一种颈复康制剂的检测方法

摘要

本发明为颈复康制剂的一种新的质量指标及检测方法，是将藁本内酯的含量作为颈复康制剂质量的检测指标，采用气相色谱内标法和高效液相色谱外标法进行测定；新的质量指标为：每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量为0.1～1.0mg；每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量不低于0.1mg，葛根素的含量不低于8.0mg；本发明的积极效果是：首次提出将藁本内酯作为颈复康制剂的质控指标，可运用液相色谱法和气相色谱内标法对颈复康制剂中藁本内酯含量进行测定，检测结果可靠，重现性好，为颈复康制剂的安全生产和更好地临床应用提供了一种新的质量控制指标和检测方法。

权利要求

1.一种颈复康制剂的检测方法，所述颈复康制剂是纯中药颗粒，由黄芪、党参、丹参、白芍、地黄、石决明、威灵仙、煅花蕊石、葛根、黄柏、秦艽、炒王不留行、川芎、苍术、羌活、去皮桃仁、制乳香、制没药、红花、酒炙地龙、酒炙土鳖虫21味药物组成，采用气相色谱内标法测定藁本内酯含量，其特征在于，其步骤为：(1)色谱条件与系统适应性

5％苯基甲基聚硅氧烷毛细管柱；程序升温：初始柱温80℃，保持2分钟，以

10-20℃·min^-1升温速率升至250℃，保持16分钟；FID检测器；按藁本内酯计理论塔板数不小于10000，分离度不小于1.5，连续进样5次，RSD不大于2％，用峰面积法测定，拖尾因子T在0.9～1.0间；

(2)内标溶液的制备

①精确称量邻苯二甲酸二乙酯0.1120g，甲醇定容于10毫升的容量瓶中；

②取步骤(2)①的溶液1.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为

1.12mg·mL^-1的邻苯二甲酸二乙酯内标溶液；

(3)标准品溶液的制备

①精密称量藁本内酯标准品0.0099g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.99mg·mL^-1的标准品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中待用；

②精确量取步骤(3)①的标准品溶液0.51mL，加入步骤(2)②的浓度为1.12mg·mL^-1邻苯二甲酸二乙酯内标溶液50μL，配制甲醇溶液，其内标浓度为0.224mg·mL^-1，藁本内酯浓度为0.202mg·mL^-1；

(4)供试品溶液的制备

取25g颈复康制剂，加入4～10倍量水，用2005版药典一部附录57挥发油测定方法提取颈复康制剂中挥发油，将提取的挥发油置于5mL棕色容量瓶中，加入步骤(2)②的浓度为1.12mg·mL^-1的邻苯二甲酸二乙酯内标溶液1.0mL，甲醇定容至刻度，得到挥发油浓度

3.44mg·mL^-1、内标物浓度为0.224mg·mL^-1的颈复康挥发油供试品溶液；

(5)相对校正因子的测定

取步骤(3)②中的溶液1μL注入气相色谱仪，连续进样6次，测得相对校正因子的平均值为0.8391，RSD为1.78％；

(6)测定

取步骤(4)中的颈复康挥发油供试品溶液1μL，注入气相色谱仪，样品中藁本内酯含量用内标法定量，平行测定三次。

2.根据权利要求1所述的一种颈复康制剂的检测方法，其特征在于，步骤(6)测得的藁本内酯在颈复康挥发油中的浓度为0.1～0.2mg/mL。

3.一种颈复康制剂的检测方法，所述颈复康制剂是纯中药颗粒，由黄芪、党参、丹参、白芍、地黄、石决明、威灵仙、煅花蕊石、葛根、黄柏、秦艽、炒王不留行、川芎、苍术、羌活、去皮桃仁、制乳香、制没药、红花、酒炙地龙、酒炙土鳖虫21味药物组成，采用高效液相色谱法测定藁本内酯含量，其特征在于，其步骤为：(1)色谱条件与系统适应性实验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～95∶40～5甲醇-水为流动相，进行梯度洗脱；检测波长320nm；理论塔板数按藁本内酯峰计算应不低于10000；分离度不低于1.5；

