树突状细胞的制备方法

摘要

本发明提供DC制备方法，并提供制备的树突状细胞及其利用方法，该制备方法包含在多种细胞因子的培养基中培养DC前体细胞的步骤。本发明的方法可大量制备具有DC高分化能力的DC前体细胞。本发明可由少量的DC前体细胞获取大量的DC，所以，可望在DC的抗肿瘤免疫疗法和感染性疾病治疗中，较容易地加大DC给药量，提高DC的疫苗效果。

权利要求

1.一种树突状细胞的制备方法，其包含在1ng/ml或更高浓度的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.5ng/ml或更高浓度的干细胞因子(SCF)的共同存在下培养选自+ +CD34 细胞和CD14 单核细胞的人树突状细胞前体细胞的步骤，其中GM-SCF和SCF是培养基中添加的仅有的细胞因子。

+

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述树突状细胞前体细胞是人CD34 细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤是在10ng/ml以上的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和5ng/m1的干细胞因子(SCF)的共同存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤是在1ng/ml-100ng/ml的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.5-50ng/ml的干细胞因子(SCF)的共同存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。

说明书

树突状细胞的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种树突状细胞的制备方法，并提供制备的树突状细胞及其利用方法。

[0002] 背景技术

[0003] 树突状细胞(dendritic cell；DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞(APC)之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中(参照Steinman，R.M.1991，Ann.Rev.Immunol.9：271；Banchereau，J.B.及R.M.Steinman，1998，Nature 392：245)。树突状细胞具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突状细胞的MHC I类和MHC II类上，并分别激活CD4、CD8 T细胞，由此诱导活体内对特定抗原(病原微生物抗原、肿瘤抗原、移植抗原等)的免疫应答。

[0004] DC的强大免疫诱导功能非常适用于多种肿瘤的免疫疗法(DC治疗)。本发明者们的以往报告表明，在小鼠试验中，用仙台病毒(SeV)刺激的DC具有较强的抗肿瘤效果(S.Shibata et al.，J.Immunol，2006 177：3564-3576；Yoneyama，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135)。而抗肿瘤疗效颇受DC接种量的影响。临床试验也认为接种的DC量很大程度影响到治疗效果，但出于患者状态的原因，可提取的DC前体细胞(DCprogenitors)数量大多极为有限，不能获取足够数量的DC，因而无法达到理想的治疗效果。所以，如何高效率地扩增有限的DC前体细胞，是解决问题的关键。 [0005] 非专利文献1 Steinman，R.M.，1991，Ann.Rev.Immunol.9：271-296 [0006] 非专利文献2 Banchereau，J.B.和R.M.Steinman，1998，Nature 392：245-252 [0007] 非专利文献3 Shibata，S.et al.，J.Immunol，2006177：3564-3576 [0008] 非专利文献4 Yoneyama，Y.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2007，355：129-135

[0009] 发明的内容

[0010] 发明要解决的问题

[0011] 鉴于以上情况，本发明所要解决的问题是提供一种可有效制备大量树突状细胞的方法。

[0012] 解决问题的方法

[0013] 为开发能够有效扩增DC前体细胞并使其分化成DC的方法，本发明者们通过添加各种细胞因子，将DC前体细胞按不同时间培养，分化成DC后，以DC表面标记为指标，分析了扩增的细胞。结果发现，在含有干细胞因子(Stem cell factor；SCF)和白细胞介素(IL)-3的培养基中培养的DC前体细胞明显增殖。而在上述SCF和IL-3以外再加入Flt-3配体和IL-6(即含有Flt-3配体、SCF、IL-3、IL-6(简称FS36))的培养基中培养的DC前体细胞的扩增更加明显。与抽取后直接分化相比，通过GM-CSF和IL-4、以及GM-CSF和SCF分化扩增细胞所得的DC量高达几百倍。尤其在FS36中培养约3周后分化的细胞集团，其DC比例明显提高，由此表明FS36培养3周左右是极为优良的DC扩增方法。与以往分化方法所得DC同样，扩增后所得细胞可通过RNA病毒的感染和LPS等，提高co-stimuratory molecules+的CD80和CD86的表达水平。另外，在含有GM-CSF和SCF的培养基中培养人CD34 细胞也可以显著扩增DC。与上述方法相同，所得DC可通过LPS提高CD86的表达水平。所以，本发明提供一种可大量扩增DC前体细胞的方法，以及将所得DC前体细胞高效率分化为DC的方法。通过这些方法制备的DC可用于癌症及感染性疾病的免疫疗法。

[0014] 即，本发明涉及一种树突状细胞的制备方法、所制备的树突状细胞以及该细胞的利用方法，具体涉及

[0015] 〔1〕一种制备树突状细胞的方法，其包含在多种细胞因子存在下培养树突状细胞前体细胞的步骤。

[0016] 〔2〕〔1〕所述的方法，其中所述的多种细胞因子是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及干细胞因子(SCF)。

[0017] 〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述的树突状细胞前体细胞是来自人的细胞。 [0018] 〔4〕〔2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述的步骤是在1ng/ml以上的GM-CSF、和0.5ng/ml以上的SCF的存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。

[0019] 〔5〕〔4〕所述的方法，其中，所述的步骤是在10ng/ml以上的GM-CSF、和5ng/ml以上的SCF的存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。

[0020] 〔6〕〔4〕所述的方法，其中，所述的步骤是在1ng/ml-100ng/ml的GM-CSF、和0.5ng/ml-50ng/ml的SCF的存在下的培养树突状细胞前体细胞的步骤。

[0021] 〔7〕〔5〕或〔6〕所述的方法，其中，所述的步骤是在10ng/ml-100ng/ml的GM-CSF、和5ng/ml-50ng/ml的SCF的存在下，培养树突状细胞前体细胞的步骤。

[0022] 上述各项中，引用同一项的各项所述的两项发明或两项以上任意组合后的发明，已包括在被引用的前项发明内。另外，本说明书所述的任意发明要素及其任意组合也包括在本说明书中。从这些发明中去除本说明书所述的任意要素或其任意组合外的发明也包括在本说明书中。本说明书不仅披露说明书优选的特定形态，还披露包括其形态之外的发明。 [0023] 发明的效果

[0024] 树突状细胞具有强大的免疫诱导功能，本发明的方法所得树突状细胞可作为树突状细胞(DC)疫苗用于癌症及感染性疾病等的免疫治疗。例如，肿瘤免疫治疗时，可通过与肿瘤细胞的细胞溶解物(cell lysate)混合、肽电脉冲、肿瘤抗原基因导入树突状细胞等方法，将肿瘤抗原递呈给树突状细胞，用于肿瘤的DC治疗。使用本发明的方法，即使从患者体内提取的DC量少，也可以调制出获得治疗效果所需的足够细胞数的DC。

[0025] 附图说明

[0026] 下述图1、图2、图4-图10、图13、图15、图21(A)、图21(B)、图22(A)、图28、图29中的图像纵轴刻度标记的意思如下。

[0027] 1.E+04、le4和1.00E+04：1.0×104(个)

[0028] 1.E+05和1.00E+05：1.0×105(个)

[0029] 1.E+06和1.00E+06：1.0×106(个)

[0030] 1.E+07和1.00E+07：1.0×107(个)

[0031] 1.E+08和1.00E+08：1.0×108(个)

[0032] 1.E+09和1.00E+09：1.0×109(个)

[0033] 1.E+10和1.00E+10：1.0×1010(个)

[0034] 1.E+11和1.00E+11：1.0×1011(个)

[0035] 1.E+12和1.00E+12：1.0×1012(个)

[0036] 【图1】FS36给药组、GMSCF给药组、GMIL-4给药组培养的DC前体细胞的增殖曲线图。FS36给药组培养了42天。

[0037] 【图2】下述(i)-(iii)DC调制过程的增殖曲线图和(1)、(2)、(3)各时点的DC及DC前体细胞形态照片。在(1)和(3)时点可观察到树突状突起((3))。不同条件培养的DC分别按以下(i)-(iii)步骤进行调制。

[0038] (i)在FS36给药组的条件下培养前体细胞42天后所得DC。

[0039] (ii)在FS36给药组的条件下培养前体细胞21天后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养7天后所得DC。

[0040] (iii)在GMIL-4给药组的条件下培养前体细胞7天后所得DC。

[0041] 【图3】DC前体细胞增殖培养期间的CD11b、c-kit、CD131阳性率推移图。左柱为+ +CD11b 细胞率，中柱为c-kit 细胞率，右柱为CD131细胞率。图中记载的(1)～(6)样品分别为以下培养条件下制备的DC。

[0042] (1)：正常DC(normal DC)。

[0043] (2)：在FS36给药组条件下培养一周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0044] (3)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0045] (4)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0046] (5)：在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0047] (6)：在FS36给药组条件下培养五周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0048] 【图4】在FS36给药组(1)、GMIL-4给药组(2)、GMSCF给药组(3)的条件下培养1+ +周的DC前体细胞的增殖曲线和CD11b/CD11c 率。

[0049] 【图5】各样品(1)～(4)中的CD11b+/CD11c+率和培养期间的增殖曲线图。 [0050] (1)～(4)为以下培养条件下制备的DC。

[0051] (1)：在FS36给药组条件下培养一周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0052] (2)：在FS36给药组条件下培养一周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周。 [0053] (3)：在GMIL-4给药组条件下培养二周。

[0054] (4)：GMSCF给药组培养二周。

[0055] 【图6】各样品(1)～(2)中的CD11b+/CD11c+率和培养期间的增殖曲线图。 [0056] (1)～(2)为以下培养条件下制备的DC。

[0057] (1)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0058] (2)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周。 [0059] 【图7】各样品(1)～(2)中的CD11b+/CD11c+率和培养期间的增殖曲线图。 [0060] (1)～(2)为以下培养条件下制备的DC。

[0061] (1)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药，再培养一周。 [0062] (2)：在FS36给药组条件下培养三周后，更培养基为GMSCF给药，再培养一周。 [0063] 【图8】各样品(1)～(2)中的CD11b+/CD11c+率和培养期间的增殖曲线图。 [0064] (1)～(2)为以下培养条件下制备的DC。

[0065] (1)：在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0066] (2)：在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周。 [0067] 【图9】各样品(1)～(2)中CD11b+/CD11c+率和培养期间的增殖曲线图。 [0068] (1)～(2)为以下培养条件下制备的DC。

[0069] (1)：在FS36给药组条件下培养五周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周。

[0070] (2)：在FS36给药组条件下培养五周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周。 [0071] 【图10】DC前体细胞在FS36给药组条件下培养后，按GMIL-4给药组和GMSCF给药+ +组条件培养期间的细胞量的推移以及所得CD11bCD11c 细胞量。

[0072] 【图11】在以下(A)～(D)的DC中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)(图中表述为DC(SeV))或LPS(图中表述为DC(LPS))，2天后的CD80、CD86、MHC class II以及CD40表达量的比较图。同时显示了无添加的对照结果(图中表述为DC(NT))。

[0073] 图中(A)～(D)使用的DC如下。

[0074] (A)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC。

[0075] (B)：正常DC(normal DC)。

[0076] (C)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC。

[0077] (D)：在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC。

[0078] 【图12】在以下(A)～(D)的DC中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)或LPS，2天后的CD80、CD86及CD40的表达量比较图。同时显示了无添加的对照结果(图中表述为DC(NT))。

