一种重组蓝藻

摘要

本发明公开了一种重组蓝藻。该重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向色球藻科蓝藻中导入如下1)或2)中所述的丁醇合成相关基因：1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

权利要求

1.一种重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向蓝藻中导入丁醇合成相关基因；所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶和3-羟丁酰辅酶A脱氢酶；

所述烯酰水合酶为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述丁酰辅酶A脱氢酶为由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白B亚基为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白A亚基为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述乙醇脱氢酶为由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蓝藻为淡水蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803或海水蓝藻聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002。

2.根据权利要求1所述的重组蓝藻，其特征在于：所述方法包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。

3.根据权利要求2所述的重组蓝藻，其特征在于：所述灭活的方法为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。

4.根据权利要求3所述的重组蓝藻，其特征在于：所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因；所述灭活的方法为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因。

5.根据权利要求4所述的重组蓝藻，其特征在于：所述灭活的方法是通过同源重组实现的。

6.根据权利要求1-5中任一所述的重组蓝藻，其特征在于：所述烯酰水合酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子；

所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’ 末端第

800-1939位核苷酸的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为：核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；

所述乙醇脱氢酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的重组蓝藻，其特征在于：所述重组蓝藻为蓝藻集胞藻SMB-100 CGMCC No.2795.和聚球藻SMB-101 CGMCC No.2794。

说明书

一种重组蓝藻

技术领域

[0001] 本发明涉及一种重组蓝藻。

背景技术

[0002] 全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源的要求，而粮食短缺问题又要求可再生清洁能源的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。

[0003] 丁醇(butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。此外，丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料，具有如下优点：其热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；其不腐蚀管道，便于管道输送；其蒸汽压低，安全性高，能与汽油以任意比混合。

[0004] 丁醇可由发酵和石油化工合成法生产，由于石油危机，丁醇发酵生产成为研究热点。发酵生产主要是通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵粮食生产丁醇。从70年代起三十几年的研究，阐明了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢途径，使丁醇发酵生产取得了很大进展。但丁醇发酵生产存在发酵底物成本高、产物丁醇中混杂有丙酮、丙酮丁醇梭菌严格厌氧及丁醇对细胞有毒害等缺点。因此，科学家们在改进发酵生产丁醇的同时也在探索用非厌氧菌生物合成丁醇。美国和日本的科学家先后将丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途径导入大肠杆菌中，并得到有丁醇产生的菌株。这种方法虽然解决了梭菌发酵生产丁醇时产物中混有丙酮和产丁醇梭菌的严格厌氧不利于操作的问题，但大肠杆菌仍为异养菌，其原料成本依然很高，没有解决发展生物能源与粮食问题的冲突。

[0005] 蓝藻(blue-green algae)又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻能够利用二氧化碳和太阳能快速繁殖，而且其广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，易于基因操作。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种产丁醇的重组蓝藻。

[0007] 本发明所提供的重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向蓝藻中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因：

[0008] 1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶(又称烯酰辅酶A水合酶)、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；

[0009] 2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；

[0010] 3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。

[0011] 所述丁醇合成相关基因还可包括如下酶的编码基因：3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)和/或丁醇脱氢酶。

[0012] 所述方法还可包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。

[0013] 所述灭活的方法可为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。

[0014] 所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因具体可为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因；所述灭活的方法具体可为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因。

[0015] 所述灭活的方法可以是通过同源重组实现的。

[0016] 本发明方法中导入的丁醇合成相关基因可以自行通过复制型重组质粒来进行表达(即不包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤的情况)，也可以整合到染色体上进行表达(即包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤情况)，或者二者同时进行。

[0017] 所述各酶可以是如下氨基酸序列的蛋白质：

[0018] 所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质：

[0019] 1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0020] 2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质；

[0021] 所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质：

[0022] a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0023] b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质；

[0024] 所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质：

[0025] I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0026] II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质；

[0027] 所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质：

[0028] i由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0029] ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质；

[0030] 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质：

[0031] ①由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0032] ②将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有3-羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质；

[0033] 所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质：

[0034] A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0035] B.将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质；

