饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒

摘要

本发明提供了一种饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒，其主要针对大肠杆菌/志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等11种细菌和问号状钩端螺旋体。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从具有明显生物进化优势的gyrB基因、ITS基因及16srRNA基因上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。利用本发明的基因芯片及检测试剂盒可以检测饮用水中主要病原微生物，且操作简便，高通量，准确性高，重复性强等特点，可用于水质监测部门的临床检测。

权利要求

1.一种检测饮用水中病原菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-26所示。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于还包括正对照探针和负对照探针。

3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于所述正对照探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示。

4.权利要求1所述的基因芯片在检测饮用水中的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假 单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜 肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)中至少一种致病菌的应用。

5.权利要求1所述的基因芯片的使用方法，其特征在于包含步骤：

1)根据病原菌的gyrB基因、ITS基因及16s rRNA基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物，所述的引物包括SEQ ID NO：27-34所示的核苷酸序列的至少一种；

2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，得到靶序列；

3)标记步骤2)中得到的靶序列；

4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；

5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。

6.一种检测饮用水中病原菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的基因芯片包含SEQ ID NO：1-26所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于还包含PCR扩增的引物，该引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：27-34所示。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包含杂交盒、杂交液。

10.权利要求6所述的试剂盒在检测饮用水中的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团 菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)中至少一种致病菌的应用。

说明书

饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒。

背景技术

[0002] 水是生命得以存在的必要条件，它使我们人类得以繁衍生息，人类的生活、生产、娱乐都离不开水。它同时也是许多病原微生物滋生、传播的场所和载体，这些病原微生物一旦进入人体则将可能使人患病、甚至导致死亡，严重威胁着人类健康。随着社会的发展和生活水平的提高，人们越来越关心自身的健康问题，而各种水体(包括生活饮用水，江河湖泊，游泳场馆等)的安全问题也日益成为人们关注的热点。因此，为了保护人们的身体健康，对各种水体尤其是饮用水中病原微生物的检测是十分必要和亟需的。

[0003] 根据中国现行的水质标准及世界卫生组织(WHO)和美国环境保护局(USEPA)关于饮用水和娱乐用水的相关规定，确定存在于饮用水中的主要病原微生物大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)。

[0004] 在水样检测领域，传统的病原微生物检测技术大都是建立在染色镜检、培养、生化鉴定、免疫血清学试验的基础上的。微生物培养是指利用选择性培养基对目的病原微生物进行分类，以确定其是否存在。这种方法虽然比较准确，但由于细菌的生长繁殖需要较长的时间，不能进行快速诊断；而且，一次培养实验一般只能检测一种或者一类病原微生物，要完成对样品中多个项目的检测是十分繁琐的。

[0005] 微生物所表现出来的独特的生化性质(如乳糖发酵、降解烷烃等)是由于其细胞内具有相对应的酶而产生的(如能发酵乳糖的细菌具有半乳糖苷酶活性)，因此生化方法检测病原微生物实际上是对微生物细胞内特异性酶的测定，也就是利用不同底物在酶的催化下能产生的不同代谢产物来间接检测该酶的存在，进而实现对该微生物的鉴定和检测。传统的生化方法由于检验项目多、操作复杂、费时等因素影响而使鉴定速度减慢，而且其灵敏性与特异性也受到限制。

[0006] 免疫血清学方法是利用细菌抗原的独特性及抗原抗体结合的特异性建立起来的现代检测技术，具有特异性强等特点。许多临床疾病已经开始使用这种方法进行病原体检测，如利用HBV表面抗原检测HBV病毒。然而，由于这种方法需要经过至少48小时的细菌培养、扩增和单菌落的分析，并需要对每一个样品的大量单菌落进行抗血清凝聚反应，耗时长且可能出现假阴性。另外，世界上没有一家公司或单位能生产全部细菌的抗血清，即使是最常用的大肠杆菌的抗血清，也只有少数几个公司和单位有全部血清型的抗血清，而国内没有一家单位获得过全套的抗血清。

