通过静脉给药的用于控制释放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的组合物

摘要

通过静脉给药的用于控制释放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的组合物。本发明涉及一种生物相容组合物，其包括海藻酸或其盐的微粒和活性成分。更具体地，本发明涉及用于包封要静脉给予需要其的患者的活性成分的微粒。当静脉给药时，这些微粒是具有如下的组合：其足以增加血液中活性成分的半衰期或存留时间尺寸，在肝脏中的摄取少，并且细胞清除快速。

权利要求

1.一种用于静脉给药的生物相容组合物，包括用于控制释放凝血因子的海藻酸或其盐的微粒，其特征在于这些微粒的尺寸小于或等于5μm，并且具有负Z电位。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述微粒的尺寸为1-4.5μm。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述Z电位为-70～0，不包括0。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述Z电位为-70～0，不包括0。

5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于所述凝血因子是VIII因子。

6.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于所述凝血因子是VWF。

7.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于所述凝血因子由FVIII和VWF形成的复合体。

8.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于所述凝血因子是IX因子。

9.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于所述凝血因子是VIIa因子。

10.一种制造根据权利要求1-9任一项所述的用于静脉给药的生物相容组合物的方法，所述生物相容组合物包括用于控制释放凝血因子的海藻酸或其盐的微粒，其特征在于所述方法包括以下的步骤：-喷雾，其中含有凝血因子和聚合物的溶液/混悬液/乳液通过喷嘴被泵出，并且以液滴的形式分散，-在干燥室中干燥，在此处热空气促进溶剂从液滴蒸发，以及-收集被包封的产物；

3

此方法在140～180℃的温度下进行，供应流速为35～40m/h，注射流速为3.5～5ml/min且压力为4～6psi。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于在喷雾阶段之前另外进行将所述乳液匀化的任选步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于该另外进行的匀化步骤通过施加

1500-2000psi的压力进行。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于获得的所述微粒的尺寸为1-4.5μm。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于获得的所述微粒的Z电位为-70～0，不包括0。

15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述凝血因子是VIII因子。

16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述凝血因子是VWF。

17.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述凝血因子是由FVIII和VWF形成的复合体。

18.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述凝血因子是IX因子。

19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述凝血因子是VIIa因子。

说明书

通过静脉给药的用于控制释放活性成分的海藻酸的生物相

容微粒的组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物相容组合物，其包括海藻酸或其盐的微粒和活性成分。更具体地，本发明涉及用于包封需要静脉给予患者的活性成分的微粒。当静脉给药时，这些微粒具有下列的组合：足以增加血液中活性成分的半衰期或存留时间的尺寸，在肝脏中的摄取少，并且细胞清除快速。本发明的组合物中的活性成分可以是人或动物来源的肽、蛋白质或激素，天然、重组或转基因性质的肽、蛋白质或激素。包括在本发明的组合物中的活性成分的实例中有凝血因子诸如VIII因子、IX因子或VIIa因子。

背景技术

[0002] 增加治疗性活性成分在血液中的半衰期具有许多优点，包括要达到所需的治疗效应所需的给药次数较少。此种给药次数的减少对于用于胃肠外给药的药物，尤其是用于静脉应用的药物和与长期用药特别相关的药物(诸如，例如，用于治疗慢性功能紊乱的那些药物)非常重要。

[0003] 目前的趋势是尽可能通过不需要静脉通路的途径来给予活性成分，因为当使用该方法时对患者很复杂和不便。然而，有一系列活性药物目前没有静脉给药的替代途径。包括在这些药物中的有具有大尺寸和复杂的活性成分，诸如生物或生物技术产品，包括蛋白质和激素。

[0004] 需要反复地静脉给予复杂的活性成分的慢性治疗性状况的一个实例是血友病。血友病是一种遗传性疾病，其特征为由于与凝血相关的蛋白全部或部分缺陷而出现内部和外部出血。A型血友病的特征为凝血因子VIII缺陷，阻碍了凝血酶的正常生成，结果使得血液难以正常凝结。在B型血友病时，IX因子缺陷导致类似的临床状态。

[0005] 对于血友病的治疗，一线治疗选择包括通过给予含有缺失蛋白(FVIII或FIX)的治疗性浓缩物来代替该因子。纠正血友病的止血功能的另一治疗选择是给予FVIIa，该因子具有在缺乏FVIII或FIX时产生凝血酶的能力。然而，此类型的治疗通常限于采用FVIII或FIX的治疗有问题或已经证明无效的病例，诸如，例如在对这些活性成分已经发生抑制性免疫应答的患者中。鉴于这些产品的结构复杂性和低上皮通透性，迄今为止，其中没有一种能够通过除静脉以外的任何给药方法来成功地给药。

[0006] 因此，受血友病影响的患者需要反复静脉给药，其频率由其在血浆中的半衰期来确定。FVIII的半衰期为约12小时。根据世界血友病联合会(World Federation of Haemophilia)的专题论文(Casper，CK，HereditaryPlasma Clotting Factor Disorders and Their Management，第5版，WFH，SamSchulman主编，2008)，这意味着对于一线预防方案，即，用于防止无关节损害的儿童出血，使用每48小时约20U/kg的剂量，足以将血浆FVIII的水平保持在正常值的1％以上。重要的是，此种治疗将具有严重血友病的人改变为具有轻微或中度的血友病。FIX的半衰期为约26小时，从而对于一线预防，可给予两周一次约40U/kg的剂量以维持1％的最小水平。