[0079] 图中的(A)～(D)使用的DC如下。

[0080] (A)：在GMSCF给药组条件下培养一周所得DC。

[0081] (B)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周所得DC。

[0082] (C)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周所得DC。

[0083] (D)：在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周所得DC。

[0084] 【图13】人CD34+细胞增殖曲线图。GMIL-4给药组(1)和GMSCF 给药组培养基的细胞增殖。

[0085] 【图14】人CD34+细胞的CD11c+率推移图。在GMIL-4给药组(1)和GMSCF给药组+培养基中培养细胞，确定了CD11c 率的推移。

[0086] 【图15】人CD34+细胞所得CD11c+细胞数(全细胞×CD11c+率)的推移图。在+GMIL-4给药组(1)或GMSCF给药组培养基中培养细胞，并检测了CD11c 细胞数。 [0087] 【图16】GMSCF给药组培养35天后的人CD34+细胞与35天中的最后3天经LPS刺+
激的人CD34 细胞的CD86表达量比较图。通过GM-CSF和SCF扩增并同时分化来自人脐血的DC前体细胞。

[0088] 【图17】在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC的ELISA法测定的细胞因子产量。DC中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)5
(图中标为SeV)或LPS(图中标为LPS)，2天后将培养上清液(10cells/ml)作为样品，检测了细胞因子的产量。图中的DC(NT)为无添加F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)和LPS的样品。与未进行细胞因子处理的DC同样，在GMIL-4给药组条件下培养一周的DC中，确认到IL-12及IFN-β的产生。

[0089] 图中的(1)～(4)具体如下所示。

[0090] (1)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC中的IFN-β产量的检测结果。

[0091] (2)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC中的IL-12产量的检测结果。

[0092] (3)：正常DC(normal DC)中IFN-β产量的检测结果。

[0093] (4)：正常DC(normal DC)中IL-12产量的检测结果。

[0094] 【图18】在FS36给药组条件下培养后，更换培养基为GMSCF给药组，向再培养1周所得DC中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)或LPS，2天后检测了FITC-dextran吞噬能力(endo-/phagocytotic activity)。图中的DC(NT)为无添加F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)(图中标为SeV)和LPS(图中标为LPS)的样品。DC的FITC-dextran(MW＝40,000)吞噬在37℃下表现活跃，4℃下被阻断。在37℃和4℃条件下，用FITC-dextran1mg/ml摄取各项反应30分钟。FS36给药组培养后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养1周所得DC保持了抗原吞噬能力。图中的(1)、(2) 具体如下。

[0095] (1)：FS36给药组培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC的检测结果。

[0096] (2)：正常DC(normal DC)的检测结果。

[0097] 【图19】在FS36给药组条件下培养后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养1周所6
得DC对T cell(C57BL/6)的增殖刺激强度的检测结果。T细胞全部为10 细胞。在FS36给药组条件下培养后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养1周所得DC保持了T细胞增殖、活性化功能。

[0098] (1)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC(无F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)和LPS刺激样品)的检测结果。

[0099] (2)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)。图为2天后的样品检测结果。 [0100] (3)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得的DC前体细胞中加入LPS。图为2天后的样品检测结果。

[0101] (4)：正常DC(normal DC)(无添加F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)和LPS刺激的DC)的检测结果。

[0102] (5)：正常DC(normal DC)中加入F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)，2天后的样品检测结果。

[0103] (6)：正常DC(normal DC)中加入LPS，2天后样品的检测结果。

[0104] (7)：同系淋巴细胞混合培养样品的检测结果。

[0105] (8)：正常DC(normal DC)本身(无T细胞)的检测结果。

[0106] 【图20】在FS36给药组条件下培养后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养1周所得DC的体内(in vivo)治疗效果。图中的样品(1)～(4)具体如下。

[0107] (1)：未给药DC的小鼠肺转移结节数的计数结果。

[0108] (2)：正常DC(normal DC)给药到小鼠尾静脉，小鼠肺转移结节数的计数结果。 [0109] (3)：在FS36给药组条件下培养二周后，更换培养基为GMIL-4给 药组，再培养一周后所得DC给药到小鼠尾静脉，小鼠肺转移结节数的计数结果。

[0110] (4)：在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMSCF给药组，再培养一周后所得DC给药到小鼠尾静脉，小鼠肺转移结节数的计数结果。

[0111] 【图21】人脐血CD34+细胞增殖分化的曲线图(A)、(B)以及增殖的细胞C D 11c阳性细胞的比例(C)。图(B)为图(A)的样品(5)给药组和样品(6)给药组培养期间0-15天的上述细胞增殖的详细示意图。此外，图(D)为其它实验中在GMSCF培养基中培养5周的人+脐血CD34 细胞的FACS解析结果(CD11c阳性率88.87％)。图(D)的黑色部分为CID11c抗体结果，白色为同型对照(iso)结果。图(D)中的右侧数值为CD11c抗体，左侧数值为同型对照(iso)中的M1区域的细胞数率(％)。图(A)中的样品(1)～(8)具体如下。图(A)和图(B)所述样品(1)～(8)标记的末尾A～E意为来自不同受试者细胞的结果。 [0112] (1)-(5)：在GMSCF给药组条件下培养。

[0113] (6)：在GMIL4给药组(2)条件下培养。

[0114] (7)和(8)：在GMIL4给药组(1)条件下培养。

[0115] 【图22】来自人G-CSF外周血的CD34+细胞的增殖曲线图(A)和增殖的细胞CD11c阳性细胞的比例图(B)。图中的样品(1)～(3)具体如下。图(A)的样品(1)～(3)标记末尾的A和B意为来自不同受试者细胞的结果。

[0116] (1)和(2)：在GMSCF给药组条件下培养。

[0117] (3)：在GMIL4给药组(1)条件下培养。

[0118] 【图23】在人脐血CD34+细胞的培养期间，GMSCF给药组培养35天的细胞中有无树突状突起的检测结果。B图为A图中部样品(在GMSCF给药组条件下培养5周后，经LPS刺激48小时)的放大图。明显可见树突状突起。

[0119] 【图24】在人脐血CD34+细胞的培养期间，培养14天(2W)和35天(5W)的细胞(在GMSCF给药组条件下培养的细胞)中的CD11b、CD33、HLA-ABC表达解析结果。 [0120] 【图25】在人脐血CD34+细胞的培养期间，培养35天的细胞中，经LPS处理或SeV/dF处理后，ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80以及CCR7 的表达解析结果。图中标记的意思如下。

[0121] iDC：iDC处理；SeV：SeV/dF处理；LPS：LPS处理。

[0122] 【图26】在人脐血CD34+细胞培养期间，培养35天的细胞(在GMSCF给药组条件下培养的细胞)中，未成熟DC(iDC)或加入LPS两天后的DC的FITC-dextran吞噬能力(endo-/phagocytotic activity)的检测结果。树突状细胞的FITC-dextran(MW＝40,000)吞噬能力在37℃下表现活跃，4℃下被阻断。在37℃和4℃下，用FITC-dextran 1mg/ml摄取各项反应30分钟。与树突状细胞同样，上述细胞的FITC-dextran(MW＝40,000)吞噬在37℃下表现活跃，4℃下被阻断。

[0123] 【图27】在人脐血CD34+细胞的培养期间，通过ELISA法测定了培养35天细胞(在GMSCF给药组条件下培养的细胞)中的细胞因子产量。对上述培养细胞进行了以下特定处5
理。以上述处理后的培养上清液(10cells/ml)为样品，测定了细胞因子产量。图中的NT为未进行下述特定处理的样品。所谓“特定处理”具体为：

[0124] (1)iDC处理：图中表示为iDC。

[0125] (2)SeV/dF处理：图中表示为SeV。

[0126] (3)LPS处理：图中表示为LPS。

[0127] (4)Poly(I:C)处理：图中表示为Poly(I:C)。

[0128] (5)CpG处理：图中表示为CpG。

[0129] (6)R-848处理：图中表示为R-848。

[0130] (7)OK432处理：图中表示为OK432。

[0131] 【图28】在人脐血CD34+细胞的培养期间内，检测了培养35天的细胞(在图21所述(1)或(2)条件下培养的细胞)对T细胞(allogenicT cell fromvolunteer)的增殖刺5 3
激强度。T细胞全部为10 细胞。在右上图中，DC细胞数1.00E+03(1×10 个)的结果对+ 4
应于DC∶CD3T细胞＝1∶100(混合组1)，DC细胞数1.00E+04(1×10 个)的结果对应+
于DC∶CD3T细胞＝1∶10(混合组2)。iDC：iDC+T细胞；SeV：用SeV刺激的DC+T细胞；
LPS：用LPS刺激的DC+T细胞；单iDC：只有iDC无T细胞；单T：只有T细胞。

[0132] 【图29】人脐血CD34+细胞在以下(1)～(3)条件下的培养结果。

[0133] (1)：在GMSCF给药组条件下培养(图中表示为“GMSCF”)。

[0134] (2)：在0.1GMSCF给药组条件下培养(图中表示为“GMSCF0.1”)。

[0135] (3)：在0.01GMSCF给药组条件下培养(图中表示为“GMSCF0.01”)。 [0136] 【图30】图29的星号(*)所示时点(35天培养时点)培养的细胞CD11c阳性细胞率的检测结果。图标记的意思如下。

[0137] (1)GMSCF：在GMSCF给药组条件下培养。

[0138] (2)GMSCF0.1：在0.1GMSCF给药组条件下培养。

[0139] (3)GMSCF0.01：条件下0.01GMSCF给药组条件下培养。

[0140] 发明的实施方案

[0141] 本发明涉及一种树突状细胞制备方法，其包含在多种细胞因子培养基中培养树突状细胞前体细胞的步骤。该步骤可有效地扩增及/或分化DC前体细胞。本发明的方法可在添加多种细胞因子的培养基中培养DC前体细胞。多种细胞因子优选包含SCF和白细胞介素3(IL-3)，更优选包含FLT-3配体(FLT-3L)或白细胞介素6(IL-6)。即适用于所有添加FLT-3L、SCF、IL-3、IL-6的培养基，即使从患者提取的DC量少，也可以调制出能够获得治疗效果所需的大量细胞数的DC。

[0142] 更优选的步骤是，在添加所有FLT-3L、SCF、IL-3、IL-6的培养基中培养后，追加在有(i)GM-CSF和IL-4或者(ii)GM-CSF和SCF的培养基中培养的步骤。更加有效地将DC前体细胞高效率地分化成DC。即使从患者提取的DC量少，也可以调制出获得治疗效果所需的足够细胞数的DC。