[0007] 随着分子生物学和微生物基因组学的迅速发展，越来越多的微生物全基因组核酸序列被公布，人们对病原微生物的认识已经从外部形态结构及生化特性深入到核酸、基因水平。在此基础上，人们建立了许多新的检测技术，如核酸探针(Nuclear acid probe)和聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，PCR)等，由于具有灵敏度高、特异性强、操作简便、反应快速等特点，已逐步应用于病原菌的检测。在这样的背景下，生物芯片技术应运而生。分子生物学检测技术的发展，已为致病菌的快速检测提供了良好的技术平台，PCR技术和生物芯片技术是目前公认的在病原微生物检测领域最有效和最有潜力的两种技术，尤其是在细菌数较低的情况下更是最适合的方法。在病原菌检测领域，目前国内外均建立了许多基于PCR方法的检测技术，但由于PCR技术只能针对某一种或几种致病菌，而水体中存在的致病菌种类很多，这就需要同时对大多数常见致病菌进行检测，PCR的这种局限性大大增加了检测的工作量，不适用于水质检测、水栖致病菌流行病学分析等领域大量样品的快速检测。而基因芯片技术以其高通量、高特异性、高敏感、操作简便、反应快速的特点为微生物检测提供了一种强有力的技术平台。如今，越来越多的微生物检测芯片已经面世，诸如大肠杆菌检测芯片，幽门螺杆菌检测芯片，食品病源菌检测芯片等，微生物检测芯片已成为微生物检测技术的重要发展趋势。

[0008] 目前，在应用于水检测方面的专利或专利申请主要有：1、RNADETECTION AND QUANTITATION(公布号WO2005/019469)，该专利申请提供了一种检测饮用水或者食品中RNA分子的方法，利用RNA分子的存在来表征饮用水或食品是否被致病菌污染；2、OLIGONUCLEOTIDESUSED FOR DETECTING VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS ANDMETHOD OF DETECTION THEREWITH(公布号WO 1997/035970)，该专利申请提供了一种检测副溶血弧菌的引物。利用一对能特异性扩增副溶血弧菌gyrB基因的引物，通过PCR反应，产生一段285bp的扩增片段，从而检测副溶血弧菌的存在。3、Oligonucleotides for detection of Bacilluscereus group bacteria harmful to mammals，and method of detection with theoligonucleotides(美国专利第6,087,104号)，该专利申请利用gyrB基因设计引物，特异性PCR扩增蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌，以实现对这三种菌的检测。4、一种检测水中常见致病菌的DNA微阵列(公开号：CN 1396270A，公开日：2003年2月12日)，该专利申请公开了一种DNA微阵列检测水中常见致病菌的技术。该技术利用
16srRNA基因检测与鉴定水中常见致病菌，两条引物分别设计在16s rRNA基因的保守区，探针在16s rRNA基因的可变区。该DNA微阵列技术可检测埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属、军团杆菌、结核分枝杆菌、耶尔森氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌，可用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查。该技术由于16S rRNA的高度保守性，分辨能力较低，无法区分到种，也无法区分大肠杆菌和志贺氏菌。5、水体中常见食源性致病菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法(公开号：CN1814788A，公开日：2006年8月9日)，该专利申请提供了一种PCR快速检测试剂盒及检测方法，利用6个特异基因检测志贺氏菌，沙门氏菌，副溶血弧菌，绿脓杆菌，大肠杆菌O157。此种方法检测6种常见的致病菌，但PCR过程需要6对引物，加大了实验难度。6、污水中细菌的基因芯片检测方法(公开号：1824805A，公开日：2006年8月30日)，该专利申请涉及一种污水中细菌的基因芯片检测方法。利用特异基因检测志贺氏菌，沙门氏菌、肠球菌，肺炎克雷伯氏菌，绿脓杆菌，大肠杆菌O157，大肠杆菌。该方法也涉及到6对以上引物的多重PCR问题，操作复杂。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供一种用于检测饮用水中主要病原微生物的新型基因芯片，以弥补传统饮用水水质检测技术存在的费时、耗力，分辨能力差的缺陷，扩展病原微生物检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

[0010] 本发明所述的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种：：

[0011] ① 大 肠 杆 菌 (E.coli)/ 志 贺 氏 菌 (Shigella)、铜 绿 假 单 胞 菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)及问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)gyrB基因中所选取的至少一种DNA片段；

[0012] ②沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS基因中选取的至少一种DNA片段；

[0013] ③粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16s rRNA基因中选取的DNA片段；

[0014] ④①或②或③中选取的DNA片段的互补DNA片段。

[0015] 所述寡聚核苷酸探针优选具有SEQ ID NO：1-26所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO：1-26但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-26所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；本发明所述的基因芯片，还包括正对照探针和负对照探针。

[0016] 上述的优选序列及功能如下所示：

[0017] SEQ ID(5′-3′)

[0018] NO：1 GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT用于检测金黄色葡萄球菌；

[0019] NO：2 AAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA用于检测金黄色葡萄球菌；

[0020] NO：3 ATGTGAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG用于检测金黄色葡萄球菌；

