小鼠卵母细胞体外成熟培养方法及孤雌胚胎干细胞系的建立方法

摘要

本发明公开一种小鼠卵母细胞体外成熟培养方法及孤雌胚胎干细胞系的建立方法，该体外成熟培养方法是将未成熟卵在加有HCG和PMSG的基础培养液中培养，其成熟率可达到83％以上。本发明孤雌胚胎干细胞系的建立是将经体外成熟培养的小鼠卵进行孤雌激活培养发育得到胚胎干细胞系的，该方法获得的肝细胞无免疫原性，同时在全能性上又与受精胚胎来源的干细胞相当，对利用人的未成熟卵体外成熟并分离孤雌胚胎干细胞具有指导意义。针对当前人卵子捐赠不足，辅助生殖技术临床未成熟卵大量废弃等情况，本发明的两种方法结合起来，为开发利用人的未成熟卵体外成熟培养、利用体外成熟的卵子进一步研究孤雌胚胎及用于胚胎干细胞的分离奠定基础。

权利要求

1.一种小鼠卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于该方法是取未成熟卵，置于未成熟卵培养液中培养15～16个小时，从而制备得到小鼠成熟卵母细胞，所述未成熟卵培养液的配方为：95体积％MEM培养基、5体积％胎牛血清、0.24mM丙酮酸钠、1.5单位/ml人绒毛膜促性腺激素和1单位/ml孕马血清促性腺激素。

2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于所述未成熟卵为GV期的卵丘-卵母细胞复合体。

3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于所述未成熟卵在未成熟卵培养液中培养

15～16个小时后，采用透明质酸酶消化吹打去除卵丘细胞，然后再用HKSOM洗3～4次终止透明质酸酶的消化作用。

4.一种利用权利要求1所述方法培养的成熟卵建立孤雌胚胎干细胞系的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

2+

(1)将经权利要求1所述方法体外培养成熟的小鼠卵在Ca free KSOM培养基中孤雌激活后，移至KSOM培养基中培养发育成囊胚；

(2)将上述囊胚移入经丝裂霉素处理的饲养层细胞上进行培养；

(3)挑取饲养层上克隆中央致密的细胞团进行机械传代，酶传扩增，从而得到孤雌胚胎干细胞系。

5.根据权利要求4所述建立方法，其特征在于所述步骤(3)中，培养8～12天后，挑取饲养层上克隆中央致密的细胞团，机械传代2～3代，再酶传扩增。

说明书

小鼠卵母细胞体外成熟培养方法及孤雌胚胎干细胞系的建

立方法

技术领域

[0001] 本发明涉及胚胎干细胞系技术领域，具体涉及一种小鼠卵母细胞体外成熟培养方法及孤雌胚胎干细胞系的建立方法。

背景技术

[0002] 在缺少雄性配子基因组的情况下直接激活M II期卵子能够形成孤雌囊胚，从这个孤雌囊胚中可以分离得到孤雌胚胎干细胞。孤雌胚胎干细胞具有一般受精胚来源的胚胎干细胞的一般特征。

[0003] 目前建立的胚胎干细胞株主要来源于囊胚，囊胚的内细胞团的分离非常重要。分离囊胚内细胞群的方法主要有免疫外科法和机械法，在胚胎内细胞团(ICM)分离过程中选择一种对ICM细胞继续增殖能力损伤最小的方法有助于提高原代克隆的质量。目前比较常用的方法是免疫外科法，该法主要应用于高质量的囊胚ICM分离。2004年Amit【Amit，M.，et al.，Feeder layer-andserum-free culture of human embryonic stem cells.Biol Reprod，2004.70(3)：p.837-45.】首次报道了通过机械法分离ICM建立人ES细胞系，这种方法对ICM的损伤较少。

[0004] 生殖系转移作为检验胚胎干细胞多能性的金标准：即将干细胞注入不同品系的小鼠囊胚内产生嵌合体小鼠，并检测其生殖系转移能力。

[0005] 将孤雌胚胎干细胞注射进囊胚腔，移植后产生嵌合体鼠。通过对嵌合体鼠组织中孤雌细胞的分化研究发现，孤雌胚胎干细胞较广泛地参与各个脏器的形成，但与受精胚来源的胚胎干细胞相比，孤雌胚胎干细胞在大多数嵌合组织中的参与度较低，某些组织如骨骼肌其嵌合度极低。虽然孤雌胚胎干细胞不仅具有与供体相同的免疫原性而且它的制造能够为社会伦理所接受，但是其较低的发育能力限制了将来的临床应用，孤雌胚胎干细胞生殖系转移效率不到10％，远远低于正常胚胎干细胞生殖系转移效率40～100％。