连续进样5次，RSD不大于2％；拖尾因子T在0.8～1.0间；

(2)对标准溶液的制备

精密称量藁本内酯对照品0.0101g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.0mL中含有1.01mg对照品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中；

(3)供试品溶液的制备

取50g颈复康制剂，加入4～10倍量水，照2005版药典附录57挥发油测定法提取挥发油，将提取的挥发油置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为3.68mg·mL^-1的颈复康挥发油供试品溶液；

(4)测定

①外标法测定：在0～5mL间分别取5个系列体积的标准对照品溶液，分别置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到系列浓度梯度的标准溶液；

②分别取(4)①中5个浓度梯度的标准溶液20μL注入Agilent1100高效液相色谱仪中，测定颈复康制剂挥发油中藁本内酯含量；

③得到工作曲线：y＝28843x+5.455，r＝0.9994；并从工作曲线上得到藁本内酯在颈复康挥发油中的浓度为0.1～0.2mg/mL。

说明书

一种颈复康制剂的检测方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及药物的制备和监测技术领域，具体的是一种颈复康制剂的检测方法，尤其是涉及藁本内酯的检测方法。【技术背景】

[0002] 颈复康制剂是纯中药颗粒，由黄芪、党参、丹参、白芍、地黄、石决明、威灵仙、花蕊石(煅)、葛根、黄柏、秦艽、王不留行(炒)、川芎、苍术、羌活、桃仁(去皮)、乳香(制)、没药(制)、红花、地龙(酒炙)、土鳖虫(酒炙)21味药物组成，具有疏风散寒止痛、通经活络、活血化瘀、益气补血等功效，用于治疗颈椎病引起的脑供血不足、头晕、颈椎僵硬、肩背酸痛、手臂麻木等症。在《中华人民共和国药典》(2005年版一部)的介绍中，对颈复康制剂的质量监控的是通过葛根药材进行的，含量测定采用的是高效液相色谱法，要求颈复康制剂每5g含葛根素( C21H2O9)不得少于8.0mg。而葛根素主要存在于颈复康浸膏中，所以，现在对颈复康的质量监控仅在于对浸膏中药效成分的控制。而在处方中，川芎、苍术、羌活、乳香、没药五种中药材是以提取的挥发油入药的，其中，川芎是本方的君药，其挥发油是颈复康制剂主要的药效成分，但是，目前对颈复康制剂中挥发油的药效成分却没有质量监控指标，这对颈复康制剂的制备和应用是会有影响的。

[0003] 川芎(Ligusticumchuanxiong Hort)，为伞形科植物的干燥根茎，被喻为“血中之气药”，具有活血祛癖、行气开郁、祛风止痛的功效，在《神农本草经》里被列为上品，是中医常用的活血化瘀药。在颈复康制剂中川芎是一味君药，其最有效的成分是挥发油。大量的文献表明，内酯类化合物是其主要成分，其中，藁本内酯是其最主要的成分之一，也是其最主要的活性成分。

[0004] 叶景在“川芎有效成分的提取技术”，李桂生在“藁本内酯的稳定性研究及异构化产物的GC-MS分析”中都表明：藁本内酯是川芎的主要成分，也是最主要的药效成分，其约占挥发油总量的58％。藁本内酯具有解痉扩血管、抗血小板聚集、抑制中枢神经系统、引血上行等功效，对脑供血不足的治疗有较好的疗效，在颈复康制剂中发挥着君药的作用。颈复康制剂可以治疗颈椎病 引起的脑供血不足、头晕、颈椎僵硬、肩背酸痛、手臂麻木等病症，藁本内酯起了主要的作用，因此，藁本内酯应该作为川芎药材质量评价的指标成分。但是，到目前为止，对川芎中阿魏酸和川芎嗪含量测定的报道较多，但是，对川芎中重要的活性成分藁本内酯含量的测定却报道较少。因此，有必要建立一种以藁本内酯为主的质量指标，并完善其检测方法，以促进颈复康制剂的完善制备和更好地应用。【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于克服现有对颈复康制剂中主要药效成分质量监控的不足，提供颈复康制剂的一种质量指标——以藁本内酯作为川芎药材质量评价的监测指标，及其检测方法，尤其是涉及藁本内酯的检测方法，以促进颈复康制剂的完善制备和更好地应用。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0007] 一种颈复康制剂的检测方法，将藁本内酯的含量作为颈复康制剂质量的检测指标，采用气相色谱内标法(GC)和高效液相色谱外标法(HPLC)进行测定。

