用于老年痴呆相关位点检测的Tagman探针对和引物对

摘要

本发明涉及一种老年痴呆相关位点检测方法，包括步骤：提取来自人的样本的基因组DNA；根据至少2个老年痴呆相关基因的每一个分别设计一对Taqman探针对和一对引物对，Taqman探针对的5’端和3’端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，分别对所述基因组DNA进行荧光定量PCR扩增；根据荧光定量PCR扩增结果来判断所述老年痴呆相关基因是否发生突变，较佳地，所述老年痴呆相关基因的数目是5个，分别是APOE1基因、APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因，本发明设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

权利要求

1.用于老年痴呆相关位点检测的Tagman探针对和引物对，其特征在于，所述Tagman探针对和所述引物对是根据5个老年痴呆相关基因的每一个分别设计的，所述老年痴呆相关基因是APOE1基因、APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因，其中：用于检测APOE1基因的rs429358位点的Taqman探针对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：

2所示的核苷酸序列，该Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，引物对是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

用于检测APOE2基因的rs7412位点的Taqman探针对是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：

6所示的核苷酸序列，该Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，引物对是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

用于检测CYP46基因的rs754203位点的Taqman探针对是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：

10所示的核苷酸序列，该Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，引物对是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；

用于检测CTSD基因的rs17571位点的Taqman探针对是SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：

14所示的核苷酸序列，该Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，引物对是SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；

用于检测IL1A基因的rs1800587位点的Taqman探针对是SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：

18所示的核苷酸序列，该Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，引物对是SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。

说明书

用于老年痴呆相关位点检测的Tagman探针对和引物对

技术领域

[0001] 本发明涉及疾病相关位点检测技术领域，更具体地，涉及老年痴呆相关位点检测方法技术领域，特别是指一种老年痴呆相关位点检测方法。

背景技术

[0002] 老年性痴呆(Alzheimer，AD)是一种慢性的大脑退行性变性疾病。临床表现为进行性远近的记忆力障碍，分析判断能力衰退、情绪改变、行为失常、甚至意识模糊，最后死于肺炎或尿路感染。据统计，全球有老年性痴呆患者1700-2500万。在我国估计已有约645万病人。而且随年龄每增加5岁，AD的患病率将增加两倍，在80-85岁的病人中有20％的老年人患有老年痴呆。是继心脏病、肿瘤和脑卒中之后的第四位死因，给患者家庭、社会造成了很大的负担及压力。然而，由于该病早期症状的不典型性，容易被患者家属忽视，从而失去最佳的治疗时机。许多因素与该病发病机制和病因有关。其中最重要的是遗传因素：AD具有家庭聚集性，40％的患者有阳性家族史，呈常染色体显性遗传及多基因遗传。 [0003] 到目前为止的研究表明，至少有4个基因的变异与老年性痴呆的发病风险密切相关。根据发病年龄老年性痴呆可简单分为早老性痴呆(＜65岁)与晚发型老年性痴呆(＞
65岁)。两者相关的基因变异有所不同。研究最多也最为深入的是晚发型AD与Alza基因的关系，多达75％的晚发型AD患者在某种程度上与Alza基因型有关。因此，为了更早地预防老年痴呆的发生，需要在老年痴呆发生前就提前通过基因检测准确筛查出高风险人群，并对这一人群进行有针对性的健康管理，才能做到真正的早预防，再结合其它手段定期检测，真正实现老年痴呆的早发现、早治疗，以达到提前进行个性化预防的目的。 发明内容

[0004] 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种老年痴呆相关位点检测方法，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 该老年痴呆相关位点检测方法，其特点是，包括步骤：

[0007] a.提取来自人的样本的基因组DNA；

[0008] b.根据至少2个老年痴呆相关基因的每一个分别设计一对Taqman探针对和一对引物对，所述Taqman探针对的5’端和3’端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，分别对所述基因组DNA进行荧光定量PCR扩增；

[0009] c.根据荧光定量PCR扩增结果来判断所述至少2个老年痴呆相关基因是否发生突变。

[0010] 较佳地，所述老年痴呆相关基因的数目是5个。

[0011] 更佳地，所述老年痴呆相关基因是APOE1基因、APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因。