[0007] 要考虑的是，对于严重血友病，为避免关节损害，从小预防(约1岁或开始爬行时)是要求的护理标准。

[0008] 因此，血友病是一个明确的实例，即，增加活性成分的半衰期将对患者的生活质量提供实质性改善，因为这样将减少静脉给药的次数，尤其是减少对幼儿静脉给药的困难。

[0009] 采用静脉给药产品长期治疗的其他实例是，例如，使用免疫球蛋白(IgG)用于原发性免疫缺陷以及使用抗凝血酶III(AT)和α-1抗胰蛋白酶(AAT)用于先天性缺陷。

[0010] 针对延长这些类型活性成分的血浆半衰期有许多技术方法。研究最多之一是用相容聚合物如聚乙二醇(PEG)衍化蛋白质。此技术包括进行化学反应以将PEG链与蛋白质氨基酸共价连接的技术。此技术已证明对激素和短小肽链诸如干扰素是有用的，因为对于此类化合物，清除的主要机制是肾清除，很容易通过简单地增加大小来控制(Bailon Pascal等人，Bioconjugate Chem.2001，12，195-202)。然而，仍然要确定其是否可用于更复杂的活性成分，因为这些活性成分基于要被处理的蛋白质结构的外部修饰。另外，此类物质与蛋白质的共价键相当大地减小了被处理的激素或蛋白质的生物活性。

[0011] 改变半衰期的另一可选方法是天然存在于蛋白质或激素中的糖残基的添加或修饰(Perlman Signe等人，The Journal of Clinical Endocrinology.Metabolism 88(7)：3227-3235，2003)。此操作据称通过改变参与其降解的受体对其的识别来改变蛋白质。然而，鉴于存在于蛋白质中的糖基化作用的高免疫潜能，此改变的固有风险是显而易见的。

[0012] 第三线方法是获得嵌合蛋白，在该嵌合蛋白中，目的蛋白质的活性序列与具有较长半衰期的血浆蛋白的序列连接，例子如白蛋白或免疫球蛋白的片段(Dennis，Marks S.等人，The Journal of Biological Chemistry vol.277，No.38，Issue of September 20，35035-35043页，2002)。然而，此技术的主要缺点，除了与使患者接触天然并不存在的蛋白有关的预期免疫原性以外，在以此方式大幅度改变其结构后蛋白质的功效丧失。

[0013] 研究延长复杂活性成分的半衰期的另一可能性是产品与用PEG稳定的脂质体的共同给药。此技术基于活性成分与PEG的亲和性，其使蛋白和脂质体之间产生可逆的联系。此短暂的联系必须增加活性蛋白成分的半衰期，因为用PEG稳定的脂质体在循环中会停留很长时间。然而，在实践中不可能验证此假设，因为已经证明此系统在血友病患者中不能延长FVIII的半衰期(Powell J.S等人，Journal of Thrombosis and Haemostasis，6：277-283，2007)。

[0014] 迄今为止，以前所述的系统中没有一个能够显著地改变半衰期，而在提到的例外情况中，结构修饰和改变的导入使得其用于治疗人体病理学的应用不可行或非常复杂。

[0015] 已经对包封在可生物降解聚合微球中的治疗剂的控制释放进行了广泛的研究。可生物降解聚合物中活性成分的微囊化使得药物的释放可控。此方式最近已经应用于用于皮下应用的基于乳酸和乙醇酸的衍生物的控释制剂。这些制剂已经成功地用于大范围的活性成分的包封，包括，尤其是细胞抑制剂、抗炎剂、肽类和激素(Tamilvanan S.等人，PDA Journal ofPharmaceutical Science and Technology，vol.62，No.2，March-April 2008，125-154页)。

[0016] Pankaj(美国专利第5,417,982号)说明了使用乳酸和乙醇酸微球用于经口服给药的激素的控释。尽管Pankaj说明了获得注射产品的可能性，但鉴于此给药方法的要求，该发明不可能经静脉给药，并且无论如何，该发明都不会将海藻酸盐用于此目的。

[0017] Sivadas(Sivadas Neeraj 等 人，International Journal of Pharmaceutics358(2008)159-167页)说明了不同聚合物包括羟丙基纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、卵清蛋白和聚乳酸乙醇酸，用作包封蛋白质的载体用于蛋白质的吸入给药。

[0018] 使用乳酸和乙醇酸衍生物的一个缺点是需要在有机溶剂的存在下进行制备，这些溶剂中的一些具有已知的毒性，诸如聚乙烯醇，从而与保持诸如蛋白质和激素的复杂活性成分的生物活性不配伍。