[0008] 将藁本内酯的含量作为颈复康制剂质量的检测指标，每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量为0.1～1.0mg。

[0009] 将藁本内酯的含量作为颈复康制剂质量的检测指标，每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量不低于0.1mg，葛根素的含量不低于8.0mg。

[0010] 一种颈复康制剂检测方法，采用气相色谱内标法(GC)测定藁本内酯含量，其具体步骤为：

[0011] (1)色谱条件与系统适应性

[0012] 5％苯基甲基聚硅氧烷毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；程序升温：初始柱温80℃，保持2分钟，以10-20℃·min^-1升温速率升至250℃，保持16分钟；FID检测器；按藁本内酯计理论塔板数不小于10000，分离度不小于1.5，连续进样5次，RSD不大于2％，用峰面积法测定，拖尾因子T在0.9～1.0间；

[0013] (2)内标溶液的制备

[0014] ①精确称量邻苯二甲酸二乙酯0.1120g，甲醇定容于10毫升的容量瓶中； [0015] ②取步骤(2)①的溶液1.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得 到浓度为1.12mg·mL^-1的邻苯二甲酸二乙酯内标溶液；

[0016] (3)标准品溶液的制备

[0017] ①精密称量藁本内酯标准品0.0099g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.99mg·mL^-1的标准品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中待用；

[0018] ②精确量取步骤(3)①的标准品溶液0.51mL，加入步骤(2)②的浓度为1.12mg·mL^-1邻苯二甲酸二乙酯内标溶液50μL，配制甲醇溶液，其内标浓度为0.224mg·mL^-1，藁本内酯浓度为0.202mg·mL^-1；

[0019] (4)供试品溶液的制备

[0020] 取25g颈复康制剂，加入4～10倍量水(100～250mL)，用2005版药典(一部)附录57挥发油测定方法提取颈复康制剂中挥发油，将提取的挥发油置于5mL棕色容量瓶中，加入步骤(2)②的浓度为1.12mg·mL^-1的邻苯二甲酸二乙酯内标溶液1.0mL，甲醇定容至刻度，得到挥发油浓度3.44mg·mL^-1、内标物浓度为0.224mg·mL^-1的颈复康挥发油供试品溶液；

[0021] (5)相对校正因子的测定

[0022] 取步骤(3)②中的溶液1μL注入气相色谱仪，连续进样6次，测得相对校正因子的平均值为0.8391，RSD为1.78％(n＝6)；

[0023] (6)测定

[0024] 取步骤(4)中的颈复康挥发油供试品溶液1μL，注入气相色谱仪，样品中藁本内酯含量用内标法定量，平行测定三次，测得每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量。 [0025] 计算公式如下：

[0026]

[0027] 式中，mR为待测样品中藁本内酯的浓度，

[0028] Ms为内标物浓度，

[0029] fRS为藁本内酯相对于内标物的相对校正因子，

[0030] AR为GC分析测定报告中藁本内酯峰面积，

[0031] As为GC分析测定报告中内标物峰面积。

[0032] 本发明所述的一种颈复康制剂的检测方法，藁本内酯在颈复康挥发油中的浓度为0.1～0.2mg/mL。

[0033] 一种颈复康制剂的检测方法，采用高效液相色谱法(HPLC)测定藁本内酯含量，其具体步骤为：

[0034] (1)色谱条件与系统适应性实验

[0035] 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～95∶40～5甲醇-水为流动相，进行梯度洗脱；检测波长320nm；理论塔板数按藁本内酯峰计算应不低于10000；分离度不低于1.5；连续进样5次，RSD不大于2％，重复性较好；拖尾因子T在0.8～1.0间； [0036] (2)对标准溶液的制备

[0037] 精密称量藁本内酯对照品0.0101g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.0mL中含有1.01mg对照品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中；