[0036] 所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质：

[0037] A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0038] B)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质；

[0039] 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)为如下(1)或(2)所述的蛋白质：

[0040] (1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0041] (2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。

[0042] 所述导入的各酶的核苷酸序列可以如下：

[0043] 所述烯酰水合酶的编码基因为如下1)、2)或3)所述的基因：

[0044] 1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子；

[0045] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0046] 3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0047] 所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a)、b)或c)所述的基因：

[0048] a)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第800-1939位核苷酸的DNA分子；

[0049] b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0050] c)与a)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0051] 所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、II或III所述的基因：

[0052] I其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子；

[0053] II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0054] III与I限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0055] 所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、ii或iii所述的基因：

[0056] i其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子；

[0057] ii在严格条件下与i限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0058] iii与i限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0059] 所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因：

[0060] ①核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；

[0061] ②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0062] ③与①限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0063] 所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、B或C所述的基因：

[0064] A.其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子；

[0065] B.在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0066] C.与A限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0067] 所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因：

[0068] (1)其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子；

[0069] (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0070] (3)与(1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0071] 所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因：

[0072] (1)其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子；

[0073] (2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

[0074] (3)与(1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

[0075] 本发明中所用的出发菌可以蓝藻门中的任一蓝藻，具体可以是色球藻科蓝藻，具体可如色球藻科蓝藻为淡水蓝藻聚球藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)和海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)。

[0076] 本发明中得到的重组蓝藻具体为蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100CGMCC No.2795和聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101 CGMCC No.2794。

[0077] 蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2795。

[0078] 聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2794。

[0079] 本发明利用了蓝藻可以进行光合自养的特性、可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点。

[0080] 本发明对蓝藻代谢途径进行改造和重建，在蓝藻中建立丁醇合成途径，使其具有产丁醇的能力。这样构建的重组蓝藻根据其自身的光合自养的特点来大量繁殖，从而产生更多的能源产品丁醇。本发明中使用蓝藻自身的诱导启动子，在控制丁醇合成途径的同时又避免了丁醇对蓝藻的毒害作用。

[0081] 本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

附图说明

[0082] 图1为重组蓝藻SMB-100的鉴定。

[0083] 图2为标准品中丁醇的色谱图。

[0084] 图3为重组蓝藻SMB-100培养液中丁醇的色谱图。

[0085] 图4为重组蓝藻SMB-101的鉴定。

具体实施方式

[0086] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0087] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。

[0088] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

[0089] 本发明的总体构思如下：

[0090] 一、通过代谢工程改造，在蓝藻中建立丁醇合成途径：

[0091] 1、从丙酮丁醇梭菌中克隆丁醇合成途径中所需酶的编码基因：烯酰水合酶(crt)、丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)、电子转移黄素蛋白B亚基(etfB)、电子转移黄素蛋白A亚基(etfA)、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)和乙醇脱氢酶(adhe)。其中前五个基因crt、bcd、etfB、etfB和hbd为一个操作子，将其命名为命名为crt操纵子。

[0092] 2、在蓝藻中诱导表达crt操纵子：构建蓝藻表达载体pAM-crt，使crt操纵子在蓝藻内源铜诱导启动子的启动下，在蓝藻中诱导表达。

[0093] 3、在蓝藻中表达乙醇脱氢酶基因(adhe)：通过同源重组，将adhe基因整合在蓝藻基因组DNA上，并使其表达。

[0094] 二、工程蓝藻的鉴定及丁醇的诱导合成与检测：

[0095] 1、基因水平鉴定上述丁醇合成途径所需酶的编码基因已成功转入蓝藻中；

[0096] 2、通过诱导激活工程藻中建立的丁醇合成途径，使工程藻产丁醇；通过液相色谱检测工程蓝藻中有丁醇产生。

[0097] 下述实施例中，出发菌分别为色球藻科集胞藻属淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)(Zhang S，Spann KW，et al.Identification oftwo genes，sll0804 and slr1306，as putative components of theCO2-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strainPCC 6803.J Bacteriol.2008 190：8234-7；)(中国科学院微生物研究所)和色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)；(Jin Z，Heinnickel M，et al.Biogenesis of iron-sulfur clusters in photosystem I：holo-NfuA from the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 rapidly andefficiently transfers[4Fe-4S]clusters to apo-PsaC in vitro.J Biol Chem.2008，283：28426-35)(中国科学院微生物研究所)。