[0143] 本发明的树突状细胞(Dendritic cell；DC)是指在成熟状态下呈树突状形态，具有递呈抗原、激活T细胞能力的细胞。本发明的树突状细胞前体细胞是指在适当的细胞因子(即，G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-13、SCF(c-kit配体)、Flt-3配体及其组合)存在下可分化为DC的细胞，优选4周以内、更优选20天以内、更优选18天以内、更优选16+天以内可分化为树突状细胞的细胞。这种细胞例如有CD34 干细胞、造血原始细胞、骨髓单核细胞等。这些细胞可调制成细胞组分。细胞组分是指细胞分离(或组分)所得细胞团。细胞组分可以是细胞以及药学上可容许的承运体的组合物。承运体例如有生理盐水、磷酸缓冲液(PBS)、培养液、血清等可悬浮于活细胞的所需溶液。树突状细胞的分化可以是，例如在SCF (50ng/ml)、GM-CSF(500U/ml)、TNF-α(50ng/ml)存在下培养约3天后，再于SCF(50 ng/ml)、GM-CSF(500U/ml)、IL-4(250U/ml)、TNF-α(50ng/ml)中进行培养。更优选在GM-CSF(20ng/ml)和IL-4(20ng/ml)，或GM-CSF(20ng/ml)和SCF(10ng/ml)中进行培养。

[0144] 树突状细胞包含分布于活体内各组织器官的来自于骨髓细胞的具有树突的细胞组、在体外in vitro利用细胞因子等对来自骨髓或血液的干细胞进行分化诱导后的分布于活体组织器官中具有树突的细胞、以及与此同等的细胞组。树突状细胞具体包含，例如淋巴细胞系树突状细胞(可以是诱导Th2或诱导免疫耐受)、骨髓细胞系树突状细胞(一般使用的树突状细胞。包含未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)、胰岛细胞(皮肤抗原递呈细胞中重要的树突状细胞)、连结细胞(分布于淋巴结、脾脏的T细胞领域，对T细胞起抗原递呈作用的细胞)、滤泡树突状细胞(是重要的对B细胞的抗原递呈细胞，抗原和抗体复合体、抗原和补体复合体通过抗体受体、补体受体递呈到树突状细胞，抗原递呈给B细胞。)等，优选可高水平表达MHC I类和II类，更优选表达CD11c的细胞。本发明优选使用由骨髓和外周血回收的细胞提取的DC和DC前体细胞。对DC的来源生物种类没有特别限制，可以是人、猴等灵长类，也可以是小鼠、大鼠等啮齿目和兔、牛、山羊等哺乳类的DC。 [0145] 此外，树突状细胞可以是呈树枝状形态，从CD11c、HLA-class II(HLA-DR、-DP或-DQ)、CD40及CD1a组选择出来的表面标记2个以上阳性的细胞。本发明的树突状细胞优+ + + + +选HLA-class II 和CD11c 细胞，更优选CD1a、HLA-class II 及CD11c 细胞中不表达系统-
标记为阴性(Lin)的T细胞标记(CD3)、B细胞标记(CD19、CD20)、NK细胞标记(CD56)、中性粒细胞标记(CD15)、单核细胞标记(CD14)的细胞。骨髓细胞系树突状细胞(Myeloid DC)+ +
更优选表达CD11b。本发明的DC包含CD11bCD11c 细胞。淋巴细胞系树突状细胞(Lymphoid DC)中还可表达CD8。

[0146] 本发明的树突状细胞还包含成熟的树突状细胞或未成熟的树突状细胞。所谓未成熟的树突状细胞是指其T细胞激活能力明显低于成熟状态的树突状细胞。具体来说，与加入LPS(1μg/ml)后培养2天诱导后成熟的树突状细胞相比，未成熟树突状细胞的抗原递呈能力低于1/2，优选低于1/4。抗原递呈能力可通过以下两种方法进行定量。一种方法是通过同种异型T细胞激活能力(混合淋巴细胞试验：将同种异型T细胞和树突状细胞3
以1∶ 10比例混合培养，优选变化比例进行培养，培养结束后的8小时之前加入 H-胸腺嘧啶糖苷(thymidine)，根据其T细胞DNA中的摄取量，定量T细胞增殖能力。文献：
Gene Therapy 2000；7；249-254)进行定量；另一种方法是通过肽的特异性细胞毒性T细胞(CTL)的诱导能力试验(在树突状细胞中加入已知具有某种抗原Class I限制性的肽，将提取的正常人树突状细胞与其本人的外周血T细胞共同培养(第3天以后使用25U/ml的IL-2、优选100U/ml)(优选21天内进行3次树突状细胞刺激，更优选14天内进行2次树
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突状细胞刺激)，将由此所得效应细胞与 Cr标记的靶细胞(ClassI限制性肽阳性肿瘤细胞)以100∶1～2.5∶1(100∶1、50∶1、25∶1、20∶1、12.5∶1、10∶1、5∶1或
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2.5∶1)、优选10∶1的比例混合培养4小时后，通过靶细胞的 Cr释放量(文献：Arch Dermatol Res 2000；292；325-332))进行定量。另外，未成熟树突状细胞优选具有抗原吞噬能力，更优选诱导T细胞活化的共刺激受体的表达水平降低(例如，明显低于上述LPS诱导的成熟DC)或为阴性。另一方面，所谓成熟树突状细胞是指激活T细胞的抗原递呈能力明显高于未成熟状态的树突状细胞。具体来说，成熟树突状细胞是加入LPS(1μg/ml)培养
2天后，具有成熟诱导的树突状细胞的一半以上抗原递呈能力的细胞，优选具有同等以上抗原递呈能力。成熟树突状细胞优选抗原吞噬能力降低或不具备抗原吞噬能力的细胞，更优选诱导T细胞活化的共刺激受体的表达为阳性的细胞。所谓树突状细胞的活化是指未成熟树突状细胞转化为成熟树突状细胞，活化的树突状细胞的范畴还包含成熟树突状细胞以及通过活化刺激诱导共刺激的CD80、CD86表达提高的途中经过的那些树突状细胞。 [0147] 成熟人树突状细胞是CD40、CD80、CD86以及HLA-class II的表达为阳性的细胞。
例如，以CD80和CD86组成群中选择出来的标记为基础，可以分辨出未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。未成熟树突状细胞优选这些标记较弱或为阴性，而成熟树突状细胞则为阳性。

[0148] 如上所述，未成熟树突状细胞通常具有强大的吞噬能力。在树突状细胞中加入LPS(1μg/ml)培养2天后，树突状细胞被活化，而吞噬能力却下降。吞噬能力可通过测定树突状细胞的小分子吞噬量或者吞噬细胞的比例进行测定，优选通过树突状细胞内的小分子吞噬量来测定。例如，用直径1μm左右的着色玻璃珠来测定树突状细胞内的玻璃珠的吞噬量，再减去4 ℃下呈阳性的背景后进行定量。所谓高强的吞噬能力是指，与经上述LPS(1μg/ml)刺激2天后的树突状细胞相比，树突状细胞内的小分子吞噬量为4倍以上、优选5倍以上、更优选6倍以上的吞噬能力。或者，吞噬小分子的细胞的比例为2倍或以上，更优选3倍以上。所谓低吞噬能力是指，与经上述LPS(1μg/ml)刺激2天后的树突状细胞相比，树突状细胞内的小分子吞噬量低于4倍，优选低于2倍，更优选低于1.5倍。或者，吞噬小分子的细胞的比例低于2倍，优选低于1.5倍。

[0149] 本专业人士通常都可分辨成熟树突状细胞，上述各标记及其表达的测定方法也为本专业人士熟知。例如，CD11c是分子量约为150kD的粘附糖蛋白(p150，整合素α链)。有报告说，CD11c结合于CD18，形成CD11c/CD18复合体，具有对纤维蛋白原的结合能力，成为iC3b和ICAM-1的受体。另有报告说，CD11c/CD18可作为结合于被刺激的上皮受体的粘附分子发挥作用(Knapp，W.et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV：White CellDifferentiation Antigens，Oxford University Press，New York；Barclay，N.A.etal.，eds.，1993，The Leucocyte Antigen FactsBook，CD11 Section，AcademicPress Inc.，San Diego，California，p.124；Stacker，S.A.and T.A.Springer，
1991，J.Immunol.146：648)。

[0150] CD1a是分子量约为49kD的多肽，与β2微球蛋白结合。CD1a在结构上被认为与MHC class I的抗原相似，具有抗原递呈功能(Knapp，W.et al.，eds.，1989，Leucocyte Typing IV：White Cell Differentiation Antigens，OxfordUniversity Press，New York；Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte TypingV：White Cell Differentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Hanau，D.et al.，1990，J.Investigative Dermatol.95：503；Calabi，F.and A.Bradbury.，1991.，Tissue Antigens 37：1)。 [0151] CD11b也称为整联蛋白αM链、Mac-1、CR3、iC3bR(complement receptortype
3)、Mo1，是分子约165～170的I型跨膜通糖蛋白质。以补体(iC3b)、血纤维蛋白原、凝固因子X的受体机能参与吞食细胞活动(Todd R.F.et al.J.Immunol.，126，
1435-1442(1981)；Leong A.S.Y.Appl.Immunohistochem.Surg.Pathol.，120-128(1993)；
Todd R.F.et al.Hybridoma，1，329-337(1982)；Cobbold S.et al.Leucocyte Typing III，
788-803(1987)；Keizer G.et al.Eur.J.Immunol.，15，1142-1148.(1985)；Laffon A.et al.J.Clin.Invest.，88，546-552 (1991)；Acevedo A.et al.J.Invest.Dermatol.，97，
659-666(1991))。

[0152] CD11c(整联蛋白α4亚基或p150白细胞表面抗原)是整联蛋白家族的成员，与其他白细胞整联蛋白(CD11a、CD11b、CD11d)同样，非共价性地与整联蛋白β2亚基(CD18)结合。已知CD11c是分子量145-150kDa的跨膜糖蛋白，是树突状细胞的标记(Molica S.et al.Blood，81，2466(1993)；Van der Vieren M.et al.Immunity，3，683-690(1995)；Hogg N.et al.LeucocyteTyping III，576-602(1987))。

[0153] CD14是分子量53-55kD的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚型单链糖蛋白，在细网树突状细胞以及某种朗格罕斯细胞中表达。CD14被定性为对LPS与血清LPS结合蛋白质(LPB)的复合体具有高亲和性的表面受体(McMichael，A.J.et al.，eds.，1987，Leucocyte Typing III：White Cell Differentiation Antigens，Oxford University Press，New York；Knapp，W.et al.，eds.，1989，LeucocyteTyping IV：White Cell Differentiation Antigens，Oxford University Press，NewYork；Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte Typing V：White CellDifferentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Wright，S.D.etal.，1990，Science 249：1434)。

[0154] CD40 是 分 子 量 45-48 kD 的 I 型 内 在 膜 蛋 白 (type I integral membraneglycoprotein)，CD40常作为细胞标记使用(Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte Typing V：White Cell Differentiation Antigens.Oxford UniversityPress，New York；Galy，A.H.M.；and H.Spits，1992，J.Immunol.149：775；Clark，E.A.and J.A.Ledbetter，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：4494；Itoh，H.et al.，1991，Cell 66：233；Barclay，N.A.et al.，1993，The Leucocyte Antigen FactsBook.，Academic Press)。 [0155] CD80是分子量约60kD的跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白超家族(Igsupergene family)中的一员。CD80是在T细胞中表达的CD28以及CD152(CTLA-4)的配体
(Schlossman，S.et al.，eds.，1995，Leucocyte Typing V：WhiteCell Differentiation Antigens.Oxford University Press，New York；Schwarts，R.H.，1992，Cell 71：1065；
Azuma，M.et al.，1993，J.Exp.Med.177：845；Koulova，L.et al.，1991，J.Exp.Med.173：
759；Freeman，G.J.et al.，1998，J.Immunol.161：2708；Behrens，L.et al.，1998，J.Immunol.，161(11)：5943；Guesdon，J.-L.et al.，1979，J.Histochem.Cytochem.27：
1131-1139)。