[0021] NO：4 GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT用于检测沙门氏菌；

[0022] NO：5 ATTTGAAGAGGTTGCAAACGATGGG用于检测肺炎克雷伯氏菌；

[0023] NO：6 GGCCTACCAAATTTGCGAAGCAA用于检测肺炎克雷伯氏菌；

[0024] NO：7 AATGGTTACTTCATTAGAAGTGATTAGCTC用于检测副溶血弧菌；

[0025] NO：8 CCGATTAGCTCCACCACTGACTTCCT用于检测副溶血弧菌；

[0026] NO：9 CGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT用于检测霍乱弧菌；

[0027] NO：10 CTTTAAGCGTTTTCGCTGAGAATGTTT用于检测霍乱弧菌型；

[0028] NO：11 ACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTG用于检测粪肠球菌；

[0029] NO：12 ATGCCGCATGGCATAAGAGTG用于检测粪肠球菌；

[0030] NO：13 CGGTGGTTAGCACGGCGTAGGTGTATCCGT用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌；

[0031] NO：14 ATTGAAAGTGGTGCGCGAAACCGATCAAACC用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌；

[0032] NO：15 GTTGTTATGACAATCCTTCACGCAGG用于检测问号状钩端螺旋体；

[0033] NO：16 GCCTACAAAGTTTCTGGAGGTTTACAT用于检测问号状钩端螺旋体；

[0034] NO：17 GTTGCATTTGCTAGTGCGTAGACATGGAA用于检测嗜肺军团菌；

[0035] NO：18 CTAGCTAAAAGATTACGTGAATTGTC用于检测嗜肺军团菌；

[0036] NO：19 GAGCACTTAAATAAAAATAAAACACCAGT用于检测嗜肺军团菌；

[0037] NO：20 GTATCTCCAACAGGTGATGATGCTCG用于检测嗜肺军团菌；

[0038] NO：21 GAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATA用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；

[0039] NO：22 GGAGCTGGTTATTCAGCGCGAGGGTAAA用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；

[0040] NO：23 GGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAAC用于检测志贺氏菌/大肠杆菌；

[0041] NO：24 CATCCGTCGCCACAACAAGGTCTGGGAAC用于检测铜绿假单胞菌；

[0042] NO：25 CCGGAGACCTTCAGCAACATCCACTT用于检测铜绿假单胞菌；

[0043] NO：26 CCGTCCCCGGAGACCTTCAGCAACAT用于检测铜绿假单胞菌；

[0044] OA532：NO：35

[0045] TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCTACGGGAGGCAGC为正对照探针[0046] W1-4006：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT为负对照探针

[0047] Cy3：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy-3为荧光探针

[0048] 其中的M表示A或C；R表示A或G；W表示A或T。

[0049] 本发明的基因芯片，可用于饮用水中可能存在的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的至少一种致病菌的检测。

[0050] 本发明所述的基因芯片的制备方法，主要包含步骤：

[0051] 1)根据权利要求1所述病原菌的gyrB基因、ITS基因及16s rRNA基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；

[0052] 2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR扩增，得到靶序列；

[0053] 3)标记步骤2)中得到的靶序列；

[0054] 4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；

[0055] 5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。

[0056] 其中，步骤1)中所述的引物包括SEQ ID NO：27-34所示的核苷酸序列的至少一种，各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是：

[0057] P1(SEQ ID NO：27)WCVGGTYTGCAYCAYATG用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB基因的上游引物；

[0058] P2(SEQ ID NO：28)GTCTGBGAKGARAAYTTVGG用 于 扩 增 大 肠 杆 菌 (E.coli)/志贺 氏 菌(Shigella)、铜 绿假 单 胞 菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺 军 团 菌(Legionellapneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因的下游引物；

[0059] P3(SEQ ID NO：29)TGTACACACCGCCCGTC用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS的上游引物；

[0060] P4(SEQ ID NO：30)GGTACTTAGATGTTTCAGTTC用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS的下游引物；

[0061] P5(SEQ ID NO：31)TCAGRWYGAACGCTGGCGGC用于扩增粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16s rRNA的上游引物；

[0062] P6(SEQ ID NO：32)ATTACCGCGGCTGCTGGCAC用于扩增粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16s rRNA的下游引物；

[0063] P7(SEQ ID NO：33)TGAAAGACAATGGTCGAGGA用 于扩增问 号状钩 端螺旋 体(Leptospira interrogans)gyrB的上游引物；