[0098] 丙 酮 丁 醇 梭 菌 为 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (Clostridium acetobutylicum)ATCC824(US2007020740(A1))；蓝 藻 表 达 载 体 pAM2770(Wu X，Li DW，et al.The Anabaenasp.strain PCC 7120 asr1734 gene encodes a negative regulator of heterocystDevelopment.Molecul Microbiol.2007，64：782-794.)(中国 科学院微 生物研究所)；质粒pRL271(Wei TF，Ramasubramanian TS，et al.Anabaena sp.strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocyst development.JBacteriol.1994，176：4473-4482.)。(中国科学院微生物研究所)。

[0099] 下述实施例中Synechocystis sp.PCC 6803及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为BG-11培养基，基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

[0100] 下述实施例中Synechococcus sp.PCC 7002及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为Medium 957培养基，基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

[0101] BG-11培 养 基 组 成：每 升 培 养 基 中 含 有NaNO3 1.5g，K2HPO4 0.04g，MgSO4·7H2O0.075g，CaCl2·2H2O 0.036g，柠 檬 酸0.006g，柠 檬 酸 铁 铵 0.006g，EDTA(disodiumsalt)0.001g，Na2CO3 0.02g，Trace metal mix A5 1.0ml，琼脂10.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.1±0.3。

[0102] Medium 957培养基组成：每升培养基中含有蒸馏水250.0ml，海水750.0ml，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl2·2H2O 0.02g，NaNO3 0.75g，K2HPO4·3H2O 0.02g，柠檬酸3.0mg，柠檬酸铁铵3.0mg，EDTA(disodium potassium salt)乙二胺四乙酸0.5mg，Na2CO3 0.02g，Trace metal mix A51.0ml，琼脂10.0g，pH 8.5±0.3。

[0103] Trace metal mix A5组成：每升 中含 有H3BO3 2.86g，MnCl2·4H2O 1.81g，ZnSO4·7H2O 0.222g，NaMoO4·2H2O 0.39g，CuSO4·5H2O 0.079g，Co(NO3)2·6H2O49.4mg，蒸馏水1.0L。

[0104] 实施例1、色球藻科集胞藻属(Synechocystis)淡水蓝藻集胞藻的重组构建[0105] 本实施例中使用的出发蓝藻为淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)。

[0106] 一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

[0107] 本实验中的丁醇合成相关基因由crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因组成，组成一个crt操纵子，各基因均来自梭菌。

[0108] 1、crt操纵子的扩增：

[0109] 提取丙酮丁醇梭菌基因组DNA；

[0110] 根据丙酮丁醇梭菌基因组中crt操纵子DNA序列和蓝藻表达载体pAM2770上的酶切位点设计引物如下：

[0111] crtF：ATTC GAGCTC AATGGAACTAAACAATGTCATCCT(下划线部分为SacI酶切位点)；

[0112] crtR：CG GGATCC ATGGGGATTCTTGTAAACTTATT(下划线部分为BamHI酶切位点)。

[0113] 以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板、以crtF和crtR为引物，进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，得到的基因的序列如序列表中序列1所示，表明扩增产物为有crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因的crt操纵子，序列正确，其中自序列1的5’末端第1-786位核苷酸为crt基因的序列，第800-1939位核苷酸为bcd基因的序列，第1958-2737核苷酸为etfB基因的序列，第2756-3766位核苷酸为etfA基因的序列，第3871-4719位核苷酸为hbd基因的序列。