[0019] 这些聚合物的应用也产生了高度疏水的颗粒，如下面所讨论的，它们通过细胞摄取机制迅速地从循环中被清除。另一个缺点是，释放活性成分时在其溶出时在颗粒周围建立了局部非常酸性的环境。这是因为聚合物在乳酸和乙醇酸中分解，在溶出时在颗粒周围建立了非常酸性的环境。正是这种酸性环境，可损坏敏感的活性成分，特别是具有不稳定的生物活性的具有复杂氨基酸结构的那些成分。

[0020] 通常海藻酸盐在食品和制药工业以及化学工业中具有许多应用。这种广泛的应用是由其水胶体特性所决定的，即，在水中使其自身水合以便形成粘稠溶液、分散体或凝胶的能力。此特征赋予海藻酸盐作为增稠剂、稳定剂、胶凝剂和成膜剂的独特特性。

[0021] 已经广泛地利用海藻酸盐的特性的一个领域是活性成分的包封，尤其是为了提高其溶解度，或为了协助药物经多种途径的给药( HanneHjorth等人，DrugDevelopment and Industrial Pharmacy，28(6)，621-630(2002))。鉴于海藻酸盐的粘膜粘附性，这些应用中使用了口服给药。还检验了皮下给药方法。然而由于此给药途径的严格要求，没有静脉应用史。

[0022] 例如，Benchabane(Benchabane，Samir 等人，Journal ofMicroencapsulation，September 2007；24(6)：pp.565-576)说明了通过“喷雾-干燥”将海藻酸盐用于白蛋白微胶囊的生产中以供口服给药。在类似的现有技术中，Coppi(Coppi，Gilberto等人，2001，Drug Development andIndustrial Pharmacy，27(5)，393-400页)说明了形成与钙和壳聚糖交联的微球用于蛋白质的口服给药。在两种情况下，海藻酸盐都用作蛋白质的保护剂以对抗在胃消化期间自然发生的蛋白降解。

[0023] 此外，Mladenovska(Mladenovska，K.，International Journal ofPharmaceutics342(2007)124-136页)说明了获得用于结肠给药的海藻酸盐/壳聚糖微粒。

[0024] Sivadas(Sivadas Neeraj 等 人，International Journal of Pharmaceutics358(2008)159-167页)还提到了海藻酸盐用作包封蛋白质的载体以用于蛋白质的吸入给药。

[0025] 除了活性成分的直接给药以外，海藻酸盐还被推荐用作用于施用复杂治疗剂型的载体。例如，在专利WO 2006/028996A2中，说明了海藻酸盐和Emulsan用于输送细菌毒素的解毒剂。

[0026] 另一实例是海藻酸盐用于包封多囊脂质体(Dai，Chuanyun等人，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces 47(2006)205-210页)或活细胞(欧洲专利，公开号：2159523)。在此例子中，施用活细胞的目的是将其应用于再生医学或基因治疗(WO2007/046719 A2；Peirone，Michael 等 人，J.Biomed.Mater.Res.42，587-596 页，1998；
García-Martín，Carmen 等 人，TheJournal of Gene Medicine，J Gene Med 2002；4：
215-223页)。奇怪的是，García-Martín(García-Martín，Carmen等人，The Journal of Gene Medicine，JGene Med 2002；4：215-223页)说明了施用遗传修饰的活细胞应用于治疗A型血友病的可能性，并举例说明了该问题的医学关联性。在此例子中，含有活细胞的海藻酸盐微胶囊通过导管导入被植入至腹膜内。在此例子中，治疗的目的和给药的方法(非静脉给药)与本发明根本不同。

[0027] 尽管聚合物在包封复杂活性成分诸如蛋白质的应用中有广泛的经验，但没有一篇文献可解决与这些产品的静脉给药有关的问题。如Wong等人所述(Wong，Joseph等人，Advanced Drug Delivery Reviews 60(2008)939-954页)，仅有三种已被批准的产品使用颗粒混悬液用于其静脉给药。它们中没有一个在其组成中使用海藻酸盐。在所有例子中，都没有寻求增加半衰期，而是改善产品的溶解度。

[0028] 有效地经静脉给予微粒的难度表现为(a)产品设计的基础方面，诸如颗粒的大小和分布，缺少有机溶剂，并且还有混悬液的同质性、粘度和“可注射性”-“可注射性”理解为便于产品的吸出和注射；(b)以工业规模生产和制备的技术方面，诸如剂量的一致性、在通过溶剂沉淀获得的产品中不需要的盐类结晶、产品的无菌和无热原；以及(c)生物学方面，诸如药代动力学和药效学曲线的非故意改变、生物分布的改变、聚合物的生物累积、吞噬细胞活化、毒性和栓塞的效果或补体的活化。

[0029] 在这方面，在开发这些产品中最明显的问题之一是其通过单核吞噬细胞系统(MPS)(以前称为网状内皮系统(RES))快速清除，该系统包括所有的来源于骨髓的单核细胞前体的细胞、外周血的单核细胞和各器官和组织的巨噬细胞或组织细胞。在后者中必须提到肝脏的枯否细胞和分布在脾脏和骨髓中的巨噬细胞，因为它们对于清除血浆中的微粒很重要(Passirane，Catherine等人，Pharmaceutical Research，Vol.15，No.7，1998，1046-1050页)。