[0064] P8(SEQ ID NO：34)TCTTGTAAGAGCCGCACGA用 于 扩 增 问 号状 钩 端 螺 旋 体(Leptospira interrogans)gyrB的下游引物；

[0065] 其中的B表示C或G或T；R表示A或G；W表示A或T；Y表示C或T；K表示G或T；R表示A或G；V表示A或C或G。

[0066] 本发明的另一目的是提供一种检测饮用水中主要病原菌的试剂盒，该试剂盒包括上述的基因芯片，所述的基因芯片包含SEQ ID NO：1-26的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种；还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQ ID NO：27-34的核苷酸序列的至少一种，其中，用于大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB PCR扩增的引物序列根据大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因序列设计，用于沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS PCR扩增的引物序列根据沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS基因序列设计，用于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16s rRNA PCR扩增的引物序列根据粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16s rRNA基因序列设计，用于问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)gyrB基因PCR扩增的引物序列根据问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)gyrB基因序列设计。

[0067] 本发明所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液等。

[0068] 本发明所述的试剂盒，可用于饮用水中可能存在的大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的至少一种致病菌的检测。

[0069] 与现有技术相比，本发明采用上述技术方案的有益效果在于：

[0070] 现有芯片技术研究所设计的引物和探针基本都位于16s rRNA基因，本发明将在具有明显进化优势的gyrB/ITS基因上，设计特异探针和引物，有效的避免了分辨能力较低，无法区分到种的弊端，同时，本发明的检测范围已基本涵盖了饮用水中可能存在的主要病原微生，大大弥补了现有技术中检测芯片的检测范围的欠缺。

[0071] 本发明所述的基因芯片可特异地检测11种病原微生物，包括10种细菌：大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯(Klebsiella pneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，1种介于细菌和原生动物之间的微生物：问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)。该检测方法大约需24小时。在一张片基上可同时检测8个样品，减少了成本，实现高通量，同时检测多个样品的目的，特别适合于检测那些多重感染的样品。

[0072] 由上述的技术方案可见，本发明将芯片技术引入到饮用水中病原微生物的快速检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的饮用水病原微生物检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对11种主要的病原微生物进行检测的目的，由于操作简便，准确性高，能一次完成多种型别的检测，重复性强，因此对于水质监测部门水质监测有重要的应用价值，实现对饮用水的快速准确的检测。

[0073] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

[0074] 图1为本发明的基因芯片结构外形示意图；

[0075] 图2为本发明芯片的单一点阵结构示意图；

[0076] 图3为利用本发明的基因芯片检测问号状钩端螺旋体的一个实施例的杂交结果示意图；

[0077] 图4为利用本发明的基因芯片检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的一个实施例的杂交结果示意图；

[0078] 图5为利用本发明的基因芯片检测副溶血弧菌的杂交结果示意图；

[0079] 图6为利用本发明的基因芯片检测霍乱弧菌的杂交结果示意图；

[0080] 图7为利用本发明的基因芯片检测金黄色葡萄球菌的杂交结果示意图；

[0081] 图8为利用本发明的基因芯片检测大肠杆菌/志贺氏菌的杂交结果示意图；

[0082] 图9为利用本发明的基因芯片检测沙门氏菌的杂交结果示意图；

[0083] 图10为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞的杂交结果示意图；

[0084] 图11为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌的杂交结果示意图；

[0085] 图12为利用本发明的基因芯片检测肺炎克雷伯氏菌的杂交结果示意图；

[0086] 图13为利用本发明的基因芯片检测粪肠球菌的杂交结果示意图。

具体实施方式

[0087] 实施例1 探针的设计和制备

[0088] 1.序列获得：

[0089] (1)细菌gyrB：从GenBank公共数据库下载得到大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y ersiniaenterocolitica)的全部gyrB基因序列及其近缘菌的全部gyrB基因序列。

[0090] (2)ITS基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的全部ITS基因序列及其近缘菌的全部ITS基因序列。

[0091] (3)16s rRNA基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的全部16s rRNA基因序列及其近缘菌的全部16s rRNA基因序列。

[0092] (4)问号状钩端螺旋体gyrB基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)全部gyrB基因序列及其近缘菌的全部gyrB基因序列。

[0093] 2.探针设计举例：

[0094] (1)小肠结肠炎耶尔森氏菌探针：将小肠结肠炎耶尔森氏菌的gyrB基因序列导入Glustal X软件中，选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray2.0软件中。参数设定如下：-n 20；-l30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTTAAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。