[0038] (3)供试品溶液的制备

[0039] 取50g颈复康制剂，加入4～10倍量水(200～500mL)，照2005版药典附录57挥发油测定法提取挥发油，将提取的挥发油置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为3.68mg·mL^-1的颈复康挥发油供试品溶液；

[0040] (4)测定

[0041] ①外标法测定：在0～5mL间分别取5个系列体积的标准对照品溶液，分别置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到系列浓度梯度的标准溶液； [0042] ②分别取(4)①中5个浓度梯度的标准溶液20μL注入Agilent1100高效液相色谱仪中，测定颈复康制剂挥发油中藁本内酯含量；

[0043] ③得到工作曲线：y＝28843x+5.455，r＝0.9994；并从工作曲线上得到藁本内酯在颈复康挥发油中的浓度为0.1～0.2mg/mL。

[0044] 本发明一种颈复康制剂的检测方法的积极效果是：

[0045] (1)首次提出了将藁本内酯作为颈复康制剂的一个新的质量控制指标，提出了对颈复康制剂的质量控制应包括对其浸膏与挥发油的同时控制，新的质量指标为：每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量为0.1～1.0mg；每5g颈复 康制剂中藁本内酯(C12Hl4O2)的含量不低于0.1mg，葛根素( C21H2OO9)的含量不低于8.0mg；

[0046] (2)在继续应用原监测方法液相色谱法的基础上增加了用气相色谱内标法测定藁本内酯含量的手段；

[0047] (3)本发明的检测方法检测结果可靠，重现性好，为颈复康制剂的安全生产和更好地临床应用提供了一种新的质量控制指标和检测方法。【附图说明】

[0048] 附图1为本发明气相色谱内标法的阴性对照验证图，

[0049] 图中的S1、S2、S3分别是四味挥发油阴性供试品、藁本内酯标准品、川芎挥发油溶液与内标物阳性供试品溶液的气相色谱图；

[0050] 附图2为本发明气相色谱内标法的阳性对照验证图，

[0051] 图中的S1、S2、S3分别是藁本内酯标准品、川芎挥发油阳性供试品溶液、颈复康挥发油与内标物的供试品溶液的气相色谱图；

[0052] 附图3为藁本内酯相对邻苯二甲酸二乙酯内标物的相对校正因子气相色谱法图； [0053] 附图4为本发明液相色谱法的阴性对照图，

[0054] 图中的S1、S2、S3分别为同一色谱测定条件藁本内酯标准品、川芎挥发油阳性供试品、四味挥发油阴性供试品的液相色谱图；

[0055] 附图5为本发明液相色谱法的阳性对照图，

[0056] 图中的S1、S2、S3分别为同一色谱测定条件藁本内酯标准品、川芎挥发油阳性供试品、颈复康五味挥发油供试品溶液的液相色谱图。

[0057] 图中的标号分别为：

[0058] 1、藁本内酯，2、内标物。【具体实施方式】

[0059] 以下结合附图进一步说明本发明一种颈复康制剂的检测方法，并介绍2个实施例，但本发明的实施不限于以下的实施例。

[0060] 本发明提出了将藁本内酯的含量作为颈复康制剂质量的检测指标，每5g颈复康制剂中应含藁本内酯0.1～1.0mg；如果是将藁本内酯和葛根素共同作为颈复康制剂质量的检测指标物的话，每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量应 不低于0.1mg，葛根素的含量应不低于8.0mg。

[0061] 本发明一种颈复康制剂的检测方法采用气相色谱内标法测定藁本内酯含量通过了方法学的考察验证，其具体过程为：

[0062] (1)仪器与试剂

[0063] 采用Agilent 6820气相色谱仪，HP-5毛细管柱，FID检测器，挥发油测定器(上海玻璃仪器厂)；分析天平(精确度0.0001g，美国Ohaus公司)；藁本内酯对照品(天津马克生物技术有限公司提供)，邻苯二甲酸二乙酯(AR，上海凌峰化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，德国MERCK公司)。

[0064] (2)色谱条件的选择

[0065] 5％苯基甲基聚硅氧烷毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；程序升温：初始柱温80℃，保持2min，以16℃·min^-1升温速率升至250℃，保持16分钟；柱前压210kPa；FID检测器，检测器温度300℃；不分流；进样量为1μL。