[0030] 在静脉注射纳米微粒或微粒后，它们迅速地被血浆蛋白调理，对此已有广泛的描述。吸附在其表面的这些蛋白诱导MPS细胞的识别和摄取(Passirane，Catherine等人，Pharmaceutical Research，Vol.15，No.7，1998pp.1046-1050)。

[0031] 在脂质体中已经观察到类似的作用(Ishida，Tatsuhiro等人，Journal ofControlled Release 126(2008)162-165页)，其中已经说明了称为加速血液清除(ABC)的现象。在聚合微粒和脂质体两种情况下，调理现象都与补体系统的活化直接相关(Ishida，Tatsuhiro等人，Journal of Controlled Release 126(2008)，162-165页；Koide，Hiroyuki等 人，International Journal ofPharmaceutics 362(2008)，197-200页)。

[0032] 实际上，此吞噬现象不利于开发基于微粒的具有较长的半衰期的经静脉给药的药物，因为与包封有关的尺寸增加并不仅仅增加半衰期，而是有时引起降解加速。很显然，此现象仅借助于体内实验而观察到，涉及动物体内的药代动力学研究。

[0033] 经吞噬作用的清除和颗粒大小之间的关系在文献中已经有大量的记载。Champion(Champion，JA，Pharm Res.2008Aug；25(8)：1815-21.Epub2008Mar 29) 具 体地说明了聚合微粒所经历的吞噬作用和其大小之间的关系，观察到在2-3μm之间具有最大效应。在体内限制MPS摄取微粒的其他特征为颗粒的疏水性及其Zeta电位(Z电位 )(Szycher，Michael，HighPerformance Biomaterials：A Comprehensive Guide to Medical andPharmaceutical Applications，CRC Press 出 版，1991ISB 0877627754，
9780877627753，812页)。

[0034] Z电位是颗粒的一种特性。具体来说，通过从外相吸附离子或通过其自身表面上的官能团的离子化，分散颗粒趋于成为带电荷颗粒。这样的一种结果是在带负电荷的分散颗粒的环境中将与颗粒背对背地出现称为斯特恩层(Stern layer)的反离子层。在所述斯特恩层上出现扩散层，其特征是存在抵消颗粒的电荷的(两种符号的)流动电荷，其为到斯特恩层的距离的函数。我们称Z电位为反离子层和电动中性点之间的电位差。

[0035] Z电位值对于大部分分散系统的稳定性是至关重要的，因为后者将调节具有类似电荷的分散颗粒之间的排斥度，防止所述颗粒相互太接近以及防止由聚结现象引起的颗粒间吸引力成为优势。关于Z电位，已经公开(Szycher，Michael，High Performance Biomaterials：A Comprehensive Guideto Medical and Pharmaceutical Applications，CRC Press出版，1991 ISB0877627754，9780877627753，812页)部分负Z电位接近0会减弱吞噬作用。

[0036] 而且，疏水性还有助于颗粒的调理作用和摄取。这是特别令人感兴趣的，因为来源于聚乳酸和乙醇酸的颗粒是，例如，高度疏水的。

[0037] 达到延长微粒和脂质体在血浆中的半衰期的一种方式是将带电荷的聚合物导入至其表面上，该聚合物能够改变其电荷并产生亲水表面层以保护它们不被调理和吞噬。其中有，使用聚乙二醇(PEG)(Ishida，Tatsuhiro等人，Journal of Controlled Release 126(2008)162-165；Owens III，Donald E 等 人，International Journal of Pharmaceutics，volume 307，Issue 1，3 January2006，93-102页)或肝素(Passirane，Catherine等人，Pharmaceutical Research，Vol.15，No.7，1998，1046-1050页)。

[0038] 此方式很复杂，并使得药品的开发变得困难，因为系统的复杂性增加。另外，如前所讨论的，已经证明PEG-脂质体的使用在延长复杂蛋白诸如FVIII的半衰期方面是无效的(Powell J.S等人，2007，Journal of Thrombosisand Haemostasis，6：277-283页)。

[0039] 对于微粒，为了获得用于静脉给药的可行产品，有必要得到具有尺寸和Z电位的适当组合的亲水微粒。

[0040] Terrence(欧洲专利，公开号：2286040，欧洲申请号：00973477.3)说明了使用聚合物作为能够增加活性包封成分的半衰期的给药系统。为此目的，本发明需要使用(1)第一水溶性聚合物；(2)至少一种阴离子多糖作为第一络合剂和(3)二价阳离子作为第二络合剂。如已经观察到的，提到的发明在技术上很复杂并难以实际使用。相反，在本发明中，使用更为简单的颗粒达到了活性成分的控制释放，该颗粒涉及使用具有此应用所必需的所有特性的单一聚合物。此外，Terrence的发明没有证明该制剂的尺寸和静脉应用的相容性，或解释或说明如何避免细胞吞噬作用。

[0041] 不象具有PLA或PLGA的其他聚合物，海藻酸盐是亲水的。在本发明中产生的颗粒已经显示具有足以防止颗粒的聚集的部分负的Z电位，但足以提供很低的调理曲线的中性电位。