[0012] 更进一步地，所述Taqman探针对和所述引物对用于检测检测APOE1基因的rs429358位点，APOE2基因的rs7412位点，CYP46基因的rs754203位点，CTSD基因的rs17571位点，IL1A基因的rs1800587位点。

[0013] 较佳地，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

[0014] 较佳地，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

[0015] 较佳地，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和VIC标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

[0016] 较佳地，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

[0017] 较佳地，所述Taqman探针对是SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，所述Taqman探针对的5’端分别标记FAM标记和TET标记，3’端均标记TAMRA标记，所述引物对是SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。

[0018] 本发明的创新点在于几个老年痴呆有关的侯检位点的整合，通过选取多个老年痴呆的侯检位点，具体根据APOE1基因、APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因 设计特异性引物和Taqman探针对来自人的样本的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，根据产生的荧光的量和荧光的种类可以知道侯检位点的基因型，设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，将基因体检的结果作为老年痴呆健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是老年痴呆遗传风险度高的人群，建议减少一切老年痴呆的外在致病因素，并每半年进行一次检查，做到早预防，早发现，早治疗，延缓甚至避免疾病的发生。

具体实施方式

[0019] 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。 [0020] 1.基因组DNA提取：

[0021] 1.1试剂和仪器：

[0022] 1.1.1试剂和耗材：基因组DNA抽提试剂盒(TIANamp BLOOD DNA kit，DP318-03；TIANamp Micro微量样品基因组DNA提取试剂盒，DP316；TIANamp口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，DP322-03)含：细胞裂解液CL；缓冲液GA；缓冲液GS；缓冲液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TB；Carrier RNA；RNase-free ddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML无菌收集管；无水乙醇。

[0023] 1.1.2仪器：DENVILLE260离心机，XW-80A旋涡混合器，H.H.S指针式电热恒温水浴锅。

[0024] 1.2提取步骤

[0025] 从全血中提取基因组DNA

[0026] 1.2.1取200μl的抗凝全血至1.5ml的Eppendorf管中，如果样本的量少于200μl，则加入缓冲液GS补充至200μl。如果样本量多于200μl，需要用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

[0027] 1.2.2加入20μl的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200μl的缓冲液GB，立刻充分颠倒混匀。56℃水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应变清亮。(如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止)。 [0028] 1.2.3加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。 [0029] 1.2.4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 [0030] 1.2.5向吸附柱中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000 rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[0031] 1.2.6向吸附柱中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 [0032] 1.2.7向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。

[0033] 1.2.8将吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

[0034] 1.2.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

[0035] 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。

[0036] 若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 [0037] 2.Taqman探针法检测侯检位点：

[0038] 2.1实验试剂及仪器

[0039] 2.1.1实验试剂

[0040] 荧光定量试剂：ABI TaqMan 2×PCR Master mix(P/N：4326614，Lot：G15502)。 [0041] 普通PCR试剂：宝生物工程(大连)有限公司的Ex Taq DNA聚合酶(P/N：DRR100B，Lot：CKA1801A)。

[0042] 2.1.2实验仪器：ABI 9700型PCR仪和ABI 7900 HT型荧光定量PCR仪。 [0043] 2.1.3检测位点探针及引物表

[0044]

[0045] 2.2实验步骤

[0046] 2.2.1将所有样本DNA的浓度调整到20ng/ul～50ng/ul。

[0047] 2.2.2位点检测

[0048] a.PCR反应体系：

[0049]

[0050] b.PCR循环条件：

[0051]

[0052] 2.2.3根据反应过程中释放的荧光的量和荧光的种类来判断对应候选位点的基因型。

[0053] 3.结果分析：

[0054] 根据最终终点读板结果分型图进行分析，结果如下：

[0055] 反应1：用于检测APOE1基因的rs429358位点，该候检位点在人群中有三种基因型：TT，CT和CC，其中携带TT基因型为正常人群，携带CC和CT基因型的人群较携带TT基因型的人群有较高的风险罹患老年痴呆，患病风险几率大小CC型＞CT型＞TT型，分型图分析结果表明rs429358位点为CT，非正常基因型；

[0056] 反应2：用于检测APOE2基因的rs7412位点，该候检位点在人群中有三种基因型：CC，CT和TT，其中携带CC、CT基因型为正常人群，携带TT基因型的人群较携带CC和CT基因型的人群有较高的风险罹患老年痴呆，患病风险几率大小TT型＞CT型和CC型，分型图分析结果表明rs7412位点为CT，正常基因型；