[0066] (3)内标溶液的制备

[0067] ①精确称量邻苯二甲酸二乙酯0.1120g，甲醇定容于10毫升的容量瓶中； [0068] ②取步骤(3)①溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1.12mg·mL^-1的邻苯二甲酸二乙酯内标溶液；

[0069] (4)标准品溶液的制备

[0070] ①精密称量藁本内酯标准品0.0099g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.99mg·mL^-1的标准品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中待用；

[0071] ②精确量取步骤(4)①的标准品溶液0.51mL，加入1.12mg·mL^-1邻苯二甲酸二乙酯内标溶液50μL，配制甲醇溶液，该溶液中内标浓度为0.224mg·mL^-1，藁本内酯浓度为0.202mg·mL^-1；

[0072] (5)供试品溶液的制备

[0073] ①取25g颈复康制剂，加入4-10倍量水(100-250mL)，用2005版药典(一部)附录57挥发油测定方法，提取颈复康制剂中挥发油。提取得17.2mg挥发油，置于5mL棕色容量瓶中，加入步骤(3)②的1.12mg·mL^-1的内标溶液1.0mL，甲醇定容至刻度，得到挥发油浓度3.44mg·mL^-1，内标物浓度 为0.224mg·mL^-1的颈复康挥发油供试品溶液； [0074] ②精确称量川芎挥发油(自制)0.0422g，置于10mL的容量瓶中，加入0.0251g甲醇定容，得到溶液含4.22mg·mL^-1的川芎挥发油和2.51mg·mL^-1内标物。 [0075] ③取步骤(5)②溶液1.0mL，转移到10mL容量瓶中，得到含0.422mg·mL^-1的川芎挥发油和0.251mg·mL^-1内标物的阳性供试品溶液。

[0076] ④精密称量羌活、没药、苍术、乳香四味混提挥发油0.0354g，用甲醇定容，置于10mL容量瓶中，得到浓度为3.54mg·mL^-1的四味挥发油的阴性供试品溶液。 [0077] (6)相对校正因子的测定

[0078] 取步骤(4)中的标准品溶液1μL，注入气相色谱仪，连续进样6次，测得相对校正因子的平均值为0.8391，RSD为1.78％(n＝6)，色谱图见附图3。

[0079] (7)阴性对照试验

[0080] 分别取步骤(4)①的标准品溶液、步骤(5)③的川芎挥发油阳性供试品溶液、步骤(5)④的四味挥发油的阴性供试品溶液1μL，按步骤(2)选定的色谱条件分别进样，三者的色谱图用2004年A版中药色谱指纹图谱相似度匹配系统进行匹配，其结果见附图1，在藁本内酯保留时间位置上阴性供试液色谱无明显干扰。

[0081] (8)阳性对照试验

[0082] 分别取步骤(4)①的标准品溶液、步骤(5)②的川芎挥发油供试品溶液、步骤(5)①的颈复康挥发油溶液各1μL，按步骤(2)选定的色谱条件分别进样，三者的色谱图用2004年A版中药色谱指纹图谱相似度匹配系统进行匹配，其结果见附图2，在藁本内酯保留时间位置上阳性供试品和供试品都有明显的峰。

[0083] (9)线性考察试验

[0084] 分别取步骤(4)0.99mg·mL^-1的5份标准品溶液：50、100、150、200、250μL，每份都加入1.12mg·mL^-1的内标溶液100μL，最后用甲醇定容置500μL，最后得到0.049、0.099、0.1485、0.198、0.2475mg·mL^-1的一系列标准品溶液，内标物浓度都是
0.224mg·mL^-1。

