一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法

摘要

本发明公开了一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，其步骤是：A、样品的处理：经2％纤维素酶(0.65mol/LNaCl配制)和20mg/ml蛋白酶K处理后，于液氮、沸水浴中循环处理；B、PCR体系：将处理后的菌液加入PCR反应体系中进行PCR扩增；C、PCR产物的检测：对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。本发明方法简便，操作方便，避免了传统曲霉菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，并省去了DNA抽提步骤，克服了现有技术中因污染而影响检测结果的不足。

权利要求

1. 一种非疾病诊断目的的聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，包括以下步骤：

A.将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁；

B.加入1％TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放；

C.取经过步骤A和步骤B处理过的样品3μL～15μL模板，加入PCR反应体系中，用曲霉菌通用引物进行聚合酶链式反应扩增；

D.对扩增后的DNA样品进行0.8％～1％琼脂糖凝胶电泳，在与所用引物相应的预期条带范围内检测到扩增条带，即可确定样品中含有曲霉菌或确定菌种；

以上步骤A所述的将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁的具体方法是：取待检样品，放入离心管中，按待检样品的重量g与2％纤维素酶的体积ml比为1∶2～6的比例加入2％纤维素酶，于37℃放置1～3小时，按待检样品的重量g与浓度为20mg/ml蛋白酶K的体积ml比为1∶0.2～0.6的比例加入浓度为20mg/ml蛋白酶K，于55℃放置1～2小时；

以上步骤B所述的加入1％TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放的具体方法是：加入1％TritonX-100，将该离心管放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻

1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10min；

以上步骤C所述的将经过步骤A和步骤B处理过的待检样品直接作为模板，用曲霉菌通用引物进行聚合酶链式反应扩增的具体方法是：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，

55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃延伸10分钟。

2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，其特征在于所述的聚合酶链式反应反应液的体系是25uL。

说明书

一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚合酶链式反应用于检测曲霉菌的方法。

背景技术

[0002] 聚合酶链式反应(PCR)是一种快速简便的体外合成核酸的方法，在医学和生物学中得到了广泛的应用。常用的PCR检测曲霉菌的方法需要提取待检样品的基因组DNA，然后取适量的DNA作为模板，再进行相应的聚合酶链式反应。由于曲霉菌的细胞壁富含多糖(主要由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖等组成)，使得一般的酶类不能很好消化去壁、释放DNA。目前使用的常规方法的技术路线是：利用液体培养基培养曲霉菌，收集菌丝，用液氮研磨破碎细胞壁，再用提取液提取DNA，定量分析确定提取的DNA浓度，取适量的DNA作为模板进行PCR扩增。目前使用的常规的曲霉菌DNA提取方法耗时长、工作量大，操作过程中易打断基因组DNA，且容易交叉污染，不适宜大批量标本的快速分析。在一些利用已知序列开展的分子鉴定、系统进化、抗药性等曲霉菌研究中，往往一次需要检测很多种样品，用常规方法提取基因组DNA更显得费时费力且成本高。因此，建立一种快速简便的曲霉菌PCR检测方法十分必要。

发明内容

[0003] 本发明的任务是提供一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，使其具有操作简便、快速、不受污染、灵敏度高等特点，快速、简便，且实验结果重复性好、特异性高，准确可靠。避免了传统曲霉菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，省去了DNA抽提步骤，并克服了现有技术中存在的因容易受到污染而影响检测结果的不足，目的在于创建一种快速简便的聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法。

[0004] 实现本发明的技术方案是：

[0005] 本发明提供的这种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，包括以下步骤：

[0006] A.将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁；

[0007] B.加入1％TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放；

[0008] C.取经过步骤A和步骤B处理过的样品3μl～15μl直接作为模板，加入PCR反应体系中，用曲霉菌通用引物或曲霉菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增；

[0009] D.对扩增后的DNA样品进行0.8％～1％琼脂糖凝胶电泳，在与所用引物相应的预期条带范围内检测到扩真增条带，即可确定样品中含有曲霉菌或确定菌种。

[0010] 上述步骤A所述的将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁的具体方法是：取待检样品，放入离心管中，按待检样品的重量g与2％纤维素酶的体积ml比为1∶2～6的比例加入2％纤维素酶，于37℃放置1～3小时，按待检样品的重量g与浓度为20mg/ml蛋白酶K的体积ml比为1∶0.2～0.6的比例加入浓度为20mg/ml蛋白酶K，于55℃放置1～2小时；

[0011] 上述步骤B所述的加入1％TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放的具体方法是：加入1％TritonX-100，将该离心管放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻
1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10min；

[0012] 上述步骤C所述的将经过步骤A和步骤B处理过的待检样品直接作为模板，用曲霉菌通用引物或曲霉菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增的具体方法是：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃延伸10分钟；

[0013] 本发明方法中聚合酶链式反应反应液的体系是25uL。

[0014] 实验资料

[0015] 1、曲霉菌菌丝的处理

[0016] 取曲霉菌菌丝于离心管中，加入2～6ml/g的2％纤维素酶(用浓度为0.65mol/L的NaCl配制)，37℃烘箱处理3小时，然后加入0.2～0.6ml/g的20mg/ml蛋白酶K，55℃水浴2小时后，加入1％TritonX-100，将该离心管放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10min。将混合液直接作为模板用于PCR反应。

[0017] 2、处理后的曲霉菌直接作为模板的聚合酶链式反应

[0018] 取处理后的菌液3μl作为模板加入PCR反应体系中进行PCR扩增。

[0019] 按照已有的常规PCR扩增程序，设定如下：

[0020] 首先模板94℃变性4分钟；接着35个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟。

[0021] 最后72℃延伸10分钟。

[0022] PCR产物的检测：

[0023] 对扩增后的DNA样品使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检查扩增条带，并用传统方法提取的曲霉菌DNA扩增产物作为对照，以检测该方法进行扩增反应的可行性。