[0114] 2、重组蓝藻表达载体pAM-crt的构建：

[0115] 为避免丁醇对蓝藻生长的毒害作用，使用蓝藻内源启动子铜诱导启动子petE在蓝藻中诱导表达crt操纵子。

[0116] 用限制性内切酶SacI和BamHI酶切上述crt操纵子；用限制性内切酶SacI和BamHI酶切蓝藻表达载体pAM2770，回收大片段；将两酶切产物连接，连接产物转化至大肠杆菌中，通过50μg/ml卡那霉素筛选，得到重组质粒。重组质粒序列分析结果表明，crt操纵子正确插入到pAM2770载体上铜诱导启动子petE下游SacI和BamHI位点，并且插入的序列正确，将正确的阳性重组蓝藻表达载体命名为pAM-crt。

[0117] 3、pAM-crt对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选：

[0118] 转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pAM-crt加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时；

[0119] 筛选：在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓度为10μg/ml；

[0120] 将得到的阳性重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM-crt。

[0121] 4、空载体pAM2770对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选：

[0122] 转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pAM2770加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时。

[0123] 筛选：在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓度为10μg/ml。；

[0124] 将得到的含空载体的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770。

[0125] 二、用丙酮丁醇梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC6803中PHB合成酶基因

[0126] 由于蓝藻中存在聚羟基丁酸(PHB)次级代谢途径，PHB合成与丁醇合成有共同的前体，而PHB合成酶的敲除不影响蓝藻生长，因此，用丁醇合成途径中最后一个酶乙醇脱氢酶基因(adhe)来取代蓝藻基因组中的PHB合成酶基因(phb)，构建整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down，通过同源重组，用adhe和氯霉素抗性基因(Cm)取代蓝藻PHB合成酶基因。

[0127] 1、蓝藻同源重组整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down的构建：

[0128] adhe基因的获得：以丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板，用下述引物(adheF/adheR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到adhe基因，其核苷酸序列如序列表中序列2中第610-3186位核苷酸所示。

[0129] up为蓝藻基因组DNA中phb编码区上游的600bp DNA片段，通过以下方法获得：以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物进行PCR扩增，PCR产物测序，得到up序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第1-609位核苷酸所示。

[0130] down为蓝藻基因组DNA中phb编码区下游的600bp DNA片段，通过以下方法获得：以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物(downF/downR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到down序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第4402-4996位核苷酸所示。

[0131] Cm序列的获得：以质粒pRL271为模板，用下述引物(CmF/CmR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到Cm序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第3352-4401位核苷酸所示。

[0132] up-adhe的获得：首先PCR分别扩增得到up和adhe，然后再把两片段混在一起作模板，用upF/adheR引物对进行第二轮PCR扩增，得到up-adhe；

[0133] Cm-down的获得：首先PCR分别扩增得到Cm和down，然后再把两片段混在一起作模板，用CmF/downR引物对进行第二轮PCR扩增，得到Cm-down；；

[0134] pUC-up-adhe-Cm-down的获得：用限制性内切酶XbaI酶切Cm-down，用限制性内切酶XbaI酶切pUC-18载体，连接得到重组载体pUC-18/Cm-down；用限制性内切酶BamHI酶切up-adhe，用限制性内切酶BamHI酶切pUC-18/Cm-down，连接得到重组载体pUC-up-adhe-Cm-down。

[0135] 阳性质粒的转化及筛选：用pUC-up-adhe-Cm-down转化大肠杆菌，经50μg/ml氨苄霉素和30μg/ml氯霉素筛选阳性克隆。

[0136] 阳性质粒的验证：将筛选得到的阳性质粒进行测序，表明插入的up-adhe-Cm-down序列如序列表中序列2所示，得到载体pUC-up-adhe-Cm-down正确；

[0137] 扩增各片段及融合PCR所需引物如下：

[0138] upF：5’-CGCGGATCCCAGATTCGGTCTTCCCCCAGGCG(BamHI)

[0139] upR：5’-CTTTTTGATTTGTAACTTTCATGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC(up-adhe融合所需嵌合引物)

[0140] adheF：5’-ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGA

[0141] adheR：5’-CGCGGATCCAAAGAATTGTGGAGTAAAGGATA(BamHI)

[0142] CmF：5’-GCTCTAGAGGTTGATAATGAACTGTGCTGAT(XbaI)

[0143] CmR：5’-GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAAATCGAATTTCTGCCATTCATCCG[0144] (Cm-down融合所需嵌合引物)