[0085] 5个点分别取1μL进样，按步骤(2)的色谱条件进行测定，最后得到的 工作曲线为：

[0086] y＝10.308x-0.2067，r＝0.9991；藁本内酯在0.049-0.2475μg的浓度范围内线性关系良好。

[0087] (10)精密度试验

[0088] 取步骤(5)①的颈复康挥发油供试品溶液连续进样6次，按步骤(2)的色谱条件分析测定：

[0089] 以藁本内酯峰面积计，RSD＝1.86％；按藁本内酯计，保留时间的平均值：9.2775min，RSD＝0.0837％，表明本方法具有良好的精密度；

[0090] 按内标物邻苯二甲酸二乙酯计，保留时间的平均值：8.1455min，RSD＝0.0129％，仪器精密度良好。

[0091] (11)稳定性实验

[0092] 取步骤(5)①的颈复康挥发油供试品溶液按样品含量测定法每隔2小时进样1μL，在步骤(2)的色谱条件下分析测定：

[0093] 以藁本内酯与内标物峰面积之比计，RSD＝1.28％，表明试液在0-24h内稳定性良好。

[0094] (12)重现性试验

[0095] 取同一批川芎挥发油，按照步骤(5)①的颈复康挥发油供试品溶液的配置方法配置5份同等浓度的溶液，取这5份溶液的各1μL注入色谱仪，按步骤(2)的色谱条件进行测定：以藁本内酯含量计，RSD＝1.72％，表明该方法的重现性良好。

[0096] (13)回收率试验

[0097] ①用步骤(12)中5份同等藁本内酯浓度的供试品各100μL，得到该5份样品中藁本内酯的质量；

[0098] ②向前4份溶液中加入步骤(9)中的藁本内酯第5号标准品各100μL，向第5份溶液中加入步骤(9)中的藁本内酯第4号标准品100μL，平均回收率为103.7％，五次实验的RSD＝1.96％，回收良好。

[0099] (14)样品测定

[0100] 取步骤(5)①的颈复康挥发油溶液1μL，按步骤(2)的色谱条件进样，样品中藁本内酯的含量用气相色谱内标法进行测定，平行测定三次；计算公式如下： [0101]

[0102] 式中，mR为待测样品中藁本内酯的浓度，

[0103] Ms为内标物浓度，

[0104] fRS为藁本内酯相对于内标物的相对校正因子，

[0105] AR为GC分析测定报告中藁本内酯峰面积，

[0106] As为GC分析测定报告中内标物峰面积。

[0107] 2500g颈复康制剂成药中藁本内酯含量(mg)＝挥发油中藁本内酯浓度(mg·mL^-1)×5mL×藁本内酯纯度×五味挥发油总质量(mg)/取颈复康挥发油的质量(mg)。

[0108] 每克颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg)＝2500g颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg)/2500g成药质量；

[0109] 每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量(mg/袋)＝每克颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg/g)×5(g)。

[0110] 验证结果见表1。

[0111] 表1、气相色谱内标法测定颈复康制剂中藁本内酯含量的结果

[0112]

[0113] 本发明一种颈复康制剂的检测方法采用液相色谱法(HPLC)测定藁本内酯含量也通过了方法学的考察验证，其具体过程为：

[0114] (1)仪器和试剂

[0115] Agilent 1100高效液相色谱仪，四元梯度洗脱泵，DAD检测器；挥发油测定器(上海玻璃仪器厂)；分析天平(美国Ohaus公司)；藁本内酯对照品(天津马克生物技术有限公司提供)，甲醇(色谱纯，德国MERCK公司)。

[0116] (2)色谱条件

[0117] 色谱柱：Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：320nm； [0118] 流动相：甲醇(D)和水(A)，梯度洗脱：0～25分钟，甲醇(D)从60％到70％，水(A)从40％到30％、25～30分钟，甲醇(D)从70％到80％，水(A)从30％到20％、30～35分钟，甲醇(D)从80％到95％，水(A)从20％到5％；流速1.0mL·min^-1；柱温25℃；
进样量20μL。

[0119] (3)标准品溶液的制备

[0120] 精密称量藁本内酯对照品0.0101g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.0mL中含有1.01mg对照品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中。

[0121] (4)供试品溶液的制备

[0122] ①取50g颈复康制剂，加入4-10倍量水(200-500mL)，照2005版药典附录57挥发油测定法提取挥发油，提取得36.8mg挥发油，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到3.68mg·mL^-1颈复康挥发油供试品溶液；