[0042] 可接受用于静脉给药的颗粒最大尺寸为5μm左右。这可通过现有的已注册药物来证明，这些使用标记用于超声波诊断的白蛋白的药物(Optison，数据表28)的平均粒径为3.0-4.5μm。

[0043] 海藻酸盐是生物相容的，并且鉴于其广泛用于食品工业，其已经广泛地用于人的口服给药。当作为非颗粒状聚合物静脉注射时，其以双相形式被清除，半衰期为4小时和22小时(Hagen，A.等人，European Journal ofPharmaceutical Sciences，Volume 4，Supplement 1，September 1996，100-100(1)页)，没有观察到不良反应。海藻酸盐经尿被清除。

[0044] 另外，海藻酸盐是水溶性聚合物这一事实有助于其与复杂蛋白的配伍，因为后者是其天然溶剂。

[0045] 本发明涉及一种组合物，包括海藻酸或其药学可接受的盐类的微粒，通过该微粒达到控制释放，并且增加经静脉给药的活性成分的半衰期，以及使应用次数减少，并在血液中达到更稳定的活性成分水平，由此潜在地减少一般由于定期输注活性成分而出现的其浓度的峰谷。

[0046] 本发明说明了具有下列组合的海藻酸盐的疏水微粒：其尺寸适于静脉输注且其物理化学特性适于避免该微粒被迅速吞噬，从而能够控制释放复杂的活性成分。

发明内容

[0047] 由于其物理化学和生物化学特性，海藻酸及其盐类(海藻酸铵、海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠和海藻酸丙二醇酯)是在活性成分的包封中最常用和研究最多的聚合物之一。它们是天然来源、从海藻或细菌商业化产生的多糖。

[0048] 海藻酸盐是海藻酸的盐类，是由两种单体单元，β-(1-4)-D-甘露糖醛酸(M)和α-(1-4)-L-谷洛糖醛酸(G)组成的线性多糖。它们分为形成多种序列的嵌段，最常见的为G、M和MG。

[0049] 在多价阳离子如钙(Ca++)的存在下，在形成海藻酸盐的延伸网络的连续G嵌段之间形成强键。钙离子作为桥位于具有带负电荷的谷洛糖醛酸的基团之间。

[0050] 在一些制剂中，它们经常伴随着其他多糖诸如壳聚糖。壳聚糖是一种由随机分布的β-(1-4)D-氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(乙酰单位)组成的线性多糖。

[0051] 在一些海藻酸盐制剂中可使用白蛋白作为带电荷物质，优选无菌和无热原的人白蛋白，其还可用作制造过程中活性成分的保护剂或用作产品的长期保存期间的稳定剂。

[0052] 其在血浆中的释放要被改变的活性成分可以是复杂的和不稳定的活性成分。更具体地，活性成分的特征是显示生物活性。此生物活性可通过酶活性、转运、与配体的分子相互作用或结合来表现。在两种情况下活性成分的问题是对制造的能量条件不稳定或敏感，其中尤其是温度、压力和/或非极性环境，因为小的结构变化可导致生物活性的不可逆丧失。

[0053] 作为具有生物活性的活性成分，可列举人肽类激素诸如褪黑激素、5-羟色胺、甲状腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原和血管紧张素、加压素、心房肽、降钙素、促红细胞生成素、卵泡刺激素胰高血糖素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素类生长因子(或生长介素)、黄体生成素、黑色素细胞刺激素、催产素、催乳素、血小板生成素、神经肽Y、组胺、以及其衍生物。

[0054] 其他实例可以是生物活性蛋白，尤其是诸如白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、α-2-巨球蛋白、抗凝血酶、结合珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、纤溶酶原、纤维蛋白原、补体蛋白、凝血因子和免疫球蛋白。

[0055] 这些活性成分是生物活性的事实使得由于微小结构损害造成它们特别容易可能丧失功能性。此种结构损害可与温度、压力、介质的极性、渗透压、氧的存在、搅拌等有关。

[0056] 就此而言，在这些活性成分中凝血因子VIII非常突出，因为它极度不稳定。由于其结构复杂性，其非常难以充分地稳定FVIII的生物活性，尤其是其纯化形式。例如，Parti R等人(Haemophilia 2000；6：513-522)说明了在大于40℃的温度下，甚至冻干形式的FVIII的生物活性都开始受到损害。当FVIII在溶液中时，这种不稳定性最为突出，甚至在25℃下就观察到不稳定性的迹象。对于IX因子和VIIa因子，对于外界因素诸如温度的敏感性也是公知的。

[0057] 就此而言，必需注意，采用的制造工艺要获得具有FVIII的生物活性的治疗制剂。这意味着该方法可应用于显示难以稳定的生物活性的活性成分，并且因此，本发明可应用于与FVIII一样不稳定的成分。通过扩展，本发明可应用于比FVIII更稳定的成分。因此，凝血因子是可从如本发明中所述的制剂的应用中获益的活性成分的明显实施例。

[0058] 在本发明中，包括在聚合物微球中的活性成分因此可以是显示生物活性的肽、蛋白或激素。优选地，活性成分是凝血因子，且更优选地，活性成分是VIII因子、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、由VIII因子和血管性血友病因子形成的复合体、IX因子或VIIa因子。