[0057] 反应3：用于检测CYP46基因的rs754203位点，该候检位点在人群中有三种基因型：AA，AG和GG，其中携带AA基因型为正常人群，携带GG和AG基因型的人群较携带AA基因型的人群有较高的风险罹患老年痴呆，患病风险几率大小GG型＞AG型＞AA型，分型图分析结果表明rs754203位点为AA，正常基因型；

[0058] 反应4：用于检测CTSD基因的rs17571位点，该候检位点在人群中有三种基因型：CC，CT和TT，其中携带CC基因型为正常人群，携带TT和CT基因型的人群较携带CC基因型的人群有较高的风险罹患老年痴呆，患病风险几率大小TT型＞CT型＞CC型，分型图分析结果表明rs17571位点为CC，正常基因型；

[0059] 反应5：用于检测IL1A基因的rs1800587位点，该候检位点在人群中有三种基因型：CC，CT和TT，其中携带CC基因型为正常人群，携带TT和CT基因型的人群较携带CC基因型的人群有较高的风险罹患老年痴呆，患病风险几率大小TT型＞CT型＞CC型，分型图分析结果表明rs1800587位点为CC，正常基因型。

[0060] 根据上述检测结果，可以判断上述受检的APOE1基因异常，APOE2基因、CYP46基因、CTSD基因和IL1A基因均正常，受检者较正常人患老年痴呆的几率要高一些，但是其患老年性痴呆的遗传倾向属于低度风险人群，但是是否已经患有老年痴呆，还需要进行进一步的检查，因为其与多种因素有关，可进行专门的针对性的健康管理。如果其中没有基因异常，则基本无需进行专门的针对性的健康管理，但是如果其中更多个基因异常，那么就更需要进行进一步的老年痴呆检查以确定是否已经患有老年痴呆，并进行专门的针对性的健康管理。

[0061] 综上所述，本发明的老年痴呆相关位点检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。 [0062] 需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。 [0063] 序列表

[0064] <110>上海基康生物技术有限公司

[0065] <120>一种老年痴呆相关位点检测方法

[0066] <160>20

[0067] <210>1

[0068] <211>21

[0069] <212>DNA

[0070] <213>人工序列

[0071] <220>

[0072] <221>misc_feature

[0073] <222>(1)...(21)

[0074] <223>根据人APOE1基因序列设计的Taqman探针

[0075] <400>1

[0076] ccgcacacgt cctccatgtc c 21

[0077] <210>2

[0078] <211>19

[0079] <212>DNA

[0080] <213>人工序列

[0081] <220>

[0082] <221>misc_feature

[0083] <222>(1)...(19)

[0084] <223>根据人APOE1基因序列设计的Taqman探针

[0085] <400>2

[0086] ccgcgcacgt cctccatgt 19

[0087] <210>3

[0088] <211>20

[0089] <212>DNA

[0090] <213>人工序列

[0091] <220>

[0092] <221>misc_feature

[0093] <222>(1)...(20)

[0094] <223>根据人APOE1基因序列设计的上游引物

[0095] <400>3

[0096] ccatgaagga gttgaaggcc 20

[0097] <210>4

[0098] <211>17

[0099] <212>DNA

[0100] <213>人工序列

[0101] <220>

[0102] <221>misc_feature

[0103] <222>(1)...(17)

[0104] <223>根据人APOE1基因序列设计的下游引物

[0105] <400>4

[0106] ccgcggtact gcaccag 17

[0107] <210>5

[0108] <211>20

[0109] <212>DNA

[0110] <213>人工序列

[0111] <220>

[0112] <221>misc_feature

[0113] <222>(1)...(20)

[0114] <223>根据人APOE2基因序列设计的Taqman探针

[0115] <400>5

[0116] tgccaggcgc ttctgcaggt 20

[0117] <210>6

[0118] <211>23

[0119] <212>DNA

[0120] <213>人工序列

[0121] <220>

[0122] <221>misc_feature

[0123] <222>(1)...(23)