[0095] 3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长10T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

[0096] 4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异的探针。

[0097] 其它探针的设计方法与小肠结肠炎耶尔森氏菌探针设计方法相同，使用的设计参数也相同。

[0098] 本发明通过多次杂交实验进行探针筛选，得到的优选的探针如表1所示：

[0099] 表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的病原体[0100]SEQ 探针编 序列(5′-3′)
ID 号
NO：1 NO.1 GCTTATGCGAGCGCTTGACAATC 用于检测金黄色葡
TATTCT 萄球菌；
NO：2 NO.2 AAAGCAGTATGCGAGCGCTTGA 用于检测金黄色葡
CTAAA 萄球菌；
NO：3 NO.3 ATGTGAACGTTTGACTTATAAAA 用于检测金黄色葡
ATGGTGG 萄球菌；
NO：4 NO.4 GAGGTTCTGACTACACGATGGG 用于检测沙门氏
GCTAT 菌；
NO:：5 NO.5 ATTTGAAGAGGTTGCAAACGAT 用于检测肺炎克雷
GGG 伯氏菌；
NO：6 NO.6 GGCCTACCAAATTTGCGAAGCA 用于检测肺炎克雷
A 伯氏菌；
NO：7 NO.7 AATGGTTACTTCATTAGAAGTGA 用于检测副溶血弧
TTAGCTC
菌；
NO：8 NO.8 CCGATTAGCTCCACCACTGACTT 用于检测副溶血弧
CCT 菌；
NO：9 NO.9 CGCTGAGAATGTTTAAAAATGG 用于检测霍乱弧
TT 菌；
NO：10 NO.10 CTTTAAGCGTTTTCGCTGAGAAT 用于检测霍乱弧
GTTT 菌；
NO：11 NO.11 ACGTTAGTAACTGAACGTCCCC 用于检测粪肠球
TG 菌；
NO：12 NO.12 ATGCCGCATGGCATAAGAGTG 用于检测粪肠球
菌；
NO：13 NO.13 CGGTGGTTAGCACGGCGTAGGT 用于检测小肠结肠
GTATCCGT 炎耶尔森氏菌；
NO：14 NO.14 ATTGAAAGTGGTGCGCGAAACC 用于检测小肠结肠
GATCAAACC 炎耶尔森氏菌；
NO：15 NO.15 GTTGTTATGACAATCCTTCACGC 用于检测问号状钩
AGG 端螺旋体；
NO：16 NO.16 GCCTACAAAGTTTCTGGAGGTT 用于检测问号状钩
TACAT 端螺旋体；
NO：17 NO.17 GTTGCATTTGCTAGTGCGTAGAC 用于检测嗜肺军团
ATGGAA 菌；
NO：18 NO.18 CTAGCTAAAAGATTACGTGAATT 用于检测嗜肺军团
GTC 菌；
NO：19 NO.19 GAGCACTTAAATAAAAATAAAA 用于检测嗜肺军团
CACCAGT 菌；
NO：20 NO.20 GTATCTCCAACAGGTGATGATGC 用于检测嗜肺军团
TCG 菌；
NO：21 NO.21 GAAATTATCGTCACCATTCACGC 用于检测大肠杆菌
CGATA /志贺氏菌；

[0102]NO：22 NO.22 GGAGCTGGTTATTCAGCGCGAG 用于检测大肠杆菌
GGTAAA /志贺氏菌；
NO：23 NO.23 GGCGGTTACCGGCGAGACTGAA 用于检测大肠杆菌
AAAAC /志贺氏菌；
NO：24 NO.24 CATCCGTCGCCACAACAAGGTC 用于检测铜绿假单
TGGGAAC 胞菌；
NO：25 NO.25 CCGGAGACCTTCAGCAACATCC 用于检测铜绿假单
ACTT 胞菌；
NO：26 NO.26 CCGTCCCCGGAGACCTTCAGCA 用于检测铜绿假单
ACAT 胞菌；

[0103] 参照图1，是本发明的基因芯片结构外形示意图，该基因芯片的上部是点样区，下部是标签区域，其中点样区内规则分布有点阵区。探针在玻璃片基上的点阵位置为：第一横排点阵区的上端距离玻璃片基的上方为9.25mm，左侧点阵区距离玻璃片基的左侧、右侧点阵区距离玻璃片基的右侧均为4.5mm，两个点阵区间的横向距离与竖向距离均为13.5mm，第三横排点阵区与第四横排点阵区之间的距离是13.5mm。

