薄叶山橙素甲,其药物组合物及其制备方法和用途

摘要

提供由式(I)所示的抗肿瘤活性成分薄叶山橙素甲(melotenineA)类似物，其制备方法及医药用途。

权利要求

1.式(I)所示的单萜吲哚生物碱或其药用盐，1

其中R 选自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；

2 3 3

R 选自氢或COOR，其中R 选自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基；

4

Y代表任选被1-5个R 取代的C2-10亚烷基、C2-10亚烯基、、C2-10亚炔基或C2-10次炔基；

4

R 选自氢、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基。

2.如权利要求1所述的单萜吲哚生物碱或其药用盐，其中Y代表C2-4亚烷基、C2-4亚烯4

基，R 选自氢或C1-4烷基。

3

3.如权利要求2所述的单萜吲哚生物碱或其药用盐，其中Y代表C4亚烯基，R 选自氢或甲基。

4.如权利要求3所述的单萜吲哚生物碱或其药用盐，其中Y代表：

5.如权利要求4所述的单萜吲哚生物碱或其药用盐，其是薄叶山橙素甲：

6.如权利要求1-5所述的药用盐，是指药学上可接受的盐。

7.如权利要求1-5所述的药用盐，是与有机酸或者无机酸形成的盐。

8.如权利要求1-5所述的药用盐，是与酒石酸或柠檬酸或甲酸或乙二酸或盐酸或硫酸或磷酸形成的盐。

9.如权利要求1式(I)所示的单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)式(II)化合物与PhSeCH2CHO反应得到式(III)化合物：其中R1、R2的含义与权利要求1相同；

(2)式(III)化合物与式(IV)化合物反应得到式(V)化合物：其中L为离去基团，Y与权利要求1的含义相同；

(3)式(V)化合物环合得到式(I)化合物：

10.如权利要求9的制备方法，其中式(IV)化合物的结构为：4

其中X代表任选被1-5个R 取代的C1-4亚烷基、C2-4亚烯基或C2-4亚炔基，L为离去基4

团，R 与权利要求1的含义相同。

11.一种制备薄叶山橙素甲的方法，包括以下步骤：取植物薄叶山橙，用水或有机溶剂提取，所得提取物通过酸碱处理除去非生物碱类物质，用400g，200-300目硅胶进行柱层析，划分为7段Frs 1-7，用石油醚/丙酮梯度洗脱分段，分配比例为：1∶0，15∶1，10∶1，

6∶1，3∶1，1∶1，0∶1，Fr1用石油醚/丙酮＝12/1为洗脱剂，分离得到式(I)所示的单萜吲哚生物碱薄叶山橙素甲。

12.如权利要求11的制备方法，所述的提取是在回流的温度下进行的，所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂或醚类溶剂，其中所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇，所述的酮类溶剂选自丙酮、丁酮、甲基异丁基酮，所述的酯类溶剂选自乙酸乙酯。

13.药物组合物，其中含有权利要求1-6的式(I)化合物或其药用盐作为有效成分，并含有至少一种可药用载体。

14.权利要求1-6的式(I)化合物或其药用盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用。

15.权利要求1-6的式(I)化合物或其药用盐在制备治疗或预防肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的药物中的应用。

说明书

薄叶山橙素甲，其药物组合物及其制备方法和用途

[0001] 技术领域：本发明属于药物技术领域，具体地，涉及新颖骨架的单萜吲哚生物碱类化合物薄叶山橙素甲(melotenineA)及其有机和无机酸盐，以其为药物有效成分的药物组合物，其制备方法以及它们在制备治疗或预防癌症药物中的应用。

[0002] 背景技术：肿瘤是世界难题。在中国每年新增160万肿瘤病患者，每年有130万肿瘤病患者死亡。目前临床上使用的化疗药物虽然有一定疗效，但因其毒性大而给病人带来巨大的肉体痛苦和精神压力，新的疗效确切且毒副作用相对较小的抗肿瘤药物的发现迫在眉睫。薄叶山橙素甲(melotenine A)是源于天然植物中的新化合物。此前没有关于此化合物的结构以及药用活性报道。

