一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种诱导分化细胞的方法。具体涉及一种胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法。更具体地，本发明涉及小鼠胚胎干细胞体外经细胞因子和丁酸钠联合诱导高效分化为肝细胞的新方法。本发明方法经试验结果显示，其分化效率高达74％，分化效率高于现有技术文献报道的单纯以细胞因子为主或单纯以丁酸钠的诱导方法。

权利要求

1.一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法，其特征是采用细胞因子与丁酸钠联合诱导小鼠ES细胞向肝细胞分化，包括下述步骤：

1)ES细胞体外培养：采用Es细胞培养基：无饲养层高糖DMEM培养基，其中添加10％胎牛血清、10U/L白血病抑制因子(LIF)、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1mmol/L谷氨酰胺和非必需氨基酸，ES细胞复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁培养，每1-2d用0.25％胰酶消化并传代；

2)诱导ESC向肝细胞分化：首先培养液中加50-150ng/ml人ActivinA的去除LIF的上述培养液培养3天得限制性内胚层细胞，然后在培养液中加20-40ng/ml人aFGF，与2-3mM丁酸钠联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入20-60ng/mlHGF诱导因子继续诱导成熟培养5天，最后以10-30ng/mlOSM；0.1-0.4μM Dex继续培养成熟肝细胞5天；

3)肝细胞标志检测

包括观察分化细胞的形态，免疫荧光检测白蛋白、甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达，检测特异基因mRNA的表达，肝细胞功能检测及肝细胞分化效率的检测。

2.按权利要求1所述的体外诱导、分化胚胎干细胞的方法，其特征是所述的诱导ESC向肝细胞分化步骤中，所述的人ActivinA为100ng/ml；人aFGF为30ng/ml；丁酸钠为2.5mM。

说明书

一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明属生物技术领域，涉及一种诱导分化细胞的方法。具体涉及一种胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法。更具体地，本发明涉及小鼠胚胎干细胞体外经细胞因子和丁酸钠联合诱导高效分化为肝细胞的新方法。

背景技术

[0002] 自从1998年Thomson等报道了人胚胎干细胞(embryonic stemcell，ESC)建株以来，ESC的研究引起了本领域研究人员的关注。由于ESC是从早期哺乳动物胚胎或原始生殖细胞中分离的具有自我复制能力和发育全能性的多潜能细胞系，在一定条件下可定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，因此，其作为细胞组织和器官移植新资源的价值旋即受到研究者的高度重视。研究表明，ESC在先天性肝病、代谢性肝病的治疗中具有广阔的应用前景，但如何建立优化的诱导体系使ESC向肝细胞方向分化，则仍是目前研究的难点。

[0003] 诱导细胞分化的方法主要有3种：加细胞因子干预、共培养和转基因。以外源因子激活干细胞中某些组织特异的沉默基因，使细胞内的信号传导网络发生改变，或通过转基因强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型式，从而诱导干细胞向特定类型组织细胞定向分化。然而，由于目前对ESC诱导分化过程中基因激活与沉默的机制以及胚层、组织和细胞间的信息网络所知甚少，因此，寻找新的有效诱导分化剂和诱导方法，建立优化的诱导体系使ESC向肝细胞定向分化实属必要。

[0004] 研究揭示了ES细胞向肝细胞分化要经历从内胚层、胚肝到成熟肝脏等多个时期，其中涉及复杂的基因调控过程。表观遗传修饰(epigenetic modification)是细胞内调控基因沉默与激活的一个重要机制，它通过引起染色质和核小体构型改变来调控基因转录，而不涉及基因本身序列的改变。干细胞的多能性与其胞内广泛的表观遗传特征密切相关，而运用表观遗传修饰策略诱导干细胞分化成为该领域的新的研究方向。

[0005] 组蛋白乙酰化和去乙酰化是一个重要表观遗传修饰方式。通常组蛋白乙酰化激活基因转录，去乙酰化则导致基因沉默，它们分别受多种组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶控制。