[0156] CD83是分子量约45kD的跨膜蛋白，是免疫球蛋白超家族中的一员。CD83具有短链V型Ig细胞外区域和C末端的细胞质尾tail区域。CD83主要在滤泡树突状细胞、循环树突状细胞、淋巴组织连结(interdigitating)树突状细胞、体外(in vitro)生成的树突状细胞以及胸腺树突状细胞中表达(Zhou，L-J.，and T.F.Tedder，1995，J.Immunol.154.3821；Zhou，L-J.et al.，1992，J.Immunol.149：735；Summers，K.L.et al.，1995，Clin Exp.Immunol.100：81；Weissman，D.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci USA.92：826；Hart，D.N.J.，1997，Blood 90：3245)。

[0157] CD86(B70/B7-2)是分子量约75kD的细胞表面蛋白，是CD28以及CTLA-4的第2配体，在初期免疫应答中作为T细胞的共刺激发挥着重要的作用(Azuma M.et al.，1993，Nature 366：76；Nozawa Y.et al.，1993，J.Pathology 169：309；Engle，P.et al.1994.，Blood 84：1402；Engel，P.et al.，CD86 Workshop Report.In：Leukocyte Typing V.Schlossman，S.F.et al.eds.，1994，Oxford University Press；Yang，X.F.et al.，1994，Upregulation of CD86antigen on TPAstimulated U937 cells，1994，(abstract).American Society ofHematology，Nashville，TN；Guesdon，J.-L.et al.，1979，J.Histochem.Cytochem.27：1131-1139)。

[0158] CCR7是也称为BLR-2、EBI-1及CMKBR7的7回膜贯穿型G蛋白质结合受体，是CC趋化因子MIP-3β/Exodus 3/ELC/CCLl9和6Ckine/Exodus2/SLC/TCA4/CCL21的 受体 (Sallusto，F.et al.，1999，Nature 401：708-12；Lipp，M.et al.，2000，Curr.Top.Microbiol.Immunol.251：173-9；Birkenbach，M.et al.，1993，J.Virol.67：2209-20；Schweickart，V.L.et al.，1994，Genomics 23：643-50；Burgstahler，R.et al.，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.215：737-43；Yoshida，R.et al.，1997，J.Biol.Chem.272：
13803-9；Yoshida，R.et al.，1998，J.Biol.Chem.273：7118-22；Yoshida，R.et al.，1998，Int.Immunol.10：901-l0；Kim，C.H.et al.，1998，J.Immunol.161：2580-5；Yanagihara，S.et al.，1998，J.Immunol.161：3096-102)。

[0159] HLA-class II有DR、DP和DQ，可通过与其全部结合的抗体进行网筛式检 测 (Pawelec，G.et al.，1985，Human Immunology 12：165；Ziegler，A.et al.，1986，Immunobiol.171：77)。HLA-DR是人类class(主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC))II的抗原之一，是由α链(36kDa) 和β亚基(27kDa)组成的跨膜糖蛋白。在表皮的朗格汉斯细胞中与CD1a共同表达。CD1a在抗原递呈过程中，对细胞的相互作用发挥重要作用(Barclay，N.A.et al.，1993，The Leucocyte Antigen Facts Book.p.376.Academic Press)。

[0160] 以上述标记基因及其相同的基因产物为指标，可对人类以及人类以外的哺乳动物鉴定树突状细胞。该标记的抗体例如可从BD公司(BDPharMingen)购入，详细情况可参考该公司或其销售代理店的网页。

[0161] 关于树突状细胞的标记还可参考以下Kiertscher等以及Oehler等的文献(Kiertscher SM，Roth MD，Human CD14+leukocytes acquire the phenotypeand function of

[0162] antigen-presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL-4，J.Leukoc.Biol.，1996，59(2)：208-18 ；Oehler，L.et al.，Neutrophilgranulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cellcharacteristics.，J.Exp.Med.，1998，187(7)：1019-28)。关于流式细胞分析术，可参考Okano等以及Stites等的文献(Okano，S.et al.，Recombinant Sendaivirus vectors for activated T lymphocytes.，Gene Ther.，2003，10(16)：1381-91；Stites，D.et al.，Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDSusing monoclonal antibodies and simultaneous dual immunofluorescence.，Clin.Immunol.mmunopathol.，1986，38：161-177)。如用同型对照抗体(isotypecontrol antibody)染色时，各标记的表达以阳性率不超过1％的萤光强度为界限，1％及其以上为阳性，小于1％为阴性。

[0163] 树突状细胞及其前体细胞可按照已知的方法进行调制。例如，可以从血液(如外周血和脐血)、骨髓、淋巴结、其它淋巴器官、脾脏、皮肤中分离(Bishop et al.，Blood 83：610-616，1994；Bontkes，H.J.et al.(2002)J.Leukoc.Biol.72，321-329；Katsuaki，S.et al.(1998)CRYOBIOLOGY 37，362-371；Ladan，K.et al.(2006)Stem Cells 24，2150-2157；
Ueda，T.et al.(2000)J.Clin.Invest.105：1013-1021)。本发明中使用的树突状细胞优选从血液或骨髓提取。另外，本发明中使用的树突状细胞也可以是皮肤的朗格罕斯细胞、输入淋巴管的隐蔽细胞、滤泡树突状细胞、脾脏树突状细胞以及淋巴器官的指状突起细胞等。本+
发明使用的树突状细胞还包含从来自CD34 树突状细胞、来自骨髓的树突状细胞、来自单核细胞的树突状细胞、来自脾 细胞的树突状细胞、来自皮肤的树突状细胞、滤胞树突状细胞以及胚中心树突状细胞等组成的组群中选择出来的树突状细胞。DC前体细胞尤其优选骨髓或外周血提取的造血干细胞或造血始原细胞等。造血干细胞或造血始原细胞可通过市销试+
剂盒的阴性试剂和CD34 等阳性试剂单离(参考美国专利08/539,142)。已知的方法例如有，利用磁珠、萤光标签分类、生物素或亲和素结合承运体等单离表面抗原细胞(Berenson et al.，J.Immunol.Meth.，91：11，1986；WO 93/08268)。

[0164] 从含有DC和DC前体细胞以及其它细胞的组合物中选择(或浓缩)DC及DC前体细胞时，优选实施所谓的阴性选择，以便去除DC及DC前体细胞以外的细胞。采取阴性选择，DC-中性细胞(granulocytes)的前体细胞(precursor)(J.Exp.Med.，1998，187：1019-1028；Blood，1996，87：4520-4530)则不被去除而得以保留，不仅可以获取粘付性CD14细胞分化的DC，还可获取那些前体细胞(precursor)分化的DC，载体导入DC时，可望降低细胞毒性。

[0165] 例如，在T细胞、NK细胞、B细胞等中使用特异性抗体，去除这些细胞，可浓缩DC。具体来说，优选CD2、CD3、CD8、CD19、CD56、CD66b中的表面标记或者其任意组合的表达低(low)或为阴性(negative)的细胞。更优选CD2、CD3、CD8、CD19、CD56以及CD66b全部表达低(low)或为阴性(negative)的细胞。因此，可以使用这些标记的抗体，去除表达这些标记的细胞(Hsu et al.(1996)Nature Med.2：52)。阴性选择也可以使用多价抗体，或者磁珠细胞分离(MACS)时利用磁珠也能进行同样的筛分。用血球分离等方法采集单核细胞来大量调制细胞时，优选使用磁珠。例如，从活体细胞溶液浓缩单核细胞，阴性选择后调制的DC前体细胞适于本发明优选使用。

[0166] 树突状细胞的具体单离方法如Cameron et al.，1992，Science 257：383、Langhoff et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7998、Chehimi et al.，1993，J.Gen.Viol.74：1277、Cameron et al.，1992，Clin.Exp.Immunol.88：226、Thomas et al.，1993，J.Immunol.150：821、Karhumaki et al.，1993，Clin.Exp.Immunol.91：482等所述。利用流式细胞分析术单离树突状细胞的方法如Thomas et al.，1994，J.Immunol.153：4016、Ferbas et al.，1994，J.Immunol.152：4649、以及O′Dohelrty et al.，1994，Immunology82：487所 述。细胞磁珠分选方法如Miltenyi et al.，1990，Cytometry 11：231-238所述。

[0167] 人树突状细胞单离和增殖可采用Macatonia et al.，1991，Immunol.74：399-406、O′Doherty et al.，1993，J.Exp.Med.178：1067-1078、Markowicz et al.，1990，J.Clin.Invest.85：955-961、Romani et al.，1994，J.Exp.Med.180：83-93、Sallusto et al.，1994，J.Exp.Med.179：1109-1118、Berhard et al.，1995，J.Exp.Med.55：1099-1104等所+
述方法。由骨髓、脐血、外周血等获取的CD34 细胞和来自外周血单核细胞的树突状细胞形成可依Van Tendeloo et al.，1998，Gene Ther.5：700-707所述方法进行。 [0168] DC前体细胞在含一种到多种细胞因子的培养基中扩增。例如，若培养基中只含IL-3，10天可扩增DC前体细胞，但较长时间的扩增则显不足。本发明者们发现，在含有SCF和IL-3的培养基中培养DC前体细胞，可高效率扩增具有分化DC能力的细胞。所以，2周以上的扩增优选IL-3和SCF的组合。尤其在含有FLT-3L、SCF、IL-3及IL-6的4种细胞因子的培养基中培养DC前体细胞，可大量获取具有高DC分化能力的DC前体细胞。本发明涉及DC的制备方法，该方法包含在以下3种培养基中扩增DC前体细胞的步骤。

[0169] 1.含IL-3和SCF，不含FLT-3L和IL-6的培养基；

[0170] 2.含FLT-3L、SCF和IL-3，不含IL-6的培养基；

[0171] 3.含SCF、IL-3和IL-6，不含FLT-3L的培养基。

[0172] 本发明还涉及DC的制备步骤，该步骤包含在含有FLT-3L、SCF、IL-3及IL-6，但明显不含G-CSF、GM-CSF、IL-4及TNF-α中的其中1种以上(或其任意组合)细胞因子的培养基中扩增DC前体细胞的步骤。

[0173] FLT-3L(Fms样酪氨激酶3配体)是Flt-3配体，可促进造血系前体细胞的分化增殖(Namikawa R.et al.，BLOOD 87：1881-1890，1996)。EP0627487A2及WO 94/2839所述的一组多肽包含在本发明的Flt-3L中。人FLT-3L cDNA可从accession humber ATCC 69382的American Type CultureCollection(ATCC)获得。SCF也称c-kit配体、肥大细胞增殖因子(MGF)、或青灰因子(Zsebo et al.，Cell 63：195-201，1990；Huan，E.Cell 63：225-233；Williams，D.E.，Cell 63：167-174，1990；Toksoz.D et al，PNAS 89：7350-7354，1992)。SCF包含EP 423,980所述的多肽。