[0003] 发明内容：本发明的目的在于：提供单萜吲哚生物碱类化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)及其类似物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐；其制备方法；其作为有效成分与可药用载体或赋形剂组成的药物组合物；以及化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)类似物及其药用盐在制备预防或治疗肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的药物中的用途。

[0004] 本发明的上述目的是通过如下的技术方案得以实现的：

[0005] 式(I)所示的单萜吲哚类化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)类似物或其药用盐

[0006]

[0007] 其中：

[0008] R1选自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基，优选的R1为C1-6烷基，更优选的R1为甲基；

[0009] R2选自氢或COOR3，其中R3选自C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基，优选的R2为COOCH3；

[0010] Y代表任选被1-5个R4取代的C2-10亚烷基、C2-10次烷基、C2-10亚烯基、C2-10次烯基、C2-10亚炔基或C2-10次炔基；优选的Y代表任选被C1-6烷基取代的C2-6亚烷基、C2-6次烷基、C2-6亚烯基或C2-6次烯基，更优选的Y代表任选被C1-6烷基取代的C2-4亚烷基、C2-4次烷基、C2-4亚烯基或C2-4次烯基，最优选的Y代表

[0011]

[0012] R4选自氢、C1-10烷基、C2-10烯基或C2-10炔基。

[0013] 最优选的式(I)单萜吲哚类化合物是薄叶山橙素甲：

[0014]

[0015] 所述的药用盐是指药学上可接受的盐，包括但不限于与有机酸，或无机酸形成的盐。所述的有机酸包括但不限于酒石酸或柠檬酸或甲酸或乙二酸，无机酸包括但不限于盐酸或硫酸或磷酸。

[0016] 本发明的另一方面提供如式(I)所示的单萜吲哚类化合物的制备方法，包括以下步骤：

[0017] (1)式(II)化合物与PhSeCH2CHO反应得到式(III)化合物：

[0018]

[0019] 其中R1、R2的含义与权利要求1相同；

[0020] (2)式(III)化合物与式(IV)化合物反应得到式(V)化合物：

[0021]

[0022] 其中L为离去基团，Y与权利要求1的含义相同；

[0023] (3)式(V)化合物环合得到式(I)化合物：

[0024]

[0025] 在此方法中，式(IV)化合物的结构优选为：

[0026]

[0027] 其中X代表任选被1-5个R4取代的C1-4亚烷基、C2-4亚烯基或C2-4亚炔基，L为离4
去基团，R 与权利要求1的含义相同；

[0028] 在优选的方法中，式(III)化合物与式(IV-1)或式(IV-2)反应得到式(V-1)或式(V-2)，再环合得到式(I-1)或式(I-2)化合物：

[0029]

[0030] 本发明的最优选化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)还可按如下步骤制备：取植物薄叶山橙，用水或有机溶剂提取，所得提取物通过酸碱处理除去非生物碱类物质，利用硅胶柱层析分离得到式(I)所示的单萜吲哚生物碱薄叶山橙素甲(melotenine A)。所述的提取是在回流的温度下进行的，所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂或醚类溶剂，其中所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇，所述的酮类溶剂选自丙酮、丁酮、甲基异丁基酮，所述的酯类溶剂选自乙酸乙酯。所述的酸碱处理可以是：向提取物中加入酸例如盐酸或硫酸调节pH值至1.0-3.0，用有机溶剂例如乙酸乙酯萃取1-4次，水层用碱例如氨水或氢氧化钠或碳酸钠等调节pH值至8.0-10.0，再用乙酸乙酯萃取1-4次，合并浓缩乙酸乙酯萃取物。

[0031] 具体的方法为：取植物薄叶山橙全株，经干燥、粉碎后，用醇提取1-4次，每次1-4小时，得醇浸膏，然后通过酸碱处理，除去非生物碱类物质，在碱性条件下用有机溶剂萃取，浓缩有机溶剂提取层，浸膏利用硅胶柱层析，用石油醚/丙酮做为洗脱系统分离得到式(I)所示的化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)。