[0006] 丁酸钠是一种四碳短链脂肪酸一丁酸的盐类，可通过抑制组蛋白去乙酰化酶使组蛋白超乙酰化，激活细胞内特异的沉默基因，从而引起细胞分化。有研究表明，丁酸钠可诱导大鼠胎肝干细胞和人肝癌细胞向成熟肝细胞分化。迄今为止，ESC诱导分化为内胚层细胞尤其是肝细胞成功的报道很少。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种体外诱导、分化胚胎干细胞的方法，具体涉及一种胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法。更具体地，本发明涉及小鼠胚胎干细胞体外经细胞因子和丁酸钠联合诱导高效分化为肝细胞的方法。

[0008] 本发明采用细胞因子与丁酸钠联合诱导小鼠ES细胞向肝细胞分化，包括下述步骤：

[0009] 1.ES细胞体外培养：采用Es细胞培养基：无饲养层高糖DMEM培养基，ES细胞复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁培养，每1-2d用0.25％胰酶消化并传代；

[0010] 2.诱导ESC向肝细胞分化：首先培养液中加人ActivinA的去除LIF的上述培养液培养3天得限制性内胚层细胞，然后在培养液中加人aFGF，与丁酸钠，联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入HGF，(hepatocyte growth factor，HGF)等诱导因子继续诱导成熟培养5天，最后以OSM；Dex继续培养成熟肝细胞5天。

[0011] 所述的人ActivinA为50-150ng/ml，优选100ng/ml；所述的人aFGF为20-40ng/ml，优选30ng/ml；所述的丁酸钠为2-3mM，优选2.5mM；再加入的HGF为20-60ng/ml；所述的OSM为10-30ng/ml，Dex为0.1-0.4μM。

[0012] 3.肝细胞标志检测

[0013] 包括观察分化细胞的形态，免疫荧光检测白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)的表达，检测特异基因mRNA的表达，肝细胞功能检测及肝细胞分化效率的检测。

[0014] 本发明实验显示，在联合诱导中2.5mmol/L丁酸钠浓度为最适合小鼠El4 ES细胞向肝细胞分化，浓度过低则分化效率低下，过高引起绝大多数细胞凋亡。

[0015] 本发明采用细胞因子与丁酸钠联合诱导小鼠ES细胞向肝细胞分化，其分化效率高达74％，分化效率高于现有技术文献报道的单纯以细胞因子为主或单纯以丁酸钠的诱导方法。

附图说明

[0016] 图1是本发明诱导方法流程图

[0017] 其 中，ActivinA 100ng/ml；aFGF 30ng/ml；HGF 20ng/ml；Sodiumbutyrate2.5mM；OSM 10ng/ml；Dex 0.1μM。

[0018] 图2是丁酸钠诱导分化后的细胞形态。

[0019] 图3是免疫荧光检测诱导分化第18d的蛋白表达结果。

[0020] 图4是特异基因mRNA的表达情况。

[0021] 图5显示诱导18d后，大量多边形肝细胞样细胞呈红色，表明细胞有糖原合成和贮存功能。

[0022] 图6显示诱导18d后，ICG阳性的肝细胞样细胞集落形成，细胞形态大多呈多边形。

[0023] 图7是肝细胞分化效率的检测结果。

具体实施方式

[0024] 实施例1

[0025] 1.ES细胞体外培养：材料小鼠El4 ES细胞系购自美国威斯康辛大学干细胞研究中心。Es细胞培养基：无饲养层高糖DMEM培养基，其中添加10％胎牛血清、10U/L白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor。LIF)、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1mmol/L谷氨酰胺、非必需氨基酸等。ES细胞复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁培养，每1-2d用0.25％胰酶消化并传代。

[0026] 2.诱导ESC向肝细胞分化：首先培养液中加人ActivinA 50ng/ml的去除LIF的上述培养液培养3天得到限制性内胚层细胞，然后在培养液中加人aFGF 20ng/ml与丁酸钠2mM联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入HGF 20ng/ml(hepatocyte growth factor，HGF)等诱导因子继续诱导成熟培养5天。最后以OSM 10ng/ml；Dex 0.1μM继续培养成熟肝细胞5天。对照组只加细胞因子或只加Sodium butyrate诱导，自发分化组做阴性对照组不加上述因子，仅用去除L1F的培养液培养以让其自发分化。