[0174] IL-3是由激活的T细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞产生的造血因子。 本发明的IL-3中包含美国专利第5,108,910号所述的IL-3多肽。编码人IL-3蛋白质的DNA序列可从accession number ATCC 67747获得。已发现IL-6是B细胞的分化诱导因子，不仅具有抗体生产体系，还具有多种生理活性，如肝脏急性蛋白活体合成诱导、与IL-3的相互作用下促进造血干细胞增殖等(Paul SR et al.，Blood，1991，77：1723-1733)。IL-4主要通过辅助T细胞生产，在T细胞、B细胞以及其它血球细胞内有多种生理活性(Mosley et al.，Cell59：335(1989)；Idzerda et al.，J.Exp.Med.171：861(1990)；Galizzi et al.，Intl.Immunol.2：669(1990))。GM-CSF是作为含有巨噬细胞和粒细胞的细胞团成长刺激因子而单离出来的细胞因子(美国专利第5,108,910号以及5,229,496号)。GM-CSF是粒细胞及巨噬细胞的前体细胞成长和生成所需的因子，刺激骨髓芽球及单芽球，诱导分化。 [0175] 各细胞因子的浓度可适当进行调整，例如FLT-3L，可调整为5～35ng/ml，优选10～30ng/ml，更优选15～25ng/ml，更优选约20ng/ml。使用FS36等不含GM-CSF的培养基时，SCF、IL-3、IL-6可调整为3～20ng/ml，优选5～15ng/ml，更优选7～12ng/ml，更优选约10ng/ml，但不限于此。培养基可使用RPMI1640和IMDM。培养基中可适当加入
5～20％的血清，优选加入10％左右，更优选适当加入牛胎血清(FBS)。DC前体细胞可从
5 5 5
1×10 ～5×10 细胞左右开始培养，如从约2.5×10 细胞开始培养。优选3～4天传代一
6 + +
次。传代时，优选调整细胞数至浓度低于2×10/ml。人CD34 细胞等灵长类CD34 细胞与GM-CSF、SCF混合培养时，GM-CSF的使用量为1～500ng/ml(1～200ng/ml或1～100ng/ml)，优选2～300ng/ml，例如5～200ng/ml，更优选10～150ng/ml，更优选20～120ng/ml，更优选30～100ng/ml。SCF可使用0.5～500ng/ml(0.5～100ng/ml和0.5～50ng/ml)，优选1～300ng/ml，更优选2～200ng/ml，更优选5～100ng/ml，例如10～70ng/ml，更优选20～60ng/ml，更优选25～50ng/ml左右。

[0176] 本发明者们发现DC前体细胞的扩增以3～4周为最佳，此后的DC分化效率明显提高。虽然培养更长时间可以提高细胞的收获量，但DC分化效率随之降低。尤其在FS36培养基中培养5周扩增的DC前体细胞，DC的分化效率明显降低。所以，在使用FS36等不含GM-CSF的培养基时，DC前体细胞培养宜在3-4周左右，优选3周左右，如18～24天，更优选20～22天，避免在含有相同细胞因子组合的培养基中超过该期间扩增DC 前体细胞。培养上述期间后，如以下所述，在DC分化培养基中培养，分化DC。例如，在含有FLT-3L、SCF、IL-3和IL-6的培养基中培养DC前体细胞时，培养上述期间后，在不含任何FLT-3L、SCF、IL-3及IL-6的培养基中培养。

[0177] 扩增的DC前体细胞可通过细胞因子分化为DC。例如，通过粒细胞集落因子(G-CSF)、GM-CSF、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-4、IL-13、SCF(c-kit配体)、Flt-3配体、或其组合进行分化。优选将在不含GM-CSF的培养基(FS36等)中扩增的DC前体细胞，在GM-CSF和IL-4或在GM-CSF及SCF中培养分化为DC。也可分化成用TNF-α刺激的成熟树突状细胞。本发明优选依上述方法，将在不含GM-CSF的培养基(FS36等)中扩增的DC前体细胞，在GM-CSF和IL-4或在GM-CSF和SCF中培养。细胞因子浓度可适当调整，在不含GM-CSF的培养基中扩增的DC前体细胞，其GM-CSF及IL-4浓度宜为1～500ng/ml，具体为2～300ng/ml，例如5～100ng/ml，优选10～50ng/ml，更优选15～25ng/ml，更优选约20ng/ml。SCF宜为1～200ng/ml，具体为2～100ng/ml、2～80ng/ml或2～60ng/ml，更具体说宜为3～20ng/ml，优选5～15ng/ml，更优选7～12ng/ml，更优选约10ng/ml。培养基可使用RPMI1640和IMDM。可适当加入5～20％的血清，优选加入10％左右，优选加入胎牛血清(FBS)。培养期间为5～15天，优选6～10天，更优选7天左右。在FS36中扩增细胞时，与GM-CSF和IL-4比较，在GM-CSF和SCF中分化更能有效地获取DC。

[0178] 如果是人CD34+细胞等人DC前体细胞和其它灵长类DC前体细胞，即使不在SCF和IL-3(S3)或FS36中进行如上扩增，也可通过在GM-CSF和IL-4、或GM-CSF和SCF中培养，扩增的同时进行分化。此时，培养期间为1～10周，例如1～6周，优选2～5周，更优+ +选3～6周、3～5周、4～5周。作为灵长类CD34 细胞，可使用例如脐血CD34 细胞、骨髓+ +
CD34 细胞以及外周血CD34 细胞等。

[0179] 培养液可使用所需的培养基。例如DMEM(Dulbecco′s Modified EagleMedium)、TMMEM(Minimum Essential Medium)、RPMI-1640、X-VIVO (Lonza)、IMDM(Iscove ′ s Modified Dulbecco′s Medium)等。最优选使用IMDM。优选适当加入血清，如1～20％(v/v)，更优选2～20％，更优选5～15％，更优选5～10％(如10％左右)。优选使用牛+
血清，最优选 使用胎牛血清(FCS)。从人CD34 细胞扩增iDC时，优选不添加TNF-α及/或IL-4。培养基中的TNF-α和IL-4浓度优选不明显超过加入的血清中所含各浓度，例如为血清(如正常FCS)中各细胞因子浓度的3、2或1倍以下，优选1/2以下，更优选1/3以下，+
更优1/5以下，具体为50ng/ml以下，优选40、30、20、10、5、3和1ng/ml以下。从人CD34 细胞扩增iDC时，优选只加入GM-CSF及SCF细胞因子的培养基。优选仅含GM-CSF和SCF细胞因子，不含其它细胞因子的培养基。

[0180] 本发明提供包含GM-CSF和SCF的树突状细胞扩增用组合物、树突状细胞调制用组合物、树突状细胞制备用组合物、树突状细胞扩增用培养基、树突状细胞调制用培养基以及树突状细胞制备用培养基。组合物可包含所需的消毒液、缓冲液、盐水等。培养基有如上所述的培养液，但不限于此。培养基可含或不含血清。也可含或不含抗生物。本发明还涉及制备该组合物和培养基时的GM-CSF及SCF的使用方法。本发明还涉及以GM-CSF及SCF为试剂盒组成要素的树突状细胞扩增用试剂盒、树突状细胞调制用试剂盒、树突状细胞制备用试剂盒。该试剂盒还可包含培养液(如不含血清)或调制培养液所需的粉剂(含氨基酸和盐等，不含血清和抗生物质等)。这些组合物、培养基及试剂盒优选用于人等灵长类树突状+细胞的扩增、调制及制备，更优选用于来自人等灵长类CD34 细胞的树突状细胞的扩增、调制及制备，且优选不含TNF-α及/或IL-4。例如，含血清时，组合物及培养基中的TNF-α和IL-4浓度优选不明显超过血清所含细胞因子的各浓度，例如为血清(如正常FCS)中的各细胞因子浓度的3、2和1倍以下，优选1/2以下，更优选1/3以下1/5以下，具体为50ng/ml以下，优选40、30、20、10、5、3和1ng/ml以下。不含血清时，优选只含GM-CSF及SCF细胞因子。

[0181] 按照本发明的方法，从CD34+细胞扩增DC可达102倍，优选0.5×103倍，更优选3 4 4 5 5
1×10 倍，更优选0.5×10 倍，更优选1×10 倍，更优选0.5×10 倍，更优选1×10 倍，更
6
优选0.5×10 倍以上。例如，培养1周，细胞能够以5倍的速度增加，优选6、7、8、9、10、11、
12和13倍以上。扩增的细胞包含高度提纯DC(iDC)。扩增的细胞的D11c阳性率(所有细+
胞中的CD11c 细胞比例)为30％以上，优选40％以上，更优选50％以上、60％以上、70％以上、75％以上、80％以上和85％以上。另外，将iDC经LPS和 Poly(I:C)、或仙台病毒等处理，可获取成熟DC。

[0182] 按照本发明的方法所得树突状细胞可望通过免疫诱导提高感染性疾病、癌症及其它疾病的治疗效果，作为DC疫苗用于针对性疾病的免疫治疗。例如，在肿瘤免疫治疗时，为使树突状细胞递呈肿瘤抗原，可将树突状细胞与肿瘤细胞的cell lysate(细胞溶解物)混合后肽冲击，或通过肿瘤抗原基因导入等方法，使树突状细胞递呈抗原，用于肿瘤的DC治疗。

[0183] 如果将肿瘤抗原基因导入树突状细胞，与肿瘤提取液或肽冲击相比，可望在体内in vivo延长肿瘤抗原递呈时间，还具有不依存HLA限制(使用的肽是来自抗原的某种肽，根据肽与HLA的结合关系，如果HLA的种类变化，其抗原中所用肽的部位也发生变化)等优点。

[0184] 树突状细胞的基因导入载体有质粒导入的核糖体法、电穿孔法(electroporation)等(Cancer Gene Ther 1997，4，17-25)。较实用的载体有以下3种：
i)腺病毒载体(J.Immnotherapy 2002；25；445-454，Gene therapy2000；7；249-254)；ii)逆转录病毒载体(J.Leuko.Biol.，1999；263-267.，Br.J.Haematol.2000；108；817-824)；
iii)慢病毒载体(J.Gene Med.2001；3；311-320，J.Immunol.Meth.2002；153-165，Mol.Ther.，2002；283-290，CancerGene Therapy 2002；9：715-724)。载体与树突状细胞的接触可在体内in vivo或体外in vitro，例如可在培养液、生理盐水、血液、血浆、血清、体液等所需的生理溶液中进行。

[0185] 使用例如慢病毒载体、逆转录病毒载体基因导入C D34阳性干细胞后，可在体外in vitro获取树突状细胞。此外，在猴免疫不全病毒(SIV)的辅助构建(helper construct)中保留vpx(促进前病毒DNA核内转移)，或用HIV插入DNA-flap序列(也可促进前病毒DNA的核内转移)，可使基因导入外周血来源的单核细胞和分化的树突状细胞(Mol.Ther.2002；283-290)。