[0006] 将未成熟期(GV期)的卵细胞在体外进行成熟培养至体外成熟期(M II期)也可以用来进行后续的孤雌胚胎干细胞系的建立，目前，大多数未成熟卵体外成熟培养配方较复杂，试剂价格昂贵，且培养的效果不理想，常存在发育潜能差，卵子的纺锤体和极体异常等问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的未成熟卵体外成熟培养的配方成本高、成分复杂且卵子成熟低等不足，提供一种配方简单有效且卵子成熟率达到83％以上的小鼠卵母细胞体外成熟培养方法。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种根据上述由未成熟卵体外成熟培养得到的成熟卵孤雌激活从而建立孤雌胚胎干细胞系的方法。

[0009] 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

[0010] 一种小鼠卵母细胞体外成熟培养方法，该方法是从小鼠卵巢中取出未成熟卵，在未成熟卵培养液中培养15～16个小时，制备得到小鼠成熟卵母细胞。

[0011] 上述未成熟卵培养液的配方为：95体积％MEM培养基，5体积％胎牛血清，0.24mM丙酮酸钠，1.5单位/ml人绒毛膜促性腺激素(HGG)，1单位/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)；所述MEM培养基和胎牛血清均可采用市场上均有销售的成品。

[0012] 上述培养方法中，一般选择从小鼠卵巢中取处于GV期的卵丘-卵母细胞复合体。

[0013] 上述培养方法中，培养15～16小时后，可采用透明质酸酶消化吹打去除卵丘细胞，然后再用HKSOM洗3～4次终止透明质酸酶的消化作用；这一步可以去除卵丘颗粒细胞，为下步孤雌激活做准备；所述HKSOM为添加Hepes的KSOM培养液。

[0014] 上述培养方法中，将未成熟卵在未成熟卵培养液中培养15～16个小时，可采用本领域技术人员进行卵细胞培养时的常规操作，如微滴法培养。

[0015] 为克服以往分离胚胎干细胞方法的不足，并结合未成熟卵来源的孤雌胚胎的特点，本发明还针对上述未成熟卵体外成熟培养后得到的成熟卵细胞，提供了一套新的孤雌胚胎干细胞系的建立方法，该方法包括如下步骤：

[0016] (1)将上述体外培养成熟的小鼠卵子在Ca2+ free KSOM培养基中孤雌激活后，然后将其移至KSOM培养基中培养，胚胎发育成囊胚；

[0017] (2)将上述孤雌激活发育的囊胚移入经丝裂霉素处理的饲养层细胞上进行培养；

[0018] (3)挑取饲养层上克隆中央致密的细胞团进行机械传代，酶传扩增，从而得到孤雌胚胎干细胞系。

[0019] 上述步骤(1)中，所述KSOM培养基为市售成品，所述Ca2+ free KSOM培养基为市售成品。

[0020] 上述步骤(1)中，体外培养成熟的小鼠卵子在Ca2+ free KSOM培养基中孤雌激活，通常激活需要3～5个小时就可以，然后移至KSOM中培养，通常培养约24小时就要开始观察成熟卵激活发育情况，孤雌激活的卵子发育为2细胞；培养96小时就可以观察到成熟卵发育成囊胚。

[0021] 对胚胎干细胞的分离，本领域技术人员的常规操作是采用丝裂霉素处理的成纤细胞来分离胚胎干细胞，因此上述步骤(2)中，所述丝裂霉素处理的饲养层细胞，也可以是采用丝裂霉素处理的成纤细胞作为饲养层细胞，用来分离本发明的孤雌激活胚胎干细胞，将孤雌激活发育的囊胚移入丝裂霉素处理的饲养层上进行培养分离，可以采用本领域常用的培养液，也可以采用如下培养液配方：Knockout DMEM(市售)为基础液，Knockout血清替代品(KSR，市售)、1000IU/ml白血病抑制因子、1mM L-谷氨酰氨(市售)、0.1mM MEM非必需氨基酸(市售)、0.1mM β-巯基乙醇(市售)、50IU/ml青霉素和50IU/ml链霉素。均能实现本发明。