[0104] 参照图2，是本发明芯片的单一点阵列结构示意图，其中的Cy3表示荧光探针，OA532为正对照探针，其中的编号对应的数字表示的核苷酸序列与表1中示出的核苷酸序列一致。

[0105] 实施例2 引物的设计和制备

[0106] 1.引物设计举例：

[0107] (1)大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)全部的gyrB基因序列导入Glustal X软件中，从中选取一条有代表性的序列导入Primer Primier 5.0软件中，设定长度70bp～10bp，G+C％值40％～60％，Hairpin：NONE、Dimer：NONE、FalsePriming：NONE、Cross Dimer：NONE。并寻找出适合通用引物设计的核苷酸序列区，其特点基本满足以下条件：1，该恒定区应包括大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的gyrB；2，该区域应包含有易于特异性探针设计的可变区，保证探针间核苷酸的差异大于4个以上；3，该区域两侧为恒定区能满足引物的设计；4，所设计的引物扩增产物不宜过大，否则影响PCR的灵敏性。设计的gyrB引物扩增产物大小为906bp。

[0108] (2)沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ITS基因中的引物设计方法与(1)相同。

[0109] (3)粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16s rRNA基因中的引物设计方法与(1)相同。

[0110] (4)问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)gyrB基因中的引物设计方法与(1)相同。

[0111] 其它引物的设计方法与上述探针引物方法相同，使用的设计参数也相同。

[0112] 2.引物合成：将表2中的引物序列委托探针合成公司(英俊生物技术公司)合成(PAGE纯化)，备用。其中用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)gyrB的通用引物为简并引物，W代表A/T，V代表A/C/G，Y代表G/C，B代表C/G/T，K代表G/T，R代表A/G。

[0113] 表2 用于饮用水中常见病原体检测的PCR扩增引物序列

[0114]编号 SEQ ID 序列(5’-3’) 引物作用
P1 NO：27 WCVGGTYTGCAYCAYATG 用于扩增gyrB的通用
上游引物
P2 NO：28 TCTGBGAKGARAAYTTVGG 用于扩增gyrB的通用
下游引物
P3 NO：29 TGTACACACCGCCCGTC 用于扩增ITS的上游
引物
P4 NO：30 GGTACTTAGATGTTTCAGTTC 用于扩增ITS的下游
引物
P5 NO：31 CAGRWYGAACGCTGGCGGC 用于扩增细菌16S
rRNA的下游引物
P6 NO：32 ATTACCGCGGCTGCTGGCAC 用于扩增16S rRNA的
下游引物
P7 NO：33 TGAAAGACAATGGTCGAGGA 用于扩增问号状钩端
螺旋体gyrB的下游引
物
P8 NO：34 TCTTGTAAGAGCCGCACGA 用于扩增问号钩端螺
旋体gyrB的下游引物

[0115] 说明：

[0116] (1)P1/P2用于扩增大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)gyrB基因通用扩增引物：将大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的gyrB基因。

[0117] (2)P3/P4用于扩增沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的ITS基因。

[0118] (3)P5/P6用于扩增粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的16s rRNA基因。

[0119] (4)P7/P8问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的gyrB基因

[0120] 实施例3 利用基因芯片快速检测饮用水中主要病原微生物及试剂盒的制备[0121] 1.样品处理：

[0122] (1)将收集得到的环境样品在通用培养基上增值12小时；

[0123] (2)15000g离心10分钟

[0124] (3)弃上清，加入100μl裂解液，混匀，100℃水浴10分钟；

[0125] (4)上一步得到的裂解产物15000g离心5分钟；

[0126] (5)收集上清，上清中即含有基因组DNA，即可用于检测或-20℃保存。

[0127] 附：裂解液配方：

[0128] 50m molL-1NaOH

[0129] 10m molL-1Tris-HCl(pH8.0)

[0130] 0.5％Tween-20

[0131] 0.5％NP-40

[0132] 0.5m molL-1EDTA(pH8.0)

[0133] 5％chelex-100

[0134] 2.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的3ul上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)

[0135] 表3 PCR反应混合液配方

[0136]

[0137] 注：①引物混合物I中各引物的浓度为：P1，P2为3.33μmolL-1；P3，P4为-1 -1 -11.11μmolL ；P5，P6为0.28μmolL P7，P8为0.56μmolL 。