[0186] 此外，由于腺病毒可直接高效率(约80％)基因导入到分化的树突状细胞中，故可望成为树突状细胞基因导入载体(J.Immnotherapy 2002；25；445-454)。然而，可提高基因导入效率的MOI具有降低同种异型T细胞的混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction；MLR)的免疫抑制作用(GeneTherapy 2000；7；249-254)，所以要慎重使用高MOI(尤其高DC∶T的比例)。此外，为了稀释细胞游离基(episome)，与基因导入CD34阳性细胞的干 细胞后使其分化树突状细胞相比，优选在分化进展阶段导入基因。 [0187] 除上述病毒载体外，还可导入负链RNA病毒等RNA病毒。负链RNA病毒载体导入基因，只需短时间接触即可获得接近100％的导入效率，且同种异型T细胞应答抑制程度较轻，可保持T细胞的刺激性(WO2005/042737)。所谓负链RNA病毒是指以负链(相对于编码病毒蛋白的有义链互补的反义链)RNA为基因组的病毒，也称为(-)链RNA病毒。本发明所使用的负链RNA病毒包含副粘病毒(包含Paramyxoviridae科Respirovirus属、Morbillivirus属、Rubulavirus属及Pneumovirus属等)、弹状病毒(包含Rhabdoviridae科Vesiculovirus属、Lyssavirus属及Ephemerovirus属等)、纤丝病毒(Filoviridae科)、正粘病毒(包含Orthomyxoviridae科Infuluenza virus A，B，C，及Thogoto-like viruses等)、布尼亚病毒(包含Bunyaviridae科Bunyavirus属、Hantavirus属、Nairovirus属及Phlebovirus属等)、沙粒病毒(Arenaviridae科)等科属病毒。

[0188] 本发明中的负链RNA病毒优选使用副粘病毒亚科(包含呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属、麻疹病毒属)属病毒和其诱导体，更优选使用包含仙台病毒的呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称为副粘病毒属(genusParamyxovirus))病毒和其诱导体。为了不破坏病毒基因导入功能，诱导体包含改变了病毒基因的病毒和化学修饰病毒等。较适用的病毒有F基因缺失型负链RNA病毒。各种负链RNA病毒的重组病毒的制备方法为已知(WO97/16539；WO97/16538；Durbin，A.P.et al.，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.et al.，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.et al.，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.et al.，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.et al.，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，
1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404)。

[0189] 非活性化状态(未成熟状态)树突状细胞的负链RNA病毒载体的导入效率明显高于成熟树突状细胞。所以，负链RNA病毒载体优选与未成熟树突状细胞接触，或与含有未成熟树突状细胞的细胞组分混合。树突状细胞通过与细菌或脂多糖(LPS)、双链RNA或RNA病毒等接触产生活化。用 此方法另行激活导入基因的树突状细胞时，可以激活后再导入载体，但为不降低载体的导入效率，优选在载体基因导入后(或载体与树突状细胞接触的同时)，而不是在载体导入前进行活化操作。

[0190] 将用本发明方法扩增的DC前体细胞在GM-CSF和SCF中进行培养，分化成DC后，再在LPS或RNA病毒中培养，使DC活化。培养时间可适当调整，例如2～7天。负链RNA病毒等RNA病毒除用于免疫赋活(肿瘤免疫等)时可使用基因导入外，RNA病毒感染本身可引起树突状细胞活化，所以可省去导入后细胞因子等的活性化操作，有利于维持细胞存活(viability)，并降低成本和减少回体ex vivo的操作时间。此外，使用RNA病毒载体基因导入的树突状细胞，可容易在回体ex vivo短时高效诱导T细胞移植疗法所需的活化T细胞，特别是肿瘤特异性细胞毒性T细胞(WO2005/042737；WO2006/001122)。 [0191] DC可与药学上可接受的承运体混合制成组合物。承运体有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养液、血清等可悬浮活体细胞的所需溶液。组合物可以包含树突状细胞递呈的抗原肽。此外，将DC用于疫苗时，还可在疫苗组合物中加入提高免疫原性的细胞因子、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等免疫促进剂。疫苗中还可混合明矾、不完全Freund′s佐剂、MF59(油乳化剂)、MTP-PE(来自分枝杆菌细胞壁的muramyl tripeptide)及QS-21(来自soapbark tree Quilaja saponaria)等佐剂。

[0192] 抗原可通过与抗原细胞提取液的混合、肽冲击或载体编码的抗原基因导入DC，使其递呈到DC。抗原有与感染微生物、病毒、寄生虫、病原体及癌等有关的所需抗原，可以是结构蛋白或非结构蛋白。该抗原(或者其加工肽)结合于树突状细胞表面的MHC分子，被递呈到细胞表面，诱导免疫应答。

[0193] 作为疫苗使用时，可适用于例如肿瘤、感染性疾病及其它一般疾病。用于治疗感染性疾病时，可解析例如感染性微生物的抗原蛋白表位，并将其在树突状细胞内表达和递呈。病原体来源的抗原有携带甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、δ肝炎病毒、乳头瘤病毒抗原、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV、疟疾等的蛋白质或其部分肽(G.L.Mandell et al.(Ed.)Hinman et al.，Principles and Practice of Infectious Diseases，3rd Ed.，Churchill Livingstone Inc.，NY，pp.2320-2333)。可将递呈这些抗原的DC用于感染性疾病的预防和治疗。具体来说，用于流感治疗的例如有强毒株H5N1型包膜；用于日本脑炎治疗的例如有日本脑炎病毒包膜蛋白质(Vaccine，vol.17，No.15-16，1869-1882(1999))；用于艾滋病治疗的例有如HIV gag和SIV gag蛋白质(J.Immunology(2000)vol.164，4968-4978)、HIV包膜蛋白质、Nef蛋白质及其它病毒蛋白等；用于霍乱治疗的例如有霍乱毒素的B亚单位(CTB)(Arakawa T，et al.，Nature Biotechnology(1998)16(10)：934-8、Arakawa T，etal.，Nature Biotechnology(1998)16(3)：292-7)；用于狂犬病治疗的例如有狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell DL et al.，1998，Nature Medicine 4(8)：949-52)；用于宫颈癌治疗的例如有人类乳头瘤病毒6型的衣壳蛋白L1(J.Med.Virol，60，200-204(2000))等。还可使用日本脑炎病毒的JE-E抗原蛋白质(特开昭64-74982、特开平1-285498)、人纯疱疹病毒病毒gD2蛋白质(特开平5-252965)、丙型肝炎病毒来源的多肽(特开平5-192160)、假性狂犬病病毒来源的多肽(特表平7-502173)等。也可用来解析感染这些病原性微生物的患者的细胞，同定抗原递呈细胞(APC)中被递呈的抗原蛋白表位。优选适当选择HLA型，同定所需HLA型表位。

[0194] 为特异性促进肿瘤的免疫应答，可使1种以上的肿瘤抗原递呈到树突状细胞。肿瘤相关抗原可通过调制例如肿瘤细胞的抽取液或纯化部分抗原而得(Cohen et al.，Cancer Res.54：1055(1994)；Cohen et al.，Eur.J.Immunol.24：315(1994)；Itoh et al.，J.Immunol.153：1202(1994))。可进一步提纯所得肿瘤抗原，并作为重组肽进行合成和表达。

[0195] 将抗原电脉冲(暴露)到纯化的树突状细胞，抗原一旦被DC吞噬，就会被其处理后递呈于细胞表面(Germain，R.N.，Cell 76：287(1994))。用抗原电脉冲树突状细胞的方法很多已公开，本行业人士日常根据递呈的抗原选择适当的方法。本发明提供含有本发明方法制备的DC递呈的抗原组合物以及用于免疫治疗的使用方法。本发明的组合物可通过注射、连续点滴、移植的持续释放或其它方法给药，以刺激免疫应答。代表性的方法有，与生理学上可接受的承运体、赋形剂或稀释剂混合给药含有树突状细胞的组合物。承运体有，所使用的剂量和浓度对给药个体没有明显毒性的生理盐水等。

[0196] 肿瘤抗原可以是肿瘤细胞特有的(即，存在于肿瘤细胞中，不存在于非肿瘤细胞中)，也可以是比同类型的非肿瘤细胞更高水平存在于肿瘤细胞的物质。通过给药该树突状细胞，可刺激免疫系统。CTL作为主要免疫效应物发挥作用时，抗原可使用在细胞内外表达的所需肿瘤抗原。使用树突状细胞，诱发继CD4T细胞活化后的B细胞活化刺激的抗体产生，以抗体为主要免疫效应物发挥作用时，优选使用表露于细胞表面的抗原，例如可使用细胞表面受体或细胞粘附蛋白。肿瘤抗原有用于卵巢癌等的Muc-1和Muc-1样浆液性串联重复肽(美国专利第5,744,144号)、诱发宫颈癌的人乳头瘤病毒蛋白E6和E7、黑色素瘤抗原MART-1、MAGE-1、-2、-3、gp100以及酪氨激酶、前列腺癌抗原PSA，此外还有CEA(Kim，C.et al.，Cancer Immunol.Immunother.47(1998)90-96) 及 Her2neu(HER2p63-71、p780-788；Eur.J.Immunol.2000；30：3338-3346)等。

[0197] 本发明调制的树突状细胞可有效用于癌症以及感染性疾病的免疫治疗。肿瘤抗原或感染性疾病相关抗原的基因所导入的树突状细胞或用该树突状细胞刺激的T细胞的免疫感可有效诱导患者的抗肿瘤和抗感染性疾病免疫。本发明还涉及本发明方法获取的树突状细胞的免疫应答诱导的利用方法。该方法具体涉及在肿瘤和感染性疾病治疗中的利用方法。本发明还涉及本发明方法所得树突状细胞在制备免疫活性剂中的利用方法。具体涉及在制备抗肿瘤制剂(肿瘤抑制剂)和感染性疾病治疗制剂中的利用方法。

[0198] 本发明调制的树突状细胞还可用于一般疾病的治疗，例如糖尿病的治疗可考虑使用I型糖尿病患者或其模型动物的胰岛素片段肽作为表位(Coon，B.et al.，J.Clin.Invest.，1999，104(2)：189-94)。

[0199] DC组合物还可包含可溶性细胞因子受体或细胞因子或其它免疫控制分子(Schrader，J.W.Mol.Immunol.28：295(1991))。这些细胞因子可与DC组合物分开，另行调制其它组合物，给药时可与DC同时或分别、依次给药。此外，如果由树突状细胞表达细胞因子类，可刺激免疫系统，提高对感染性微生物和癌症的免疫应答，所以，导入了编码细胞因子基因的树突状细胞也可在癌症及其它细胞因子治疗中有效发挥作用。携带编码免疫刺激性细胞因子的基因的载体所导入的树突状细胞可成为有效免疫诱导剂。免疫刺激性细胞因子包含白细胞介素(例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-27)、干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、 转化生长因子(TGF)-β、粒细胞集落因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、GM-CSF、IL-3和GM-CSF融合蛋白质、胰岛素样生长因子(IGF)-I、IGF-2、Flt-3配体、Fas配体及c-kit配体、CD40配体(CD40L)以及其它免疫调节蛋白(趋化因子及共刺激分子等)。可单独或混合使用这些刺激性细胞因子。