[0022] 上述步骤(3)中，挑取饲养层上克隆中央致密的细胞团，采用机械传代方法，机械分散呈多块，将分散的细胞团重新再次接种到新的经丝裂霉素处理的饲养层细胞上再次培养生长，这一步所用的试剂及操作同步骤(2)。

[0023] 上述步骤(3)中，传统方法一般是在培养第五天左右挑克隆，并大多为酶传，本发明这里采用培养8～12天(也就是其囊胚生长第十天左右)挑取克隆，先是机械传代2～3代，再转为酶传，从而获得孤雌胚胎干细胞系。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0025] 1.本发明的未成熟卵培养液主要是在基础培养液中加入了两种简单而有效的激素(HGG和PMSG)，并且两种激素的用量合适，但并未添加其它作用机理还存有争议的激素，如E2、孕激素等；

[0026] 2.本发明的孤雌胚胎干细胞系的建立是采用从小鼠卵巢分离未成熟卵进行体外成熟培养后再进行孤雌激活胚胎干细胞系建立的，该方法能得到无免疫原性的干细胞系，同时在全能性上又与受精胚胎来源的干细胞相当，对利用人的未成熟卵体外成熟并分离孤雌胚胎干细胞具有指导意义；

[0027] 3.本发明的小鼠未成熟卵体外成熟培养液配方，不但成分简单成本低廉，而且此配方培养液用于小鼠未成熟卵体外成熟培养，其成熟率达到83％以上，通过该配方体外培养成熟的卵子可以作为实验材料，进一步进行卵子的体外受精，卵子的孤雌激活及胚胎干细胞的分离等研究；

[0028] 4.针对当前人卵子捐赠不足，辅助生殖临床未成熟卵大量废弃等情况，本发明的小鼠卵母细胞体外成熟培养方法及孤雌胚胎干细胞系的建立方法，为开发利用人的未成熟卵体外成熟培养、利用体外成熟的卵子进一步研究孤雌胚胎及用于胚胎干细胞的分离奠定基础；

[0029] 5.传统分离干细胞方法中培养液中用胎牛血清，每一批次血清存在差异，其成分复杂，且含许多细胞生长因子，但同时也含大量促细胞分化因子，使干细胞分离效率低，而本发明的方法在用囊胚内细胞团原代培养中，一般在第10天左右，内细胞团生长明显突出，此时用酶传或机械传，并且用替代血清，从而得到稳定的干细胞系。

附图说明

[0030] 图1为实施例1中小鼠未成熟卵孤雌激活发育的胚胎光镜图；

[0031] 其中，1是小鼠PMSG 42～46小时后收集卵丘复合体(COC)，2是体外培养15小时后的卵丘复合体(COC)，3是体外培养15小时后去除颗粒细胞的卵子，4是孤雌激活的2细胞胚胎，5是孤雌激活的囊胚，6是对照组体内成熟卵孤雌激活的囊胚；

[0032] 图2为含FBS或KSR的干细胞培养液分离培养的干细胞光镜图；

[0033] 其中，1为采用含FBS的干细胞培养液原代培养的内细胞团第10天的生长形态，2为采用含FBS的干细胞培养液机械传代后生长的克隆，3为采用含FBS的干细胞培养液经0.25％胰酶传代生长的克隆，4为采用含KSR的干细胞培养液原代培养的内细胞团第10天的生长形态，5为采用含KSR的干细胞培养液机械传代后生长的克隆，6为采用含KSR的干细胞培养液经0.25％胰酶传代生长的克隆；

[0034] 图3为实施例2制备所得胚胎干细胞和受精卵来源的胚胎干细胞的克隆形态及核型分析对比光镜图；

[0035] 其中，1为受精卵来源的胚胎干细胞的克隆形态，2为实施例2制备所得胚胎干细胞的克隆形态，3为受精卵来源的胚胎干细胞的核型，4为实施例2制备所得胚胎干细胞的核型；