[0138] 将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

[0139] 80℃ 10分钟

[0140] 94℃ 5分钟

[0141] 94℃ 30秒

[0142] 52℃ 1分钟15秒

[0143] 72℃ 1分钟回到第三步，共35个循环

[0144] 72℃ 5分钟

[0145] 细菌gyrB扩增大小为906bp，ITS扩增大小为400～800bp，16s rRNA扩增大小为505bp，问号状钩端螺旋体gyrB扩增的大小为650bp。如图4所示，四重PCR扩增结果。

[0146] 3.荧光标记靶序列：取10μl扩增产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。

[0147] 表4 标记反应混合液配方

[0148]

[0149] 注：①引物混合物II中所含各引物浓度为：P2为3.33μmolL-1；P4为1.11μmolL-1；P6为0.28μmolL-1；P8为0.56μmolL-1。

[0150] 将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

[0151] 80℃ 10分钟

[0152] 94℃ 5分钟

[0153] 94℃ 30秒

[0154] 52℃ 1分钟15秒

[0155] 72℃ 1分钟回到第三步，共35个循环

[0156] 72℃ 5分钟

[0157] 4.杂交：将标记产物置于65℃烘箱中烘干，向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。取18μl-2杂交液与烘干标记产物混合均匀，并加在实施例一中制备的饮用水常见病原微生物检测基因芯片的探针阵列区域，盖上盖片(博奥公司产品，产品号430042)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，44℃水浴锅中杂交12小时。

[0158] 杂交液配方：25％ formamide，0.1％ SDS，6×SSPE。

[0159] 5.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。

[0160] 洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS

[0161] 洗液B：0.05×SSC

[0162] 洗液C：95％乙醇

[0163] 6.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：

[0164] 软件及版本：GenePix Pro6.0

[0165] official name：575DF35

[0166] PMT Gain：550

[0167] 扫描分辨率：10μm

[0168] 扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式

[0169] 用本发明的基因芯片分别检测本发明所涉及饮用水中病原微生物的检测时的杂交扫描结果分别如图3-13所示。

[0170] 7.杂交结果的分析判读：本芯片为低密度芯片，探针数量较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以荧光探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出病原体。其中OA532为阳性对照探针，有两方面作用：1显示PCR反应体系是否正常，有无抑制物存在；2临床样品取样量是否足够及样品处理是否正确。

[0171] 利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测的饮用水中的病原微生物至少包括大肠杆菌(E.coli)/志贺氏菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、问号状钩端螺旋体(Leptospira interrogans)至少一种的检测，其中该试剂盒还带有使用此试剂盒的说明书等。

[0172] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

[0173] 序列表

[0174] <110>南开大学

[0175] <120>饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒

[0176] <130>8P13005-CN

[0177] <160>35

[0178] <170>Patent Inversion 3.3

[0179] <210>1

[0180] <211>29

[0181] <212>DNA

[0182] <213>用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸序列

[0183] <400>1

[0184]

[0185] <210>2

[0186] <211>27

[0187] <212>DNA

[0188] <213>用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸序列

[0189] <400>2

[0190]

[0191] <210>3

[0192] <211>30

[0193] <212>DNA

[0194] <213>用于检测金黄色葡萄球菌的寡核苷酸序列

[0195] <400>3

[0196]

[0197] <210>4

[0198] <211>27

[0199] <212>DNA

[0200] <213>用于检测沙门氏菌的寡核苷酸序列

[0201] <400>4

[0202]

[0203] <210>5

[0204] <211>25

[0205] <212>DNA

[0206] <213>用于检测肺炎克雷伯氏菌的寡核苷酸序列

[0207] <400>5

[0208]

[0209] <210>6

[0210] <211>23

[0211] <212>DNA

[0212] <213>用于检测肺炎克雷伯氏菌的寡核苷酸序列

[0213] <400>6

[0214]

[0215] <210>7

[0216] <211>30

[0217] <212>DNA

[0218] <213>用于检测副溶血弧菌的寡核苷酸序列

[0219] <400>7

[0220]

[0221] <210>8

[0222] <211>26

[0223] <212>DNA

[0224] <213>用于检测副溶血弧菌的寡核苷酸序列

[0225] <400>8

[0226]

[0227] <210>9

[0228] <211>24

[0229] <212>DNA

[0230] <213>用于检测霍乱弧菌的寡核苷酸序列

[0231] <400>9

[0232]

[0233] <210>10

[0234] <211>27

[0235] <212>DNA

[0236] <213>用于检测霍乱弧菌的寡核苷酸序列

[0237] <400>10

[0238]

[0239] <210>11

[0240] <211>24

[0241] <212>DNA

[0242] <213>用于检测粪肠球菌的寡核苷酸序列

[0243] <400>11

[0244]