[0145] downF：5’-TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC

[0146] downR：5’-GCTCTAGAGATATCGAAGCGGACAACGGCAT(XbaI)

[0147] 2、将pUC-up-adhe-Cm-down转化至实验一中的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt中：

[0148] 转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pUC-up-adhe-Cm-down加入到细胞液中混匀，光照下静止培养5小时。

[0149] 筛选：在含有氯霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，氯霉素筛选浓度为10μg/ml；将筛选得到的重组蓝藻命名为SMB-100。

[0150] 同时向蓝藻PCC 6803/pAM2770中转入空载体pUC-18，将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770/pUC，作为对照；同时向蓝藻PCC 6803中转入空载体pUC18，作为对照，将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pUC。

[0151] 三、重组蓝藻SMB-100的验证及目标产物丁醇的检测

[0152] (1)基因水平鉴定：

[0153] 分别提取蓝藻SMB-100、PCC 6803/pAM2770、PCC 6803/pUC和PCC 6803/pAM2770/pUC的总DNA；再分别以crtF、crtR和phb700F、phb700R(蓝藻PHB合成酶基因的上下游700bp处设计的引物)为引物，进行PCR扩增。结果如图1A所示，在SMB-100中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段，大小与crt操纵子一致；在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-100中。结果如图1B所示，在SMB-100中，用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down一致；在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp，这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-100中，并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图1中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-100的鉴定，泳道1：DNA Maker λDNA/HindIII，泳道2：SMB-100，泳道3：对照组PCC 6803/pAM2770，泳道4：对照组PCC6803/pUC、泳道5：对照组PCC 6803/pAM2770/pUC；B为adhe基因整合到SMB-100基因组的鉴定，泳道1：DNA MakerλDNA/HindIII，泳道2：SMB-100，泳道3：对照组PCC6803/pAM2770，泳道4：对照组PCC 6803/pUC，泳道5：对照组PCC6803/pAM2770/pUC)。phb700F：
5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’，phb700R：5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

[0154] (2)重组蓝藻SMB-100生产丁醇性能的检测：

[0155] 将重组蓝藻SMB-100接种于不含铜的BG-11培养基中，在30℃、60μmol m-2s-1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到OD730＝1.5；向培养液中加入2μM CuSO4使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而诱导丁醇合成；
在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。

[0156] 液相色谱检测方法为：样品前处理：取培养液12000rpm离心1min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤；色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4，流速0.5ml/min。

[0157] 丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品中丁醇的保留时间为40.9分钟，丁醇标准品的检测图谱如图2所示(A表示丁醇)。

[0158] 重组蓝藻SMB-100培养液的上清的检测图谱如图3所示(A表示丁醇)。

[0159] 实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-100生产丁醇的能力为0.27g/L培养液。

[0160] 实施例2、色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002的重组构建

[0161] 本实施例中使用的出发蓝藻为海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC7002)。

[0162] 一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

[0163] 导入基因的序列及导入方法均与实施例1中一所述一致。

[0164] 转入空载体pAM2770的重组蓝藻命名为PCC 7002/pAM2770。

[0165] 二、用梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中PHB合成酶基因

[0166] 方法均与实施例1中二所述一致。

[0167] 既导入空载体pAM2770又导入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC7002/pAM2770/pUC，作为对照；向蓝藻PCC 7002中转入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC 7002/pUC。

[0168] 将得到的含有adhe基因和crt操纵子的重组蓝藻命名为SMB-101。

[0169] 三、蓝藻SMB-101的验证及目标产物丁醇的检测

[0170] (1)基因水平鉴定：

[0171] 鉴定方法与实施例1中三所述一致。

[0172] 结果如图4A所示，在SMB-101中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段，大小与crt操纵子一致；在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-101中。结果如图4B所示，在SMB-101中，用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down一致；在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-101中，并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图4中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-101的鉴定，1：
DNA MakerλDNA/HindIII；2：SMB-101；3：对照组PCC 7002/pAM2770，4：对照组PCC 7002/pUC，5：对照组PCC 7002/pAM2770/pUC；B为adhe基因整合到SMB-101基因组的鉴定，1：DNA MakerλDNA/HindIII；2：SMB-101；3：对照组PCC 7002/pAM2770，4：对照组PCC 7002/pUC，
5：对照组PCC 7002/pAM2770/pUC)。phb700F：5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’，phb700R：
5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