[0036] 图4为实施例2制备所得胚胎干细胞和受精卵来源的胚胎干细胞的分子生物学特性免疫荧光染色图；

[0037] 其中，1为受精卵来源的胚胎干细胞的OCT-4阳性克隆，2为实施例2制备所得胚胎干细胞的OCT-4阳性克隆，3为受精卵来源的胚胎干细胞的SSEA-1阳性克隆，4为实施例2制备所得胚胎干细胞的SSEA-1阳性克隆，5为受精卵来源的胚胎干细胞的AKP活性阳性克隆，6为实施例2制备所得胚胎干细胞的AKP活性阳性克隆；

[0038] 图5为实施例2制备所得胚胎干细胞体外分化免疫荧光染色图；

[0039] 其中，1和4为GFAP抗体(外胚层)免疫荧光染色，2和5为免疫荧光染色，MF20抗体(中胚层)，3和6为AFP抗体(内胚层)免疫荧光染色；

[0040] 图6为1116pES p6和1114pES p13分化的畸胎瘤组织切片(HE染色)图；

[0041] 其中，1为1116pES p6分化的畸胎瘤，2为1114pES p13分化的畸胎瘤，3为MEF阴性对照，4、5和6为1116pES p6分化的畸胎瘤组织切片，4为神经组织(外胚层)，5为肌肉(中胚层)，6为腺体(内胚层)，7、8和9为1114pESp13分化的畸胎瘤组织切片，7为神经管(外胚层)，8为软骨(中胚层)，；9为纤毛柱状上皮(内胚层)；

[0042] 图7为嵌合体小鼠和生殖系转移的后代；

[0043] 其中，1为未成熟卵孤雌胚胎干细胞的嵌合体，2为未成熟卵孤雌胚胎肝细胞的嵌合体所产生的生殖系转移后代；3为受精卵来源的胚胎干细胞的嵌合体，4为受精卵来源的胚胎干细胞的嵌合体的生殖系转移后代。

具体实施方式

[0044] 下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

[0045] 实施例1 小鼠未成熟卵的收集和体外成熟培养

[0046] 首先按照配方配制小鼠未成熟卵培养液：95体积％MEM(购自Invitrogen)，5体积％胎牛血清(购自Hyclone)，0.24mM丙酮酸钠(购自sigma)，1.5units/mlHGG(购自sigma)，1unit/ml PMSG(购自sigma)。

[0047] 按照5IU/只的剂量给雌性小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，待42～46小时后将小鼠断脊椎处死，取出小鼠卵巢置于含20mM HEPES(HEPES是本领域常用的培养基，市售)的未成熟卵培养液中，用小号针头将卵巢中卵泡内的卵丘-卵母细胞复合体取出，在显微镜下观察确认为GV期卵子，放入事先预热(＞1小时)的未成熟卵培养液中培养，培养方法采用本领域常规的微滴法培养，每滴100微升，每滴约放十多个卵丘复合体。

[0048] 培养约15～16个小时后，用透明质酸酶中将颗粒细胞(卵丘细胞)去除，然后将小鼠卵母细胞移至HKSOM中洗3～4次终止透明质酸酶的消化作用，从而完成小鼠未成熟卵的体外成熟培养，观察卵子成熟情况，如图1所示。

[0049] 实施例2 孤雌胚胎干细胞的分离

[0050] 本实施例的KSOM培养基为市售。

[0051] 将上述实施例1中体外培养成熟的小鼠卵子移至事先预热(＞1小时)Ca2+ -free KSOM培养基中激活4小时，然后移至KSOM培养基中培养，约24小时观察卵子激活发育情况，培养96小时后可观察到卵子发育形成囊胚，将囊胚移入丝裂霉素处理的饲养层成纤细胞的四孔板上，每孔大约10个囊胚，此处采用的培养液配方为：以Knockout DMEM(购自Invitrogen)作为基础液，Knockout血清替代品(KSR，购自Invitrogen)，1000IU/ml白血病抑制因子、1mM L-谷氨酰氨(购自Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸(购自Sigma)、0.1mM β-巯基乙醇(购自Sigma)、50IU/ml青霉素和50IU/ml链霉素。