[0123] ②精密称量羌活、没药、苍术、乳香四味混提挥发油0.0354g，用甲醇定容置10mL容量瓶中，得到浓度为3.54mg·mL^-1的四味挥发油阴性供试品溶液；

[0124] ③精密称量川芎挥发油(自制)31.7mg，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到3.17mg·mL^-1的川芎挥发油溶液；

[0125] ④精确量取步骤(4)③溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，甲醇定容，得到0.317mg·mL^-1的川芎挥发油阳性供试品溶液。

[0126] (5)阴性对照试验

[0127] 分别取步骤(3)标准品溶液、步骤(4)④川芎挥发油阳性供试品溶液、步骤(4)②四味挥发油阴性供试品溶液20μL，按步骤(2)的色谱条件分别测定三者的色谱图，用2004年A版中药色谱指纹图谱相似度匹配系统进行匹配，结果见附图4。从图4可以看到，在藁本内酯保留时间位置上阴性供试液色谱无明显干扰。

[0128] (6)阳性对照试验

[0129] 分别取步骤(3)标准品溶液、步骤(4)④川芎挥发油阳性供试品溶液、步骤(4)①颈复康挥发油供试品溶液20μL，按步骤(2)的色谱条件分别测定三者的色谱图，用2004年A版中药色谱指纹图谱相似度匹配系统进行匹配，结果见附图5，在藁本内酯保留时间位置上阳性供试品和供试品都有明显的峰。

[0130] (7)线性关系的考察

[0131] 分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL的5份标准对照品溶液，分别置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度分别为0.0505、0.101、0.1515、0.202、0.2525mg·mL^-1的系列标准溶液；

[0132] 在步骤(2)的色谱条件下，把5份浓度系列的溶液分别注入高效液相色谱仪中，以峰面积为纵坐标(mAU)，以藁本内酯标准对照品浓度(mg·mL^-1)的横坐标，得到标准工作曲线：y＝28843x+5.455，r＝0.9994。藁本内酯在1.01μg-5.05μg范围内线性关系良好。

[0133] (8)精密度试验

[0134] 精密吸取对照品溶液20μL，按步骤(2)的色谱条件连续进样8次，按照藁本内酯峰面积计，相对标准偏差RSD＝0.85％，表明本方法具有良好的精密度。藁本内酯保留时间平均值为19.51，RSD＝1.3％，该特征峰在19.76～19.26间波动。

[0135] (9)稳定性试验

[0136] 取同一对照品溶液，按样品含量测定法每隔2小时取10μL，在步骤(2)的色谱条件下分别进样，以藁本内酯峰面积计，相对标准偏差RSD＝0.89％，表明试液在0～24小时内稳定。

[0137] (10)重现性试验

[0138] 分别配制5个同一浓度的样品溶液，在步骤(2)的色谱条件下分别进样，以藁本内酯峰面积计RSD＝0.95％，表明本方法具有良好的重现性。

[0139] (11)加样回收率试验

[0140] 取步骤(7)中0.202mg·mL^-1的标准溶液作为标准加样储备液，取步骤(10)中已知藁本内酯含量的5份川芎挥发油溶液，分别加入藁本内酯标准品溶液0.9mL，平行5份作为加样回收样品，在步骤(2)的色谱条件下取20μL分别进样，以2.0mL中的绝对量计算加样回收率，结果平均回收率为106.8％，RSD＝2.1％。

[0141] (12)样品测定

[0142] 按照步骤(2)方法对三批样品进行测定，结果见表2。

[0143] 计算公式如下：

[0144] 2500g颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg)＝挥发油中藁本内酯浓度(mg·mL^-1)×10mL×藁本内酯纯度X五味挥发油总质量(mg)/取颈复 康挥发油的质量(mg)；

[0145] 每克颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg)＝2500g颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg)/2500g成药质量；

[0146] 每5g颈复康制剂中藁本内酯的含量(mg/袋)＝每克颈复康制剂成药中藁本内酯的含量(mg/g)×5(g)。

[0147] 表2、液相色谱法(HPLC)测定颈复康制剂中藁本内酯含量的结果

[0148]