[0059] 这些成分可以是人、动物、重组或转基因来源的。在后一种情况下，合成分子可以是天然分子的复制或可被有意地修饰。

[0060] 获得组合物

[0061] 微囊化是一种用不同特性的材料包被分子、固体颗粒或液体球以产生微米尺寸的微粒的方法。由此技术方法获得的产品被称为微粒、微胶囊或微球。

[0062] 有几种微囊化技术：

[0063] -通过化学方法的微囊化：

[0064] ·界面聚合法

[0065] -通过物理化学法的微囊化：

[0066] ·蒸发溶剂

[0067] ·凝聚法

[0068] ·凝胶化

[0069] ·螯合

[0070] ·形成囊泡

[0071] -通过机械方法的微囊化：

[0072] ·挤出

[0073] ·共挤出

[0074] ·喷雾干燥

[0075] ·喷雾冷冻

[0076] 选择用于制造本发明中描述的微粒的技术是喷雾干燥，该方法记载在Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteins withinalginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′s University，Kingston，Canada]。此制造技术的特征是单阶段，且微粒作为终产物获得。

[0077] 包括本发明的用于控制释放活性成分的海藻酸或其盐类的微粒的用于静脉给药的生物相容组合物的制造工艺的特征在于以下的阶段：

[0078] -喷雾，其中含有活性成分和聚合物的溶液/混悬液/乳液通过喷嘴被泵出，并且以液滴的形式分散，

[0079] -在干燥室中干燥，在此处热空气促进溶剂从液滴蒸发，以及

[0080] -收集被包封的产物。

[0081] 此方法在140～180℃的温度下进行，供应流速为35～40m3/h，注射流速为3.5～5ml/min且压力为4～6psi。

[0082] 在这些条件下能够获得尺寸小于或等于5μm，优选1-4.5μm并保持活性成分的活性的颗粒。另外，可在喷雾阶段前任选的乳液匀化工艺中改进颗粒的平均尺寸。此附加的匀化工艺借助于压力，例如1500～2000psi来进行。

[0083] 通过喷雾干燥包封活性成分是一个连续工艺，其中溶液或乳液被脱水，在工艺结束时回收由微粒形成的固体。

[0084] 为此，含有活性成分的液体以预定的注射流速被机械驱动至喷嘴或旋转盘，从中其以数百万个非常小的液滴进行喷雾。液滴的大小在很大程度上由使液体形成喷雾的气体的压力来决定。此工艺在密闭室中进行，在该密闭室中控制的气，通常为空气的气流以预定的吸入速率并在可控温度下连续循环。

[0085] 作为喷雾的结果，液体极大地增加了其与空气的接触表面积，使得当面对干燥空气流时，液体溶剂，通常为水迅速蒸发。由于改变状态需要热量，因此此迅速蒸发使每个小液滴内部冷却。以此方式能够进行快速干燥，同时尽量减小对活性成分的热休克。完成该工艺后，产物以固体形式被收集。

[0086] 组合物的说明

[0087] 获得的微粒通过测定其颗粒平均粒径、其Z电位和生物活性来区分。颗粒的尺寸使用Beckman Coulter LS13320装置通过激光衍射来测定。

[0088] 由于有静脉给药的问题，需要颗粒尺寸小于或等于5μm，优选1～4.5μm，因为较大的颗粒尺寸会导致血栓形成。

[0089] Z电位使用Malvern Zetasizer装置测定，Z电位是控制混悬液中颗粒的相互作用的重要参数之一。其通过颗粒表面和分散介质的特性来确定。在此情况下，最佳值为-30mV以上，因为此值确保颗粒之间的斥力并确保没有凝聚物。已经显示具有接近0，优选-30mV～0的Z电位的微粒具有很低的肝脏摄取和细胞清除水平。(Szycher，Michael，High PerformanceBiomaterials：A Comprehensive Guide to Medical and PharmaceuticalApplications，CRC Press出版，1991ISB 0877627754，9780877627753，812页)。

[0090] 组合物的应用

[0091] 修饰释放或控制释放的药物形式以下列方式设计：相对于以相同方式给药的常规释放的药物形式，改变活性物质释放的速率和/或位置。

[0092] 在本发明中，已经观察到显示生物活性的活性成分诸如蛋白(更具体地，凝血因子)的包封如何在体内和体外释放模型中实现控制释放。由于VIII因子的结构复杂性，其对于外界因素极度敏感而著名。实际上，甚至将FVIII冷冻在其天然基质-人血浆中，仍会导致生物活性的部分损失(Bravo，M.I.等人，Pharmeuropa Scientific Notes，2006-1，1-5页)。

[0093] 因此当本发明中所述的含有人FVIII的微粒置于环境非常类似于人血浆的连续流动室中时，与未包封产品相比，已经观察到介质中FVIII的释放有延迟。

[0094] 类似地，在兔中静脉给予本发明的含FVIII微粒，与常规产品相比，使FVIII在血浆中的半衰期始终显著地延长。此外，在可能指示有与所述制剂相关的毒性作用的动物中没有观察到不良反应。