[0052] 从培养第二天开始，每天将培养液半量更换新的培养液，当囊胚培养到第10天时，进行机械传代，机械传代时挑取克隆中央致密的细胞团，机械分散呈多块，将分散的细胞团再次接种到丝裂霉素处理的饲养层成纤细胞的四孔板上，这里的操作同前，每天半量换培养液(培养液也同前)，3～5天机械传代一次，机械传代3次后转为酶传代，酶传代采用0.25％的胰酶进行传代，从而得到小鼠孤雌胚胎干细胞系。

[0053] 本实施例中机械传代、酶传代均采用本领域的常规操作。

[0054] 本实施例同时还采用KSR替换FBS作为干细胞培养液进行一组平行试验，然后对比FBS和KSR的不同，所分离培养的干细胞有何不同，结果如图1所示。

[0055] 图2中，1～3是采用含FBS的干细胞培养液分离培养的干细胞，4～6是采用含KSR的干细胞培养液分离培养的干细胞；1和4是原代培养的内细胞团第10天的生长形态。由图中可以看出，1中细胞核不清晰，周围滋养外胚层细胞生长，而4中克隆明显，边界清楚，细胞核明显；2和5是机械传代后生长的克隆，由图中可以看出2中的细胞克隆相对5中的细胞克隆显得更加扁平；3和6是经0.25％胰酶传代生长的克隆。

[0056] 由图2中可以看出添加FBS和KSR的培养液都能分离未成熟卵孤雌干细胞；但用KSR的原代克隆典型，机械传代稳定，酶传亦可得到稳定的干细胞系。而应用FBS的原代克隆有部分分化细胞，传代效率明显低于应用KSR。

[0057] 实施例3 小鼠孤雌胚胎干细胞系的多能性研究

[0058] 观察实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞，可以发现虽然实施例2的胚胎干细胞是通过未成熟卵在体外成熟培养后再孤雌激活发育的，但是其和受精卵来源的干细胞在形态以及生长速度上并无差异，核型分析也都显示为正常的40条，如图3所示。

[0059] OCT-4为转录因子，可在细胞核中表达。本实施例对实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞都进行OCT-4表达，结果如图3所示，实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞都呈现Oct-4阳性克隆，Oct-4染色都是克隆中央细胞染色很深，尤其是中央多层紧密堆积的细胞。

[0060] SSEA-1为小鼠胚胎干细胞表面存在的特异性细胞表面抗原，当细胞分化时其表达消失。本实施例对实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞都进行SSEA-1表达，结果图4所示，实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞都呈现SSEA-1阳性克隆，SSEA-1染色均为深着色。

[0061] 本实施例对实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞都进行碱性磷酸酶(AKP)染色，由图4可以看出，碱性磷酸酶染色显示两种干细胞克隆均为深蓝色，而周围成纤细胞不着色，表明两种干细胞都为阳性反应。

[0062] 综上所述，实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞和受精卵来源的干细胞从分子生物学特性OCT-4表达、SSEA-1表达和AKP活性方面是无差异的，都具有干细胞的特征性表达。

[0063] 实施例4 小鼠孤雌胚胎干细胞的体外分化

[0064] 实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞体外分化，采用如下操作步骤：

[0065] 将实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞用胰酶消化后，重贴成纤细胞(MEF)去除MEF后，在无白血病抑制因(LIF)的干细胞培养液(市售)中悬浮培养2天，形成类球形团结构，称拟胚体(EB)，挑选大小适中状态好的拟胚体放入孔板中让其贴壁生长，培养8～18天后，可观察到有自发节律性收缩的细胞，分化第18天荧光免疫检测到代表3个胚层的标志性表达GFAP抗体(外胚层)、MF20抗体(中胚层)和AFP抗体(内胚层)，如图5所示。

[0066] GFAP(Glial Fibrillary Acid Protein)是神经胶质细胞特异性表达抗体，MF20抗体是心肌特异性表达抗体，AFP(Alpha-Fetoprotein)为甲胎蛋白，这些结果表明实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞在体外具有三个胚层的分化潜能。