[0149] 以下介绍本发明的2个实施例。

[0150] 实施例1

[0151] 以藁本内酯含量作为颈复康制剂质量的检测指标，按照《中华人民共和国药典》(2005年版一部)附录VI E气相色谱法进行测定：

[0152] (1)色 谱条 件 与 系 统适 用 性：5 ％ 苯 基甲 基 聚 硅 氧烷 毛 细 管柱(30m×0.32mm×0.25m)；程序升温：初始柱温80℃，保持2分钟，以10-20℃·min^-1升温速率升至250℃，保持16分钟；FID检测器；按藁本内酯计理论塔板数不小于10000； [0153] (2)内标溶液的制备

[0154] ①精确称量邻苯二甲酸二乙酯0.1120g，甲醇定容于10毫升的容量瓶中， [0155] ②取上述溶液1.0mL置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1.12mg·mL^-1的内标溶液；

[0156] (3)标准品溶液的制备

[0157] ①精密称量藁本内酯标准品0.0099g，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到0.99mg·ml^-1的标准品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中待用；

[0158] ②精确量取步骤(3)①的标准品溶液0.51mL，加入1.12mg·ml^-1邻苯 二甲酸二乙酯内标溶液50μL，配制甲醇溶液，该溶液中内标浓度为0.224mg·ml^-1，藁本内酯浓度为0.202mg·ml^-1；

[0159] (4)供试品溶液的制备

[0160] 取25g颈复康制剂，加入8倍量水(200mL)，用2005版药典(一部)附录57挥发油测定方法，提取颈复康制剂中挥发油。提取得17.2mg挥发油，置于5ml棕色容量瓶中，加入步骤(2)②的1.12mg·ml^-1的内标溶液1.0ml，甲醇定容至刻度，得到挥发油浓度3.44mg·ml^-1，内标物浓度为0.224mg·ml^-1的颈复康挥发油供试品溶液； [0161] (5)相对校正因子的测定

[0162] 取步骤(3)②中的标准品溶液1μL注入气相色谱仪，连续进样6次，测得相对校正因子的平均值为0.8391，RSD为1.78％(n＝6)；

[0163] (6)测定

[0164] 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各1μL，注入气相色谱法仪，用气相色谱内标法(GC)进行测定：

[0165] 每5g颈复康制剂含藁本内酯(C12Hl4O2)不得少于0.1mg。

[0166] 新的颈复康制剂质量控制指标为：每5g颈复康制剂含葛根素( C21H2OO9)不低于8.0mg，含藁本内酯(C12H14O2)不低于0.1mg。

[0167] 其公式计算为：

[0168]

[0169] 式中，mR为待测样品中藁本内酯的浓度，

[0170] Ms为内标物浓度，

[0171] fRS为藁本内酯相对于内标物的相对校正因子，

[0172] AR为GC分析测定报告中藁本内酯峰面积，

[0173] As为GC分析测定报告中内标物峰面积。

[0174] 实施例2

[0175] 安照《中华人民共和国药典》(2005年版一部)附录VI D高效液相色谱法进行测定：

[0176] (1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；60-95∶40-5甲醇-水为流动相，梯度洗脱；柱温25℃；检测波长320nm；理 论塔板数按藁本内酯峰计算应不低于10000；

[0177] (2)精密称量藁本内酯对照品0.0101g，置于10mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.0mL中含有1.01mg对照品溶液，闭光保存于-18℃冰箱中。

[0178] (3)供试品溶液制备：取50g颈复康制剂，加入8倍量水400mL，照2005版药典附录57挥发油测定法提取挥发油，提取得36.8mg挥发油，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到3.68mg·mL^-1颈复康挥发油供试品溶液；

[0179] (4)测定法：分别精密吸取对照品与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪进行测定：

[0180] 每5g颈复康制剂含藁本内酯(C12H14O2)不得少于0.1mg。

[0181] 新的颈复康制剂质量控制指标为：每5g颈复康制剂含葛根素( C21H2OO9)不低于8.0mg，含藁本内酯(C12H14O2)不低于0.1mg(与气相色谱内标法的测定结果一致，因此证明，气相色谱内标法与高效液相色谱法都可以作为测定藁本内酯含量的方法。