[0027] 3.肝细胞标志检测

[0028] 细胞形态观察：用倒置相差显微镜观察分化细胞的形态，丁酸钠诱导分化第12d，可见EBs向四周辐射状散开的细胞部分呈集落生长，呈索状或铺路石样改变，细胞体积变大，多角形或类圆形，核浆比例大，部分出现双核或三核，呈现肝细胞样细胞的形态。而未加细胞因子和丁酸钠的对照组，则以混杂细胞为主，可见多量成纤维样细胞(如图2)。

[0029] 免疫荧光检测：诱导分化第18d，行免疫荧光染色检测白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)的表达。结果显示，联合诱导分化组AFP、ALB、CK18均为阳性，发红色或绿色荧光，但AFP阳性细胞数少。

[0030] 特异基因mRNA的表达：诱导分化第6d起，RT-PCR检测到AAT、TTR在mRNA水平的表达；第12d检测到AFP、ALB、TAT的表达；到分化第18d，6种肝细胞特异标志物均有表达。对照组正常小鼠肝脏细胞6种标志物均有表达。

[0031] 肝细胞功能检测：肝脏是进行糖原合成及糖异生的器官，PAS染色可使细胞内碳水化合物特异性着色为红色。结果显示，诱导18d后，大量多边形肝细胞样细胞呈红色，表明细胞有糖原合成和贮存功能。ICG的代谢与肝细胞基底细胞膜有机阴离子转运系统有关，其受体是肝细胞特异性的，所以ICG的摄取能力通常用作肝细胞特异性的功能标志。诱导18d后，可见ICG阳性的肝细胞样细胞集落形成，细胞形态大多呈多边形。

[0032] 肝细胞分化效率的检测结果显示，分化第18d诱导组白蛋白阳性细胞百分数由Image-Pro Plus software统计，得到诱导组肝细胞分化率约为74.7％±4.9％。同法计算单纯细胞因子诱导分化组，肝细胞分化率约为66.3％±7.1％。单纯以丁酸钠诱导分化组，肝细胞分化率约为44.5％±6.5％。自发分化组肝细胞分化率约为11.1％±2.9％。

[0033] 实施例2

[0034] 1.ES细胞体外培养：同实施例1.

[0035] 2.诱导ESC向肝细胞分化：培养液中加人ActivinA 150ng/ml的去除LIF的上述培养液培养3天得到限制性内胚层细胞。然后在培养液中加人aFGF 40ng/ml与丁酸钠3mM联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入HGF 60ng/ml(hepatocyte growth factor，HGF)等诱导因子继续诱导成熟培养5天。最后以OSM 30ng/ml；Dex 0.4μM继续培养成熟肝细胞5天。对照组只加细胞因子或只加Sodium butyrate诱导，自发分化组做阴性对照组不加上述因子，仅用去除L1F的培养液培养以让其自发分化。

[0036] 3.肝细胞标志检测方法与结果同实施例1。

[0037] 实施例3

[0038] 1.ES细胞体外培养：同实施例1.

[0039] 2.诱导ESC向肝细胞分化：首先培养液中加人ActivinA 100ng/ml的去除LIF的上述培养液培养3天得到限制性内胚层细胞。然后在培养液中加人aFGF 30ng/ml与丁酸钠2.5mM联合诱导5天以向肝细胞方向分化，再加入HGF 20ng/ml等诱导因子继续诱导成熟培养5天。最后以OSM 10ng/ml；Dex 0.1μM继续培养成熟肝细胞5天。对照组只加细胞因子或只加Sodium butyrate诱导，自发分化组做阴性对照组不加上述因子，仅用去除L1F的培养液培养以让其自发分化。

[0040] 3.肝细胞标志检测方法与结果同实施例1。