[0124] <223>根据人APOE2基因序列设计的Taqman探针

[0125] <400>6

[0126] cactgccagg cacttctgca ggt 23

[0127] <210>7

[0128] <211>17

[0129] <212>DNA

[0130] <213>人工序列

[0131] <220>

[0132] <221>misc_feature

[0133] <222>(1)...(17)

[0134] <223>根据人APOE2基因序列设计的上游引物

[0135] <400>7

[0136] cctcccacct gcgcaag 17

[0137] <210>8

[0138] <211>16

[0139] <212>DNA

[0140] <213>人工序列

[0141] <220>

[0142] <221>misc_feature

[0143] <222>(1)...(16)

[0144] <223>根据人APOE2基因序列设计的下游引物

[0145] <400>8

[0146] ggatggcgct gaggcc 16

[0147] <210>9

[0148] <211>19

[0149] <212>DNA

[0150] <213>人工序列

[0151] <220>

[0152] <221>misc_feature

[0153] <222>(1)...(19)

[0154] <223>根据人CYP46基因序列设计的Taqman探针

[0155] <400>9

[0156] cttgccccca gggctcctg 19

[0157] <210>10

[0158] <211>16

[0159] <212>DNA

[0160] <213>人工序列

[0161] <220>

[0162] <221>misc_feature

[0163] <222>(1)...(16)

[0164] <223>根据人CYP46基因序列设计的Taqman探针

[0165] <400>10

[0166] tgcccccggg gctcct 16

[0167] <210>11

[0168] <211>20

[0169] <212>DNA

[0170] <213>人工序列

[0171] <220>

[0172] <221>misc_feature

[0173] <222>(1)...(20)

[0174] <223>根据人CYP46基因序列设计的上游引物

[0175] <400>11

[0176] gactcggcaa gtgagcaaca 20

[0177] <210>12

[0178] <211>20

[0179] <212>DNA

[0180] <213>人工序列

[0181] <220>

[0182] <221>misc_feature

[0183] <222>(1)...(20)

[0184] <223>根据人CYP46基因序列设计的下游引物

[0185] <400>12

[0186] cccagctgag aaaccgatgt 20

[0187] <210>13

[0188] <211>17

[0189] <212>DNA

[0190] <213>人工序列

[0191] <220>

[0192] <221>misc_feature

[0193] <222>(1)...(17)

[0194] <223>根据人CTSD基因序列设计的Taqman探针

[0195] <400>13

[0196] tcccaggcgg tgccagc 17

[0197] <210>14

[0198] <211>20

[0199] <212>DNA

[0200] <213>人工序列

[0201] <220>

[0202] <221>misc_feature

[0203] <222>(1)...(20)

[0204] <223>根据人CTSD基因序列设计的Taqman探针

[0205] <400>14

[0206] actcccaggt ggtgccagcc 20

[0207] <210>15

[0208] <211>18

[0209] <212>DNA

[0210] <213>人工序列

[0211] <220>

[0212] <221>misc_feature

[0213] <222>(1)...(18)

[0214] <223>根据人CTSD基因序列设计的上游引物

[0215] <400>15

[0216] caaaggcccc gtctcaaa 18

[0217] <210>16

[0218] <211>26

[0219] <212>DNA

[0220] <213>人工序列

[0221] <220>

[0222] <221>misc_feature

[0223] <222>(1)...(26)

[0224] <223>根据人CTSD基因序列设计的下游引物

[0225] <400>16

[0226] acctcatact cacgtccatg tagttc 26

[0227] <210>17

[0228] <211>23

[0229] <212>DNA

[0230] <213>人工序列

[0231] <220>

[0232] <221>misc_feature

[0233] <222>(1)...(23)

[0234] <223>根据人IL1A基因序列设计的Taqman探针

[0235] <400>17

[0236] ccaggcaaca ccattgaagg ctc 23

[0237] <210>18

[0238] <211>24

[0239] <212>DNA

[0240] <213>人工序列

[0241] <220>

[0242] <221>misc_feature

[0243] <222>(1)...(24)

[0244] <223>根据人IL1A基因序列设计的Taqman探针

[0245] <400>18

[0246] ccaggcaaca tcattgaagg ctca 24

[0247] <210>19

[0248] <211>25

[0249] <212>DNA

[0250] <213>人工序列

[0251] <220>

[0252] <221>misc_feature