[0095] 体内药代动力学数据非常明显，因为毫无疑问地证实MPS的调理作用和加速摄取已经被本发明的制剂适当地解决了。

[0096] 本发明可用于治疗需要静脉给予复杂成分的各种病理状况，这些病理状况可包括，例如，出血障碍和凝血障碍、激素紊乱等。在这些情况下，将实现半衰期的显著延长，例如对于FVIII，可包括减少用于维持一线预防治疗方案的给药次数，例如，每周一次给药。

[0097] 可能存在的与使用亲水聚合物有关的缺点可以是，在产品悬浮在给药水性载体，例如，无热原和无菌注射用水中的时间和静脉输注时刻之间的时段期间微粒的部分溶出。此类缺点可使用，例如，部分无极性的生物聚合物溶液，诸如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、异丙叉甘油、甘油缩甲醛或丙酮(Mottu F等人，Journal of Pharmaceutical Science&Technology 2000Vol.54，No.6，
456-469)作为本发明中所述的微粒的重悬浮和给药载体来克服。

[0098] 例如，本发明可以包装在真空或惰性气氛中的脱水或冻干产品的形式来产生，使得能够在不同的温度条件下，例如，在2℃～40℃之间，具有长期稳定性。由此保存的产品可在用溶剂配制后经静脉给药，溶剂可以是注射用水，或盐水溶液，或具有下列可变含量的混合物或盐水溶液，例如0.5％～50％的生物相容溶剂诸如，例如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、异丙叉甘油、甘油缩甲醛或丙酮。

[0099] 本发明的有益效果

[0100] 本发明说明了具有下列组合的海藻酸盐的亲水微粒的产生：该微粒具有适于静脉输注的尺寸以及适于防止其迅速吞噬的物理化学特性，使得复杂活性成分的半衰期延长。

[0101] 海藻酸盐是生物相容的，并经尿清除，并且与任意已知的毒性作用无关。由于具有此特性，本发明与蛋白和复杂活性成分的给药是可配伍的。

[0102] 本发明可克服造成可控静脉给药系统不实用的所有缺陷，由此减少了治疗所需的给药次数，而静脉使用的活性成分没有变化。就此而言，需注意，本发明不需要在氨基酸序列、糖基化作用或导入合成衍生物这些方面对活性成分作任何的修饰。

附图说明

[0103] 图1显示了BATCH 9和BATCH 1的体外释放试验的结果的比较图。

[0104] 图2显示了在给予未包封的FVIII后和在应用本发明的组合物后在兔血浆中人FVIII:C的药代动力学。

[0105] 图3显示了在给予未包封的FVIII后和在应用本发明的组合物后在兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学。

具体实施方式

[0106] 实施例1

[0107] 微粒的制备

[0108] 如 Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteinswithin alginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′sUniversity，Kingston，Canada]中的记载使用喷雾干燥工艺生产海藻酸盐微粒。基本上，通过产生具有所选择的聚合物和活性成分的乳液来制备微粒。

[0109] 使用Büchi小型喷雾干燥仪B-290装置在下列条件下对样品进行喷雾：喷雾温度：3
140℃-180℃，吸入速率：35-40m/h，注射流速：3.5-5ml/min，且压力为4-6psi。

[0110] 实施例2

[0111] 微粒的说明

[0112] 表1、2和3说明了在制造微粒中使用的原料和其特性，包括尺寸、Z电位和收率。使用的制造工艺和条件如实施例1中所述。

[0113] 表1：FVIII微粒(血浆FVIII)的说明

[0114]批次 聚合物 平均粒径(μm) Z电位(mV)
第1批次
海藻酸钠 3.6 -32
FVIII
第2批次
海藻酸钠 4.5 -32
FVIII
第3批次
海藻酸钠 4.7 -31
FVIII

[0115] FVIII活性/FVIII抗原比给出了指定样品中活性蛋白的比例的概念。以此方式，如果我们将初始样品中的活性/抗原比与包封样品的活性/抗原比进行比较，则我们可计算微囊化后仍然具有功能的活性成分的比例。在实施例中，我们发现在包封工艺期间的活性收率，以与初始活性收率相比的百分比表示，对于第1批次、第2批次和第3批次分别为57.6％、33.9％和35.7％。

[0116] 表2：FIX微粒(血浆FIX)的说明

[0117]批次 聚合物 平均粒径(μm) Z电位(mV)
第4批次
海藻酸钠 4.9 -63
FIX
第5批次
海藻酸钠 4.5 -18
FIX
第6批次
海藻酸钠 4.9 -10
FIX

[0118] 在此例子中，我们发现在所有所述批次中，在第4批次、第5批次和第6批次中包封工艺期间的活性收率为100％。

[0119] 表3：rFVIII微粒(重组rFVIII)和rFVIIa(重组rFVIIa)的说明

[0120]批次 聚合物 平均粒径(μm) Z电位(mV)
第7批次
海藻酸钠 4.7 -70
rFVIII
第8批次
海藻酸钠 4.9 -64
rFVIIa

[0121] 在重组来源的蛋白的情况下，对于第7批次和第8批次，包封工艺期间测定的活性收率分别为25％和71％。

[0122] 在所有批次中，使用Beckman Coulter LS 13320装置通过衍射激光测定颗粒尺寸，并且使用Malvern Zetasizer装置测定Z电位。

