小细胞肺癌A549共5株，吉西他滨纳米微球、空白纳米微球、吉西他滨原料药、培养液共4组，0.01、0.1、1、10、
50μg/ml共5个浓度，48小时、72小时两个时间点，每个组做5个复孔。

[0057] 结果显示，给药组别、给药浓度、时间点、细胞类别4个重要因素，均对细胞株的抑制率产生明显影响(P＝0.000)。纳米微球组和原料药组对细胞的总体抑制率分别达到56.98±12.51％和55.84±13.11％，而空白球组为24.76％。多角度多层次分析也提示纳米微球组疗效大于等于原料药组；空白纳米微球生物相容性良好，没有细胞毒性(一般以抑制率30％为界)。流式细胞仪检测也提示纳米微球组增殖率相对减少，凋亡率相对增加。

[0058] 实施例7：吉西他滨白蛋白纳米微球对裸鼠移植瘤的抑制试验

[0059] 通过裸鼠胰腺癌种植瘤模型(PANC-1细胞)体内试验检测吉西他滨白蛋白纳米微球相对于吉西他滨纯原料药和空白微球对裸鼠种植瘤生长的抑制是否更为有效，纳米微球在裸鼠体内的生物相容性如何；并通过免疫组化检测凋亡、增殖、微血管密度；通过RT-PCR技术检测多个胰腺癌相关重要基因的变化。

[0060] 4周龄雄性裸小鼠裸小鼠30只，背部种植1×108/ml的PANC-1细胞0.2ml建立均匀稳定的胰腺癌种植瘤模型，待肿瘤长至0.5厘米左右(接种后1周)，随机分为4组：纳米微球组、原料药组、空白球组和生理盐水对照组，每组各6只。接种后1周起，通过裸鼠尾静脉给药，每5天注射药物一次，连续4次。按照人-动物药量换算公式，结合微球载药量进行药量计算。接种后起每5天用游标卡尺测肿瘤大小1次，并称裸鼠体重。按公式体积2
＝(1/6)×∏×长径×短径 计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接种后第5周末处死动物，称体重；剥离肿瘤，分析天平称瘤重；肿瘤切一半低温保存，后续进行rt-PCR检测；另一半用福尔马林浸泡固定，后续进行病理切片检测。

[0061] 结果显示：在整个5周的实验过程中，30只裸鼠无一死亡。但原料药组裸鼠给药期间体重下降严重，由20.67降到17.83克，纳米微球组的体重下降远远不及原料药组。提示纳米微球有减少化疗药毒副作用的效果。空白球组曲线与生理盐水组曲线持续平行，说明微球本身无毒副作用。

[0062] 纳米微球组肿瘤生长曲线明显低于其它各组(p＜0.01)，且持续下降；原料药组也有明显的生长曲线下降，但不及纳米微球组(p＜0.05)，而且原料药组停药后有恢复趋势。空白球组与生理盐水组肿瘤持续增大，二者差异不显著(p＞0.05)。计算体积抑瘤率和瘤重抑瘤率，纳米微球组达到了169％和69％，原料药组仅100％和40％左右。

[0063] 5周后切取肿瘤，纳米微球组体表未明显见到肿瘤，6只裸鼠仅存4个不明显的小肿瘤，肿瘤组织菲薄萎缩，无血丝，呈膜片状贴在皮下，需要刮取得到。原料药组肿瘤总体上小，但无肿瘤消失，形态饱满，有细血管伸入，皮下呈现粒状，易解剖。空白球组和生理盐水组肿瘤体积明显大于其他各组，在最后一周内两组各有一只肿瘤发生破溃化脓、体积缩减，肉眼观肿瘤血管丰富，剥离顺利。

[0064] 原料药组、空白球组和生理盐水组各发现一只裸鼠肝脏转移，且严重程度依次递增，在原料药组为数个“牛眼状”灶，在空白球组为“满天星”，在生理盐水组为肝脏结节状变形。未发现淋巴结、肺脏等转移

[0065] 运用Ki-67免疫组化检测种植瘤增殖率，结果显示，纳米微球组明显低于其它各组(P＜0.05)；运用tunel法检测量肿瘤凋亡率，化疗组凋亡率高于其它各组，纳米微球组最高，达39％，但统计差异P＞0.05；运用CD34免疫组化测量种植瘤微血管密度(MVD)的结果显示，化疗组MVD明显低于非化疗组(P＜0.05)，其中纳米球微组又在数值上低于原料药组。运用RT-PCR技术检测凋亡相关基因bcl-2和bax，血管生成相关基因VEGF，甲基化相关基因MBD1和多药耐药基因MDR1的，统计结果均有数值上的差别和意义。

[0066] 实施例8：西他滨白蛋白纳米微球毕格犬介入化疗试验

[0067] 用毕格犬进行胰腺癌介入化疗，观察吉西他滨白蛋白纳米微球用于介入化疗相对于吉西他滨原料药纯药(n1＝6，n2＝6)在缓释性和靶向性的优势。介入化疗后0-12小时多个时间点取血，第4、8、12小时取脏器，采用高效液相色谱技术检测血浆和组织药物浓度，观察吉西他滨白蛋白纳米微球运用于介入治疗在动物血浆和脏器组织内的分布、缓释特点。同时检测药物对肝肾功能、组织结构的影响，等。

[0068] 结果显示：注射药物后各组动物持续麻醉后12小时，生命体征平稳，第4、8小时开腹取脏器，第12小时处死并取脏器，无意外死亡，实验组和对照组动物生存状态无明显差别。

[0069] 原料药组初始血药浓度较高，但很快降到低浓度并且继续下降；纳米球组虽然起始浓度较低，但是下降缓慢，维持浓度较高，时间较长。纳米球组门静脉血持续高于原料药组，提示门脉区域靶器官的高血药浓度。

[0070] 对各个组4、8、12h时的脏器吉西他滨(GCB)浓度进行统计，可以看到纳米微球组较多分布于胰腺、脾脏、肝脏，其中的吉西他滨浓度持续明显高于其它两组(p＜0.05)；原料药组较多分布于肌肉。提示纳米微球组对胰腺、肝脏、脾脏的靶向性好。

[0071] 在肝脏内，吉西他滨纳米微球显现出上升现象，能支持200nm以上的微球容易被单核-吞噬细胞吞噬，通过循环带回肝脏的理论。对各个组介入化疗前和介入后12小时的血常规、肝肾功能的统计显示除血小板有明显下降外，其他指标无明显变化，提示药物无新增毒副作用，具有血液系统和肝肾功能的安全性。对各个组胰腺、肝脏、脾脏等重要脏器不同时间点的HE染色切片进行镜下观察，未见实验组在组织形态结构方面与对照组有明显差异。