[0024] 所述PCR体系参见各种商业聚合酶说明书，以FERMENTAS(MBI)公司Taq酶为例，PCR体系的组成为：

[0025]Taq酶 1U
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTP底物(2mM) 2.5μL
Mg2+(25mM) 1.5μL
引物1(0.4uM) 1μL
引物2(0.4uM) 1μL
菌液 3μL
ddH2O 补足总体积为25μL

[0026] 所述的聚合酶链式反应(PCR)体系包括脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合酶、模板DNA和缓冲液，聚合酶链式反应反应液的总体积是25μL。

[0027] 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

[0028] 处理曲霉菌后，直接取溶液替代提取待测基因组DNA作为PCR反应的模板，避免了传统的曲霉菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，省去了DNA抽提步骤。在曲霉菌菌种的鉴定中，大大缩短了检测时间(本发明方法检测时间约为4-5小时，而传统方法则需要6-8小时)、大幅度降低了试验成本，减少了污染的可能性。本方法不仅快速、简便，且实验结果重复性好、特异性高，准确可靠。

附图说明

[0029] 图1为以本发明方法检测黑曲霉的PCR扩增图，图1中：M为DL2000Marker，第一道为用本发明方法处理后的黑曲霉菌丝溶液直接进行PCR扩增的产物，第二道为阳性对照，即用常规方法提取黑曲霉DNA的扩增产物，第三道为阴性对照，第四道为空白对照。

[0030] 图2为不同浓度黑曲霉菌丝溶液的PCR扩增图，图2中：M为DL2000 Marker，第一道至第四道分别为取0.004g、0.01g、0.04g、0.07g菌丝处理后进行PCR反应的结果，第五道为阳性对照，可见第一道无条带，即没有DNA释放，第二、三道条带较淡，第四道条带清晰，表示随着菌丝量的增多，释放的DNA增多，扩增条带更加清晰，当菌丝量高于0.01g即可扩增出产物。

具体实施方式

[0031] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

[0032] 实施例：

[0033] 一、黑曲霉的处理

[0034] 1、标准黑曲霉菌株接种察氏培养基37℃培养3天，挑取菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡过夜，收集菌丝。称取0.05g菌丝于1.5ml塑料离心管中，加入200uL 2％纤维素酶(0.65mo l/LNaCl配制)，37℃烘箱处理3小时后，加入20uL 20mg/ml蛋白酶K，55℃水浴2小时后，加入1％TritonX-100。将该离心管放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10min。

[0035] 2、标准黑曲霉菌株接种察氏培养基37℃培养3天，挑取菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡过夜，收集菌丝。依次称取0.004g、0.01g、0.04g、0.07g菌丝于4个1.5ml塑料离心管中，分别加入16μL、40μL、160μL、280μL的2％纤维素酶(0.65mol/LNaCl配制)，37℃烘箱处理3小时后，再分别加入1.6uL、4uL、16uL、28uL的20mg/ml蛋白酶K，55℃水浴
2小时后，加入1％TritonX-100。将离心管放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1min，插入沸水中1min，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10min。

[0036] 二、用处理的黑曲霉菌丝溶液直接作为模板的PCR反应

[0037] 取菌液3μl直接作为PCR反应的模板。挑取0.05g念珠菌进行相同处理，作为阴性对照。同时，作为阳性对照，按常规方法提取黑曲霉基因组DNA，即收集菌丝，液氮研磨，CTAB法抽提DNA，作为PCR反应的模板。(提取黑曲霉基因组DNA的具体方法参见：杨艳秋，王丽，贺丹等.真菌DNA提取方法的建立和比较.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(50)：10093-10096.)

[0038] PCR反应使用的引物为曲霉菌通用引物：

[0039] Asp-F：CTGTCCGAGCGTCATTG；

[0040] Asp-R：TCCTCCGCTTATTGATAT。

[0041] 曲霉菌扩增带大小约为240～251bp左右，其中黑曲霉扩增带大小为243bp。(参见：Schabereiter-Gurtner C，Selitsch B，Rotter ML，et al.Developmentof Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation ofEleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in ClinicalSpecimens.J Clin Microbiol，2007，45(3)：906-914.)

[0042] 其他条件如前所述。

[0043] 具体扩增结果见图1：M为DL2000 Marker，第一道为用本发明方法处理后的黑曲霉菌丝溶液直接进行PCR扩增的产物，第二道为阳性对照，即用常规方法提取黑曲霉DNA的扩增产物，第三道为阴性对照，第四道为空白对照。PCR检测分析结果显示，本发明方法和常规方法进行PCR反应的结果完全一致，扩增条带清晰可见，得到了预期的约240bp的产物，说明所检测的溶液中含有黑曲霉DNA。

[0044] 图2为不同浓度黑曲霉菌丝溶液的PCR扩增图，图2中：M为DL2000 Marker，第一道至第四道分别为取0.004g、0.01g、0.04g、0.07g菌丝处理后进行PCR反应的结果，第五道为阳性对照，可见第一道无条带，即没有DNA释放，第二、三道条带较淡，第四道条带清晰，表示随着菌丝量的增多，释放的DNA增多，扩增条带更加清晰，当菌丝量高于0.01g即可扩增出产物，而用传统的研磨-CTAB法检测至少需要0.05g-0.1g菌丝，说明本发明方法比现有技术的灵敏度高。