[0200] 这些细胞因子的氨基酸序列为本行业专业人员所周知，IL-4可参照Arai等(1989)、J.Immunol.142(1)274-282文献；IL-6可参照Yasukawa等(1987)、EMBO J.、6(10)：2939-2945文献；IL-12可参照Wolf等(1991)、J.Immunol.146(9)：3074-3081文献；IFN-α可参照Gren等(1984)J.InterferonRes.4(4)：609-617及Weismann等(1982)Princess Takamatsu Symp.12：1-22文献；TNF可参照Pennica等(1984)Nature 312：724-729；G-CSF可参照Hirano等(1986)Nature 324：73-76文献；GM-CSF可参照Cantrell等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82(18)：6250-6254文献。具体来说，编码GM-CSF的核酸序列包含Accession number NM 000758的第84～461位序列(氨基酸序列为NP_000749的第18～
144位)；编码IL-4的核酸序列包含Accessionnumber NM_000589的第443～829位序列(氨基酸序列为NP 000580的第25～153位)。可利用编码这些细胞因子的天然基因或者基因暗号的简并，构建包含编码功能性细胞因子的变异基因载体，并导入到树突状细胞。 [0201] 另外，可以对基因进行修饰以表达这些细胞因子的修饰体。例如，表达具有前体及成熟体两种形态的细胞因子(例如，切除信号肽生成活性片段的细胞因子，或通过蛋白质的限定分解生成活性片段的细胞因子等)时，可对基因进行修饰，使其表达前体或成熟体的任何一种形态。也可利用其它修饰体(例如，细胞因子的活性片段和异种序列(如异种信号肽)的融合蛋白)。

[0202] 树突状细胞可用于体内in vivo刺激患者自身的T细胞，或体外in vitro刺激T细胞。将感作的T细胞给药患者，可介导回体免疫疗法刺激患者的免疫系统。例如，可通过递呈抗原的成熟树突状细胞与T细胞接触，制备树突状细胞刺激的T细胞。在树突状细胞中递呈的抗原可以是由载体表达的蛋白质(或其加工的产物)，也可由外部电脉冲到树突状细胞。通过激活的T细胞诱导CTL。

[0203] 本发明还涉及使用本发明方法制备的树突状细胞刺激免疫系统的方 法。例如，可在患有感染性疾病或癌症的患者体内进行刺激免疫系统的治疗。该方法包含给药树突状细胞或T细胞的步骤。具体包含将本发明制备的DC或该DC刺激的T细胞的有效剂量给药到患者的步骤。将抗原肽电脉冲到树突状细胞，递呈所需抗原，可诱导对所需抗原的免疫。在体外进行T细胞与树突状细胞接触时，优选使用患者的T细胞，进行回体给药。 [0204] 个体给药DC或含有T细胞的组合物时，本行业人员可根据疾病的种类、患者的体重、年龄、性别、症状、给药目的、给药组合物的形态、给药方法等适当调整给药量。给药途径可适当选择，优选直接给药到患部。一般采取肌肉、腹腔、皮下或静脉注射、或者直接向淋巴结注射给药。优选皮下、腹腔内注射或淋巴结直接注射给药患者。树突状细胞一般可在约为5 9 6 8 7
10-10 细胞的范围内给药，优选10-10 细胞，更优选约10。给药次数视临床容许的副作用范围内，采取一次给药或反复给药。对给药对象没有特别限制，例如包括鸡、鹌鹑、小鼠、大鼠、狗、猪、猫、牛、兔、绵羊、山羊、猴及人等在内的禽类、哺乳动物(人或非人类的哺乳动物)以及其它脊椎动物。

[0205] 树突状细胞可作为抗肿瘤药物使用。例如，可通过将递呈肿瘤抗原的树突状细胞给药到肿瘤部位，抑制肿瘤的增长。肿瘤部位是指肿瘤和其周边(例如距肿物5mm以内，优选3mm以内)范围。给药树突状细胞前，先将肿瘤抗原与树突状细胞接触，可提高疗效。肿瘤抗原与树突状细胞的接触可采用树突状细胞和肿瘤细胞细胞溶解物(cell lysate)混合的方法、肿瘤抗原肽电脉冲到树突状细胞的方法、或将肿瘤抗原基因导入树突状细胞后表达的方法等。此外，用携带IFN-β和IFN-β基因的载体导入DC或直接注射到肿瘤，可望增强抗肿瘤效果。例如，携带IFN-β基因的RNA病毒载体(如负链RNA病毒载体)是非常有效的抗肿瘤药物。组合使用导入RNA病毒载体的树突状细胞给药和直接将携带IFN-β基因的载体注射到肿瘤患部给药，更能发挥高强的抗癌效果。

[0206] 给药由树突状细胞活化后的T细胞时，可通过静脉注射给药，T细胞的剂量为平均2 5 9 6 9 8 9
1m 体表面积约10 ～10 细胞，优选10 ～10 细胞，更优选10 ～10 细胞(参照Ridell等，1992、Science 257：238-241)。可根据需要定期注射给药(如每个月)。给药注射期间或给药后，根据情况要观察患者有无副作用。此时，优选使用由同一患者自身的树突状细胞活化的T细胞。 或者从患者提取T细胞，刺激T细胞的树突状细胞可使用来自其他健康人的HLA配型。反之，也可通过患者体内提取树突状细胞，刺激来自其他健康人HLA配型的T细胞。

[0207] 本发明制备的疫苗有效成分为树突状细胞，包含该树突状细胞的细胞可作为治疗疫苗接种到人体，为确保安全，可去除该细胞的增殖性。例如，脐血单核细胞经过分化诱导，其增殖能力会极度下降，为更加安全地使用疫苗，可通过加热处理、放射线处理或丝裂霉素C(MMC)处理等，在不破坏疫苗治疗功能的同时，使其丧失增殖能力。例如，采用X线照射时，可用总放射量1000～3300Rad进行照射。采用丝裂霉素C处理时，可在树突状细胞中加入25～50μg/ml的丝裂霉素C，然后在37℃中温育30～60分钟。采用细胞热处理时，可在
50～65℃下加热处理20分钟。
实施例

[0208] 以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于这些实施例。此外，本说明书所引用的文献全部纳为本说明书的一部分。

[0209] 实施例1、2、4、5和实施例图面中的FS36给药组、GMSCF给药组及GMIL-4给药组的组合成分如下。

[0210] FS36给药组：含有Flt-3配体(20ng/ml)、干细胞因子(Stem cell factor；SCF)(10ng/ml)、IL-3(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)(简称为FS36)、10％FBS的RPMI1640。 [0211] GMIL-4给药组：含有GM-CSF(20ng/ml)、IL-4(20ng/ml)、10％FBS的RPMI1640。 [0212] GMSCF给药组：含有GM-CSF(20ng/ml)、SCF(10ng/ml)、10％FBS的RPMI1640。 [0213] 实施例3、6、7和实施例图面中的GMIL-4给药组(1)、GMIL-4给药组(2)、GMSCF给药组、0.1GMSCF给药组和0.01GMSCF给药组的组合成分如下。

[0214] GMIL-4给药组(1)：含有重组人GM-CSF(25ng/ml)(Wako，Japan)、重 组人IL-4(50ng/ml)(Wako，Japan)、10％FBS的IMDM。

[0215] GMIL-4给药组(2)：含有重组人GM-CSF(100ng/ml)(Wako，Japan)、重组人IL-4(50ng/ml)(Wako，Japan)、10％FBS的IMDM。

[0216] GMSCF给药组：含有重组人GM-CSF(100ng/ml)(Wako，Japan)、 重组人SCF(50ng/ml)(Wako，Japan)、10％FBS的IMDM。

[0217] 0.1GMSCF给药组：含有重组人GM-CSF(10ng/ml)(Wako，Japan)、重组人SCF(5ng/ml)(Wako，Japan)、10％FBS的IMDM。

[0218] 0.01GMSCF给 药 组：含 有 重 组 人 GM-CSF(1ng/ml)(Wako，Japan)、重 组 人SCF(0.5ng/ml)(Wako，Japan)、10％FBS的IMDM。

[0219] 实施例6和实施例图面中的(1)iDC处理、(2)SeV/dF处理、(3)LPS处理分别为如下处理。

[0220] (1)iDC处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0221] 含有10％FBS的IMDM

[0222] (2)SeV/dF处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0223] 含有F基因缺失仙台病毒(moi＝50)、10％FBS的IMDM

[0224] (3)LPS处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0225] 含有LPS(1μg/ml)、10％FBS的IMDM

[0226] 本实验使用以下LPS。

[0227] SIGMA商品目录No.L7895-1MG(生物来源＝Salmonella typhosa)

[0228] (4)Poly(I:C)处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0229] 含有Poly(I:C)(100μg/ml)、10％FBS的IMDM

[0230] (5)CpG处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0231] 含有CpG(10μg/ml)、10％FBS的IMDM

[0232] (6)R-848处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0233] 含有R-848(1μg/ml)、10％FBS的IMDM

[0234] (7)OK432处理：在以下浓度的培养基中温育2天。

[0235] 含有OK432(0.5KE/ml)(中外制药日本标准商品分类号874299)、10％FBS的IMDM [0236] 〔实施例1〕细胞因子的树突状细胞(DC)前体细胞扩增和分化的确认 [0237] 首先，从小鼠(C3H)股骨、胫骨骨髓进行阴性选择，提取造血前体细胞(SpinSep mouse hematopoietic progenitor enrichment kit，StemCelltechnologies，Canada)。将该前体细胞分为FS36给药组、GMIL-4给药组和GMSCF给药组共三组进行培养。培养由
5
2.4×10cells开始，每3～4天在低于200万细胞/ml的浓度下传代培养6周。培养期间调制树突状细胞(DC) 前体细胞(图1)，计数细胞数，确认扩增速度，并用抗CD11b-FITC、抗CD11c-PE、抗c-kit-PE、抗CD131-PE染色后进行FACS解析，确认到上述前体细胞的分化能力(图3)。

[0238] 与其它给药组相比，FS36给药组小鼠的造血前体细胞明显扩增，21天扩增到了约10,000倍(图1、图2)。图2(1)的照片对应图表(1)时点，为小鼠造血前体细胞在GMIL-4给药组的条件下培养7天所得DC细胞的形态照片(显微镜观察)，实施例1、2、4、5及图面所示正常DC(normal DC)是指该细胞即小鼠造血前体细胞在GMIL-4给药组的条件下培养7天所得DC。正常DC(normal DC)也可确认到树突状突起。图2(3)是在图8的FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC的细胞形态照片(显微镜观察)，确认到树突状突起。图2中的照片(3)为曲线(ii)培养过程。

[0239] 小鼠造血前体细胞经FS36给药组培养后，在GM-CSF及IL-4中再培养一周，扩增了具有树突状细胞标记的CD11c阳性细胞分化能力的前体细胞。小鼠造血前体细胞通过FS36培养，21天后扩增到了约10,000倍(图1、图2)。再将这些细胞通过GM-CSF和IL-4、+ +或GM-CSF及SCF分化所得DC的CD11bCD11c 细胞数，是提取后即刻分化的约470倍。 [0240] 该扩增为6周(图1)，分化能力从4周扩增后逐渐下降。扩增5周后，分化后的CD11c阳性细胞数急剧减少。所以判明，能够大量获取CD11c阳性细胞数的是扩增3周后分化1周或扩增4周后分化1周(图10)。