[0173] (2)重组蓝藻SMB-101生产丁醇性能的检测：

[0174] 将重组蓝藻SMB-101接种于不含铜的Medium 957培养基中，在30℃、-2 -160μmolm s 光照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到OD730＝1.5；向培养液中加入2μM CuSO4使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而诱导丁醇合成；在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。

[0175] 色谱检测方法及条件同实施例1中三一致。

[0176] 实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-101生产丁醇的能力为0.22g/L培养液。

[0177] 序列表

[0178] <210>1

[0179] <211>4736

[0180] <212>DNA

[0181] <213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

[0182] <400>1

[0183] atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac60

[0184] agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata120

[0185] ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa180

[0186] tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga240

[0187] aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta300

[0188] atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat360

[0189] ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca420

[0190] cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag480

[0191] cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat540

[0192] aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg600

[0193] agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt660

[0194] gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag720

[0195] gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat780

[0196] agataggagg taagtttata tggattttaa tttaacaaga gaacaagaat tagtaagaca840

[0197] gatggttaga gaatttgctg aaaatgaagt taaacctata gcagcagaaa ttgatgaaac900

[0198] agaaagattt ccaatggaaa atgtaaagaa aatgggtcag tatggtatga tgggaattcc960

[0199] attttcaaaa gagtatggtg gcgcaggtgg agatgtatta tcttatataa tcgccgttga1020

[0200] ggaattatca aaggtttgcg gtactacagg agttattctt tcagcacata catcactttg1080

[0201] tgcttcatta ataaatgaac atggtacaga agaacaaaaa caaaaatatt tagtaccttt1140

[0202] agctaaaggt gaaaaaatag gtgcttatgg attgactgag ccaaatgcag gaacagattc1200

[0203] tggagcacaa caaacagtag ctgtacttga aggagatcat tatgtaatta atggttcaaa1260

[0204] aatattcata actaatggag gagttgcaga tacttttgtt atatttgcaa tgactgacag1320

[0205] aactaaagga acaaaaggta tatcagcatt tataatagaa aaaggcttca aaggtttctc1380

[0206] tattggtaaa gttgaacaaa agcttggaat aagagcttca tcaacaactg aacttgtatt1440

[0207] tgaagatatg atagtaccag tagaaaacat gattggtaaa gaaggaaaag gcttccctat1500

[0208] agcaatgaaa actcttgatg gaggaagaat tggtatagca gctcaagctt taggtatagc1560

[0209] tgaaggtgct ttcaacgaag caagagctta catgaaggag agaaaacaat ttggaagaag1620

[0210] ccttgacaaa ttccaaggtc ttgcatggat gatggcagat atggatgtag ctatagaatc1680

[0211] agctagatat ttagtatata aagcagcata tcttaaacaa gcaggacttc catacacagt1740

[0212] tgatgctgca agagctaagc ttcatgctgc aaatgtagca atggatgtaa caactaaggc1800

[0213] agtacaatta tttggtggat acggatatac aaaagattat ccagttgaaa gaatgatgag1860

[0214] agatgctaag ataactgaaa tatatgaagg aacttcagaa gttcagaaat tagttatttc1920

[0215] aggaaaaatt tttagataat ttaaggaggt taagaggatg aatatagttg tttgtttaaa1980

[0216] acaagttcca gatacagcgg aagttagaat agatccagtt aagggaacac ttataagaga2040

[0217] aggagttcca tcaataataa atccagatga taaaaacgca cttgaggaag ctttagtatt2100

[0218] aaaagataat tatggtgcac atgtaacagt tataagtatg ggacctccac aagctaaaaa2160