[0245] <210>12

[0246] <211>21

[0247] <212>DNA

[0248] <213>用于检测粪肠球菌的寡核苷酸序列

[0249] <400>12

[0250]

[0251] <210>13

[0252] <211>30

[0253] <212>DNA

[0254] <213>用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的寡核苷酸序列

[0255] <400>13

[0256]

[0257] <210>14

[0258] <211>31

[0259] <212>DNA

[0260] <213>用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的寡核苷酸序列

[0261] <400>14

[0262]

[0263] <210>15

[0264] <211>26

[0265] <212>DNA

[0266] <213>用于检测问号状钩端螺旋体的寡核苷酸序列

[0267] <400>15

[0268]

[0269] <210>16

[0270] <211>27

[0271] <212>DNA

[0272] <213>用于检测问号状钩端螺旋体的寡核苷酸序列

[0273] <400>16

[0274]

[0275] <210>17

[0276] <211>29

[0277] <212>DNA

[0278] <213>用于检测嗜肺军团菌的寡核苷酸序列

[0279] <400>17

[0280]

[0281] <210>18

[0282] <211>26

[0283] <212>DNA

[0284] <213>用于检测嗜肺军团菌的寡核苷酸序列

[0285] <400>18

[0286]

[0287] <210>19

[0288] <211>29

[0289] <212>DNA

[0290] <213>用于检测嗜肺军团菌的寡核苷酸序列

[0291] <400>19

[0292]

[0293] <210>20

[0294] <211>26

[0295] <212>DNA

[0296] <213>用于检测嗜肺军团菌的寡核苷酸序列

[0297] <400>20

[0298]

[0299] <210>21

[0300] <211>28

[0301] <212>DNA

[0302] <213>用于检测志贺氏菌/大肠杆菌的寡核苷酸序列

[0303] <400>21

[0304]

[0305] <210>22

[0306] <211>28

[0307] <212>DNA

[0308] <213>用于检测志贺氏菌/大肠杆菌的寡核苷酸序列

[0309] <400>22

[0310]

[0311] <210>23

[0312] <211>27

[0313] <212>DNA

[0314] <213>用于检测志贺氏菌/大肠杆菌的寡核苷酸序列

[0315] <400>23

[0316]

[0317] <210>24

[0318] <211>29

[0319] <212>DNA

[0320] <213>用于检测铜绿假单胞菌的寡核苷酸序列

[0321] <400>24

[0322]

[0323] <210>25

[0324] <211>26

[0325] <212>DNA

[0326] <213>用于检测铜绿假单胞菌的寡核苷酸序列

[0327] <400>25

[0328]

[0329] <210>26

[0330] <211>26

[0331] <212>DNA

[0332] <213>用于检测铜绿假单胞菌的寡核苷酸序列

[0333] <400>26

[0334]

[0335] <210>27

[0336] <211>18

[0337] <212>DNA

[0338] <213>用于扩增大肠杆菌/志贺氏菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌gyrB基因的上游引物

[0339] <400>27

[0340]

[0341] <210>28

[0342] <211>20

[0343] <212>DNA

[0344] <213>用于扩增大肠杆菌/志贺氏菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌gyrB基因的下游引物

[0345] <400>28

[0346]

[0347] <210>29

[0348] <211>17

[0349] <212>DNA

[0350] <213>用于扩增沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌ITS的上游引物

[0351] <400>29

[0352]

[0353] <210>30

[0354] <211>21

[0355] <212>DNA

[0356] <213>用于扩增沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌ITS的下游引物

[0357] <400>30

[0358]

[0359] <210>31

[0360] <211>20

[0361] <212>DNA

[0362] <213>用于扩增粪肠球菌16s rRNA的上游引物

[0363] <400>31

[0364]

[0365] <210>32

[0366] <211>20

[0367] <212>DNA

[0368] <213>用于扩增粪肠球菌16s rRNA的下游引物

[0369] <400>32

[0370]

[0371] <210>33

[0372] <211>20

[0373] <212>DNA

[0374] <213>用于扩增问号状钩端螺旋体gyrB的上游引物

[0375] <400>33

[0376]

[0377] <210>34

[0378] <211>19

[0379] <212>DNA

[0380] <213>用于扩增问号状钩端螺旋体gyrB的下游引物

[0381] <400>34

[0382]

[0383] <210>35

[0384] <211>49

[0385] <212>DNA

[0386] <213>正对照探针

[0387] <400>35

[0388]