[0067] 实施例5 小鼠孤雌胚胎干细胞在裸鼠皮下分化形成畸胎瘤

[0068] 将8个实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞注入有免疫缺陷的裸鼠的皮下，约十天能观察到瘤样团块开始出现，4周后8个未成熟卵孤雌干细胞系注射的裸鼠都出现了较明显的肿瘤，大小直经约1～2cm。图6中1为小鼠未成熟卵孤雌干细胞系(实施例2得到的一种小鼠孤雌胚胎干细胞，命名为1116pESp6)分化的畸胎瘤；2为小鼠未成熟卵孤雌干细胞系(实施例2得到的一种小鼠孤雌胚胎干细胞，命名为1114pES p13)分化的畸胎瘤；3为MEF阴性对照。显微镜下发现所有的畸胎瘤都分化出3个胚层组织，包括发育不成熟的神经、肌肉、软骨、腺体和鳞状上皮组织等。

[0069] 实施例6 小鼠孤雌胚胎干细胞体内分化形成嵌合体

[0070] 本实施例首先用昆明白小鼠作为宿主囊胚，本课题先是用昆明白小鼠做宿主囊胚，将实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞注射移植到昆明白小鼠囊胚中，共注射移植了12个囊胚，出生5只小鼠，有2只嵌合，嵌合鼠比率为40％。

[0071] 然后本实施例又采用ICR小鼠做宿主囊胚，将实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞的早代、近中代和晚代干细胞分别注射移植到ICR小鼠囊胚中，制备嵌合体。早代干细胞共注射移植了78个囊胚，出生12只小鼠，有三只嵌合，嵌合鼠比率为25％；近中代干细胞(第21代)共注射移植了42个囊胚，出生7只小鼠，有3只嵌合，嵌合鼠的比率为43％；晚代干细胞(第54代)共注射了45个囊胚，17只出生，10只嵌合，嵌合鼠的比例为59％。

[0072] 为更好地检测干细胞生殖系转移效率， 采用BalB/c小鼠做宿主囊胚，同时将实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞的早代干细胞以及受精卵来源的干细胞第8代干细胞分别注射移植入该宿主囊胚，然后分析嵌合体。

[0073] 实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞的早代干细胞共注射移植了214个囊胚，出生了32个小鼠，其中22个嵌合，嵌合鼠比率为69％。而受精卵来源的干细胞第8代干细胞注射移植了25个囊胚，出生了12个小鼠，有7个嵌合，嵌合鼠的比率为58％。

[0074] 本实施例中所用到的昆明白小鼠、ICR小鼠和BalB/c小鼠均为本领域技术人员进行相关实验时所常用的小鼠品种。

[0075] 实施例7 生殖系转移的检测

[0076] 为进一步检测嵌合体是否获得生殖传递能力，本实施例选择前面6中的部分嵌合体小鼠与其相应的雄鼠或雌鼠交配，根据是否产生非白色小鼠，证明其是否具有生殖系转移能力。

[0077] 选择实施例6中，由实施例2得到的小鼠孤雌胚胎干细胞注射移植到宿主囊胚得到的嵌合体(12只)进行了10只雌鼠，2只雄鼠交配，检测发现有3只雌鼠为生殖系嵌合，这3只雌鼠中有一只ICR嵌合体，另外两只都是BalB/C嵌合体，其交配出生的小鼠的情况分别为：

[0078] (1)一只为ICR嵌合体：交配出生的17只小鼠中有2只非白色，其生殖系转移效率为12％；

[0079] (2)另2只均为BalB/C嵌合体：其中1只交配第一胎出生全为非白色小鼠，其生殖系转移效率为100％，第二胎出生10只小鼠，有5只为非白色小鼠，其生殖系转移效率为50％；另1只嵌合体小鼠在交配后第一胎娩出5只小鼠，1只为非白色，其生殖系转移效率为20％。

[0080] 同时作为参照组，也选择了实施例6中受精卵来源的干细胞第8代干细胞注射移植得到的BalB/c嵌合体进行了7只交配检测，其中3只交配后有非白色小鼠产生，其生殖系转移效率为100％至33％之间。

[0081] 图7给出嵌合体小鼠和生殖系转移的后代的实际照片图。

[0082] 生殖系转移是检测干细胞多能性的金标准，实验数据显示分离得到的未成熟卵孤雌干细胞生殖系转移率为12～100％之间，远远高于以往孤雌胚胎干细胞生殖系转移率低于10％的文献报道。