[0219] tgctttagta gaagctttgg ctatgggtgc tgatgaagct gtacttttaa cagatagagc2220

[0220] atttggagga gcagatacac ttgcgacttc acatacaatt gcagcaggaa ttaagaagct2280

[0221] aaaatatgat atagtttttg ctggaaggca ggctatagat ggagatacag ctcaggttgg2340

[0222] accagaaata gctgagcatc ttggaatacc tcaagtaact tatgttgaga aagttgaagt2400

[0223] tgatggagat actttaaaga ttagaaaagc ttgggaagat ggatatgaag ttgttgaagt2460

[0224] taagacacca gttcttttaa cagcaattaa agaattaaat gttccaagat atatgagtgt2520

[0225] agaaaaaata ttcggagcat ttgataaaga agtaaaaatg tggactgccg atgatataga2580

[0226] tgtagataag gctaatttag gtcttaaagg ttcaccaact aaagttaaga agtcatcaac2640

[0227] taaagaagtt aaaggacagg gagaagttat tgataagcct gttaaggaag cagctgcata2700

[0228] tgttgtctca aaattaaaag aagaacacta tatttaagtt aggagggatt tttcaatgaa2760

[0229] taaagcagat tacaagggcg tatgggtgtt tgctgaacaa agagacggag aattacaaaa2820

[0230] ggtatcattg gaattattag gtaaaggtaa ggaaatggct gagaaattag gcgttgaatt2880

[0231] aacagctgtt ttacttggac ataatactga aaaaatgtca aaggatttat tatctcatgg2940

[0232] agcagataag gttttagcag cagataatga acttttagca catttttcaa cagatggata3000

[0233] tgctaaagtt atatgtgatt tagttaatga aagaaagcca gaaatattat tcataggagc3060

[0234] tactttcata ggaagagatt taggaccaag aatagcagca agactttcta ctggtttaac3120

[0235] tgctgattgt acatcacttg acatagatgt agaaaataga gatttattgg ctacaagacc3180

[0236] agcgtttggt ggaaatttga tagctacaat agtttgttca gaccacagac cacaaatggc3240

[0237] tacagtaaga cctggtgtgt ttgaaaaatt acctgttaat gatgcaaatg tttctgatga3300

[0238] taaaatagaa aaagttgcaa ttaaattaac agcatcagac ataagaacaa aagtttcaaa3360

[0239] agttgttaag cttgctaaag atattgcaga tatcggagaa gctaaggtat tagttgctgg3420

[0240] tggtagagga gttggaagca aagaaaactt tgaaaaactt gaagagttag caagtttact3480

[0241] tggtggaaca atagccgctt caagagcagc aatagaaaaa gaatgggttg ataaggacct3540

[0242] tcaagtaggt caaactggta aaactgtaag accaactctt tatattgcat gtggtatatc3600

[0243] aggagctatc cagcatttag caggtatgca agattcagat tacataattg ctataaataa3660

[0244] agatgtagaa gccccaataa tgaaggtagc agatttggct atagttggtg atgtaaataa3720

[0245] agttgtacca gaattaatag ctcaagttaa agctgctaat aattaagata aataaaaaga3780

[0246] attatttaaa gcttattatg ccaaaatact tatatagtat tttggtgtaa atgcattgat3840

[0247] agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt3900

[0248] actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga3960

[0249] gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa4020

[0250] ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc4080

[0251] ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa4140

[0252] agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca4200

[0253] attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga4260

[0254] cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag4320

[0255] gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata4380

[0256] gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata4440

[0257] ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa4500

[0258] gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt4560

[0259] gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga4620

[0260] gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga4680

[0261] agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat tcaaaataag tttacaagaa tcccca4736