[0241] 图4-图9为FS36给药组、GMIL-4给药组、GMSCF给药组的小鼠造血前体细胞培养1周的DC前体细胞的增殖曲线和抗CD11b-FITC、抗CD11c-PE的细胞分化结果。各图表示+ +
了CD11b/CD11c 率(％)。培养方法为，每周从FS36给药组扩增培养的小鼠骨髓造血前体细胞提取106左右的细胞，将该细胞在GMIL-4给药组或GMSCF给药组的条件下培养7天。
+ +
通过抗CD11b-FITC、抗CD11c-PE的FACS解析，确认分化后，再用CD11b/CD11c 率确认细+ +
胞分化率。最高CD11b/CD11c 率的条件是在图7所示的FS36给药组条件下培养三周后，+ +
更换培养基为GMIL-4给药组后再培养一周。此处的最高CD11b/CD11c 率是指DC前体细胞分化成DC的细胞比例高。图2(3)显示了图7所示的在FS36给药组条件下培养四周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周所得DC细胞形态的照片(显微 镜观察)，可从中确认到树突状突起。

[0242] 〔实施例2〕DC分化

[0243] 用moi50将F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)感染到小鼠造血前体细胞所得DC，或加入LPS(1μg/ml)后再培养2天，使用CD80-PerCP、CD86-PerCP、MHC classII-PerCP、CD40-PerCP，通过Flow cytometer分析了DC表面标记表达(图11、图12)。结果表明，通过仙台病毒的感染或LPS，与正常DC(normal DC)同样(图11(B))，在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组，再培养一周后制备的DC中，确认到了co-stimuratory molecule CD80和CD86表达、MHC ClassII表达和粘付分子(CD40)表达(图11(A))。

[0244] 〔实施例3〕通过GM-CSF和SCF扩增DC

[0245] 将人脐血CD34+细胞(购自Cambrex公司)在GMSCF给药组和GMIL-4给药组(1)的条件下培养35天后进行扩增和分化。在培养期间内，每3～7天用Flow cytometer分析5
c-kit、CD11c、CD86表达。将1×10 人脐血CD34+细胞在加入GM-CSF和SCF的培养基中培+ 9
养，CD11c 细胞逐渐扩增，35天后获得3.8×10。培养第32天加入LPS，3天后用CD11c-PE、CD86-PE进行了FACS。结果表明，与上述实施例2同样确认到LPS可提高CD86的表达水平+
(图16)。所以，小鼠和人都可通过细胞因子的混合扩增CD11c 细胞(图13、14和15)。 [0246] 〔实施例4〕扩增的DC细胞因子产量和抗原吞噬能力以及T细胞的增殖、活化能力的研究

[0247] 关于在FS36给药组的条件下培养并更换培养基为GMIL-4给药组后培养1周所得DC，调查了细胞因子产量(图17)和抗原吞噬能力(图18)以及T细胞的增殖、活化能力(图19)。

[0248] 与正常DC(normal DC)(将小鼠造血前体细胞在GMIL-4给药组条件下培养7天所得)同样，将小鼠骨髓造血前体细胞在FS36给药组条件下培养三周后，更换培养基为GMIL-4给药组再培养一周后所得DC也确认到IL-12及IFN-β的生产(图17)，并具有抗原吞噬能力(图18)及T细胞的增殖、活化能力(图19)。

[0249] 〔实施例5〕给药扩增DC对小鼠骨肉瘤肺转移的控制

[0250] <调制样品>

[0251] 在小鼠造血前体细胞的D C(1×105个)中加入肿瘤溶解液(含有3×105个肿瘤细胞)，温育8小时。然后，将F基因缺失型仙台病毒(SeV/dF)(moi50)导入该DC，再培养2天。将该培养后的DC尾部静脉注射到小鼠(C 3H、7周龄雌小鼠)。给药2天后，将L M8小鼠骨肉瘤细胞尾部静脉给药到小鼠。给药17天后，开胸解剖小鼠，肉眼计数肺转移结节数(图20)。

[0252] <结果>

[0253] 与给药正常D C(normal DC)(将小鼠造血前体细胞在GMIL-4给药组条件下培养7天所得)同样，在FS36给药组的条件下培养后，更换为GMIL-4给药组和GMSCF给药组培养1周，给药所得DC(参照图20的(3)和(4))也确认到了癌症肺转移得到控制。这表明在FS36给药组的条件下培养，更换培养基为GMIL-4给药组和GMSCF给药组，再培养1周所得DC可有效用于癌症治疗。

[0254] 〔实施例6〕GM-CSF和SCF的人树突状细胞前体细胞的DC扩增(其1)

[0255] <实验1>

[0256] 将人脐血CD34+细胞(购自Lonza公司)和人G-CSF处理后的外周血CD34+细胞(购自Lonza公司)在含有GM-CSF和SCF的培养基培养35天，进行了扩增和分化。 [0257] <实验1的结果>

[0258] 图21(A)、(B)结果表明，在含有GM-CSF和SCF的培养基中培养脐血CD34+细胞和+人G-CSF处理后的外周血CD34 细胞，也能大量获取细胞(图21、图22)。其细胞的CD11c阳性(+)细胞比例较高(图21(C)、(D)、图22(B))。

[0259] 在图中的GMSCF给药组中，对培养35天的细胞进行上述LPS处理后，确认到树突状突起(图23)。

[0260] <实验2>

[0261] 在实验1所示人脐血CD34+细胞的培养期间内，用Flow cytometer分析了培养14天和培养35天的细胞中的CD11c阳性(+)细胞的CD11b、CD33、HLA-ABC表达(图24)。成熟树突状细胞呈现CD11c阳性(+)且CD11b阳性(+)、CD11c阳性(+)且CD33阳性(+)、CD11c阳 性(+)且HLA-ABC阳性(+)的倾向。

[0262] 此外，在人脐血CD34+细胞的培养期间，用Flow cytometer分析了对培养35天细胞进行LPS处理或SeV/dF处理后的ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80及CCR7表达(图25)。与无处理(iDC处理)相比，成熟树突状细胞经LPS处理或SeV/dF处理后，其ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80及CCR7表达呈亢进倾向(Nauta AJ.，et al.Mesenchymal stemcells inhibit generation and function of both CD34+-derived andmonocyte-derived dendritic cells.J Immunol 177(4)，2080-2087(2006))(Yoneyama，Y.，et al.Development of immunostimulatory virotherapy usingnon-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells.Biochem Biophys ResCommun 355，129-135(2007))。 [0263] <实验2的结果>

[0264] 图24结果显示为(参照图面箭头)CD11c阳性(+)且CD11b阳性(+)、CID11c阳性(+)且CD33阳性(+)以及CD11c阳性(+)且HLA-ABC阳性(+)的倾向。

[0265] 图25结果显示，与无处理(iDC处理)相比，经LPS处理或SeV/dF处理的ICAM-1、CD86、HLA-DR、CD40、CD80及CCR7表达呈亢进倾向。

[0266] 图24和图25结果显示，根据表面标记的表达倾向，在GM-CSF和SCF的培养基中培养扩增的细胞有可能是树突状细胞。

[0267] <实验3>

[0268] 在人脐血CD34+细胞的培养期间内，调查了培养35天的细胞的吞噬功能(吞噬作用)(图26)。

[0269] <实验3的结果>

[0270] 试验表明，与细胞的吞噬作用能力极为低下的4℃条件相比，37℃条件下细胞的吞噬能力呈亢进(图26)。

[0271] 在37℃条件下，LPS处理比iDC处理后的细胞吞噬能力低。鉴于树突状细胞的吞噬能力随成熟而降低的已知情况(Yoneyama，Y.，et al.Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendaivirus-activated dendritic cells.Biochem Biophys Res Commun 355，129-135(2007))，表明本实验所使用的细胞(在含有GM-CSF和SCF的培养基中培养扩增的细胞)可能是树突状细胞。

[0272] <实验4>

[0273] 在人脐血CD34+细胞的培养期间内，调查了培养35天细胞的细胞因子生产能力。本实验使用了美国碧迪公司(Becton，Dickinson and Company)的Human Inflammation Kit(商品目录号：551811)(图27)。

[0274] <实验4的结果>

[0275] LPS等的刺激提高了IL-6、TNF-α、IL-1β的生产能力。在含有GM-CSF和SCF的培养基中培养扩增的细胞可认为具有细胞因子的生产能力(图27)。

[0276] <实验5>

[0277] 淋巴细胞的增殖刺激能力的研究结果(图28)。将人脐血CD34+细胞在GMSCF培+养基中培养所得DC，经丝裂霉素C(MMC)处理后，与CD3T细胞按以下比例混合。 [0278] 混合组1

[0279] MMC处理的DC数∶CD3+T细胞数＝1∶100

[0280] 混合组2

[0281] MMC处理的DC数∶CD3+T细胞数＝1∶10

[0282] 将上述混合细胞培养5天。检测了混合组2的T细胞增殖。

[0283] <实验5的结果>

[0284] 与混合组1相比，混合组2的LPS等刺激效果高(图28)。表明上述DC具有T细胞增殖、活化能力(图28)。

[0285] 实验1到实验5的结果表明，人脐血CD34+细胞在GMSCF给药组条件下培养所得细胞是成熟的树突状细胞。

[0286] 以上结果表明，所得细胞的特征为，1.通过刺激可形成典型的树突状突起；2.可表达MHC Class II分子、粘附分子和co-stimulatory分子；3.可表达炎症性细胞因子(包含IL-6、TNF-α、IL-1β)；4.具有吞噬活性和allostimulatory活性。即实验2到5的结果表明，可以认为实验1所示GMSCF给药组条件下培养的细胞是具有生物活性的树突状细胞。由此表明，在含有GM-CSF和SCF的培养基中，可由树突状细胞前体细胞制备树突状细胞。

[0287] 〔实施例7〕GM-CSF和SCF的人细胞的DC扩增(其2)

[0288] 图29显示了GM-CSF/SCF的浓度对DC增殖的影响。即使将GM-CSF(100ng/ml)和SCF(50ng/ml)的浓度降至1/10(10ng/ml GM-CSF，5 ng/ml SCF)，细胞数虽有减少，但仍维持其较高的增殖性。GM-CSF(100ng/ml)和SCF(50ng/ml)的浓度降1/100(1ng/ml GM-CSF，0.5ng/ml SCF)，仍可扩增DC。此外，35天培养的CD11c阳性细胞率如图30所示。各给药组都显示出较高的CD11c阳性细胞率。

[0289] 图29和图30的数据表明，为有效扩增DC，优选GM-CSF浓度高于1ng/ml、SCF浓度高于0.5ng/ml。此外，即使在0.01GMSCF给药组条件下培养也可扩增DC，表明用少量的细胞因子也可高效率地扩增DC。由此，本发明的方法可望成为生产成本低的DC制备方法。 [0290] 产业实用性

[0291] 本发明使大量制备树突状细胞变为可能。制备的DC可递呈癌症抗原，用于抗肿瘤DC疫苗。利用本发明的方法，即使从患者体内提取的DC前体细胞量少，也能够高效率地制备大量的DC。该制备方法所得DC具有高效抗肿瘤效果，可作为DC疫苗应用于癌症和感染性疾病的免疫治疗。本发明可望为癌症的免疫疗法做出重大贡献。