[0123] FVIII的生物活性通过缺陷性血浆凝血试验或通过生色作用评价FXa的生成来测定。对于FVIIa和FIX，分别通过评价无FVII和FIX的血浆的凝血时间(部分活化凝血活酶时间)来测定生物活性。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的免疫检测方法分别使用针对FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特异性抗体测定蛋白浓度。

[0124] 指示指定样品中活性蛋白的比例的活性/抗原比通过获得样品中具体活性成分的活性和抗原单位之间的商来计算。通过估计起始样品和最终的包封产品的活性/抗原比之间的变化百分比来计算活性/抗原收率。

[0125] 如在所有例子中所见，平均粒径小于或等于5μm，且Z电位为负。活性/抗原收率的结果还表明工艺期间生物活性得到保持。

[0126] 各表显示控制释放系统适用于不同的活性成分。

[0127] 实施例3

[0128] 体外释放试验

[0129] 在Sotax CE1装置中在闭合回路中采用连续流动室进行控制释放试验以评价活性成分的释放。

[0130] 在37℃的温度下使用含有1％人白蛋白的咪唑缓冲液(pH 7.3)作为溶解介质进行试验，流速为7-25ml/min。在不同的时刻(5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟和240分钟)提取代表性样品用于分析。用相同体积的新鲜介质替换提取的样品的体积以便纠正体积的损失。

[0131] FVIII的生物活性通过缺陷性血浆凝血试验或通过生色作用评价FXa的生成来测定。对于FVIIa和FIX，分别通过评价无FVII和FIX的血浆的凝血时间(部分活化凝血活酶时间)来测定生物活性。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的免疫检测方法分别使用针对FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特异性抗体测定蛋白浓度。

[0132] 测试完成后获得下列的结果：

[0133] 表4.未包封的冻干FVIII(第9批次)的体外释放试验

[0134]

[0135] 表5.FVIII纳米颗粒(第1批次)的体外释放试验

[0136]

[0137] 我们可看到与未包封产品相比，应用于活性成分的微粒的组合物改变了产品的释放动力学。

[0138] 实施例4

[0139] VIII因子在动物中的药代动力学

[0140] 为了评价在体内组合物对活性成分的释放的作用，对兔进行药代动力学试验。为此，50IU/kg剂量的来自第9批次的人FVIII(未包封)经静脉给予三只雌性新西兰白兔。类似地，50IU/kg剂量的来自如实施例1所述和根据实施例2所述制造的第1批次的包封FVIII经静脉给予另外三只雌性新西兰白兔。在不同的时间，获取血浆样品进行分析以检测人FVIII:C的存在，如表6中所述。在选择性免疫俘获人FVIII分子后通过生色作用检测人FVIII。这样可使融合的人FVIII的活性与兔FVIII的活性区分开。

[0141] 表6.在给予未包封FVIII后和应用本发明的组合物后兔血浆中人FVIII:C的药代动力学

[0142]

[0143] 从结果我们可以看出组合物延迟了活性成分在血浆中的释放。另外，这些结果证明不管其大小如何，都不存在将微粒从循环中迅速清除的细胞机制(肝脏、脾脏或巨噬细胞)。

[0144] 使用用于此目的的适当软件(WinNonlin 5.2)分析此数据，使我们能够计算表7中详述的药代动力学常数。

[0145] 表7.在给予未包封FVIII后和应用本发明的组合物后兔血浆中人FVIII:C的药代动力学参数

[0146]

[0147] 实施例5

[0148] 动物中血管性血友病因子的药代动力学

[0149] 在第9批次制剂(未包封FVIII)和第1批次制剂(包封FVIII)两种情况下，FVIII的血浆来源具有显著含量的血管性血友病因子(VWF)。这意味着VWF的包封与FVIII的包封同时发生。对此，可独立地研究它们的行为。为此，我们继续通过评价兔血浆中人VWF抗原(VWF:Ag)的存在来单独地分析VWF药代动力学。结果显示在表8中。

[0150] 表8.在给予未包封VWF后和应用本发明的组合物后兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学

[0151]

[0152] 从结果我们可以看出组合物延迟了活性成分在血浆中的释放。另外，这些结果证明不管其大小如何，都不存在将微粒从循环中迅速清除的细胞机制(肝脏、脾脏或巨噬细胞)。

[0153] 使用用于此目的的适当软件(WinNonlin 5.2)分析此数据，使我们能够计算表9中详述的药代动力学常数。

[0154] 表9.在给予未包封FVIII/VWF后和应用本发明的组合物后兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学参数

[0155]

[0156] 可观察到，活性成分(在此例子中为VWF)的包封明显地延长了其半衰期。

[0157] 尽管本发明已经对于优选实施方式的实施例进行了说明，但这些实施例不应被认为是对本发明的限制，本发明由下列权利要求的较宽释义来限定。