[0262] <210>2

[0263] <211>4996

[0264] <212>DNA

[0265] <220>

[0266] <223>

[0267] <400>2

[0268] cagattcggt cttcccccag gcgatcgcca aggaaaaatt atttttctga cccgctaccg60

[0269] tggcgacaat ggtggccagg ttgatactcc tcaggttggt taacagccta tccaaaactt120

[0270] gctagagtgt tcattggcca aaaatcccat taattctttt attattaccg ctttgccatg180

[0271] gttaacacct acaccgccga aatccaacac cagggtcaga cctataccat ctccgttccc240

[0272] gaggataaaa cggtgctcca agcggcggat gatgagggga tacaactacc tacttcctgt300

[0273] ggcgctgggg tttgcactac ctgtgcggcg ttaatcaccg aaggcacagc ggagcaggct360

[0274] gacggcatgg gagtttcagc ggaactacag gctgagggat atgctctact ttgtgtagcc420

[0275] tatccccgct cagatttgaa aattatcacc gaaaaagaag acgaagttta tcagcggcag480

[0276] ttcggcggcc aaggttagat tcggctggaa ttctcccttc ccatgacaaa tcttccagag540

[0277] caacacttgc caccccaaaa agctgagcca taattcaggt agcggccagt agtaaggtgg600

[0278] attttgacca tgaaagttac aaatcaaaaa gaactaaaac aaaagctaaa tgaattgaga660

[0279] gaagcgcaaa agaagtttgc aacctatact caagagcaag ttgataaaat ttttaaacaa720

[0280] tgtgccatag ccgcagctaa agaaagaata aacttagcta aattagcagt agaagaaaca780

[0281] ggaataggtc ttgtagaaga taaaattata aaaaatcatt ttgcagcaga atatatatac840

[0282] aataaatata aaaatgaaaa aacttgtggc ataatagacc atgacgattc tttaggcata900

[0283] acaaaggttg ctgaaccaat tggaattgtt gcagccatag ttcctactac taatccaact960

[0284] tccacagcaa ttttcaaatc attaatttct ttaaaaacaa gaaacgcaat attcttttca1020

[0285] ccacatccac gtgcaaaaaa atctacaatt gctgcagcaa aattaatttt agatgcagct1080

[0286] gttaaagcag gagcacctaa aaatataata ggctggatag atgagccatc aatagaactt1140

[0287] tctcaagatt tgatgagtga agctgatata atattagcaa caggaggtcc ttcaatggtt1200

[0288] aaagcggcct attcatctgg aaaacctgca attggtgttg gagcaggaaa tacaccagca1260

[0289] ataatagatg agagtgcaga tatagatatg gcagtaagct ccataatttt atcaaagact1320

[0290] tatgacaatg gagtaatatg cgcttctgaa caatcaatat tagttatgaa ttcaatatac1380

[0291] gaaaaagtta aagaggaatt tgtaaaacga ggatcatata tactcaatca aaatgaaata1440

[0292] gctaaaataa aagaaactat gtttaaaaat ggagctatta atgctgacat agttggaaaa1500

[0293] tctgcttata taattgctaa aatggcagga attgaagttc ctcaaactac aaagatactt1560

[0294] ataggcgaag tacaatctgt tgaaaaaagc gagctgttct cacatgaaaa actatcacca1620

[0295] gtacttgcaa tgtataaagt taaggatttt gatgaagctc taaaaaaggc acaaaggcta1680

[0296] atagaattag gtggaagtgg acacacgtca tctttatata tagattcaca aaacaataag1740

[0297] gataaagtta aagaatttgg attagcaatg aaaacttcaa ggacatttat taacatgcct1800

[0298] tcttcacagg gagcaagcgg agatttatac aattttgcga tagcaccatc atttactctt1860

[0299] ggatgcggca cttggggagg aaactctgta tcgcaaaatg tagagcctaa acatttatta1920

[0300] aatattaaaa gtgttgctga aagaagggaa aatatgcttt ggtttaaagt gccacaaaaa1980

[0301] atatatttta aatatggatg tcttagattt gcattaaaag aattaaaaga tatgaataag2040

[0302] aaaagagcct ttatagtaac agataaagat ctttttaaac ttggatatgt taataaaata2100

[0303] acaaaggtac tagatgagat agatattaaa tacagtatat ttacagatat taaatctgat2160

[0304] ccaactattg attcagtaaa aaaaggtgct aaagaaatgc ttaactttga acctgatact2220

[0305] ataatctcta ttggtggtgg atcgccaatg gatgcagcaa aggttatgca cttgttatat2280

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