[0032] 更具体的方法为：取风干后的薄叶山橙植物全株，用90％乙醇70℃加热，回流提取3次，回收溶剂，浓缩到小体积，加入5％HCl调节pH值至2，用乙酸乙酯萃取3次，水层用10％氨水调节pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯层，乙酸乙酯部分用硅胶拌样后，进行200-300目硅胶柱层析，划分为7段Frs 1-7，用石油醚/丙酮梯度洗脱分段，分配比例为氯仿/甲醇1∶0，15∶1，10∶1，6∶1，3∶1，1∶1，0∶1，Fr1用石油醚/丙酮＝12/1为洗脱剂，硅胶100g柱层析分离得薄叶山橙素甲(melotenineA)。

[0033] 本发明的薄叶山橙提取物含有式(I)所示的薄叶山橙素甲(melotenine A)或其药用盐10-95％(重量)可按如下步骤制备：取植物薄叶山橙，用有机溶剂提取，所得提取物通过酸碱处理除去非生物碱类物质，利用硅胶柱层析进一步分离纯化。所述的提取是在回流的温度下进行的，有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂或醚类溶剂，其中醇类溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇，酮类溶剂选自丙酮、丁酮、甲基异丁基酮，酯类溶剂选自乙酸乙酯。酸碱处理是指：向提取物中加入酸例如盐酸或硫酸调节pH值至1.0-3.0，用有机溶剂例如乙酸乙酯萃取1-4次，水层用碱例如氨水或氢氧化钠或碳酸钠等调节pH值至8.0-10.0，再用乙酸乙酯萃取1-4次，合并浓缩乙酸乙酯萃取物。

[0034] 药物组合物，其中含有权利要求1的式(I)化合物或其药用盐作为有效成分，并含有常规药用载体。

[0035] 式(I)化合物或其药用盐在治疗或预防癌症药物中的应用。

[0036] 式(I)化合物或其药用盐在制备治疗肝癌、白血病、胰腺癌、乳腺癌及肺癌的药物中的应用。

[0037] 本发明的化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)类似物或其盐可经口或不经过口给药，给药量因药物不同而各有不同，对成人来说，每天1-1000mg比较合适。

[0038] 本说明书中，术语“烷基“是指饱和的直链或支链的脂族烃基，优选具有1-10个碳原子，更优选具有1-6个碳原子，更优选具有1-4个碳。代表性的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基等。

[0039] 术语“烯基”是指具有至少一个碳碳双键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，更优选具有2-4个碳。代表性的例子包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊二烯基等。

[0040] 术语“炔基”是指具有至少一个碳碳三键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，更优选具有2-4个碳。代表性的例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

[0041] 本说明书中，亚基是指相应的基团与其它结构通过两个单键连接的方式相连，例如亚乙基为-CH2CH2-，亚乙烯基为-CH＝CH-；次基是指相应的基团与其它结构通过一个单键和一个双键连接的方式相连，例如次甲基为-CH＝。

[0042] 经口服给药时，首先使化合物与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。具体实施方式：

[0043] 下面的试验实施例、实施例和制剂实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0044] 试验实施例1：

[0045] 本发明化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)具有明显的抗肿瘤活性，实验方法和结果如下：

[0046] 一、材料与方法：

[0047] 1.样品及制备：

[0048] 样品呈无色，二甲基亚砜(DMSO)溶解配制为10mg/ml浓度的贮存液避光保存备用。

[0049] 2.细胞株：

[0050] SK-BR-3，人乳腺癌细胞株

[0051] SMMC7721，人肝癌细胞株

[0052] HL-60，人白血病细胞株

[0053] PANC-1，人胰腺癌细胞株

[0054] A549，人肺癌细胞株

[0055] 3.实验方法：

[0056] (1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁细胞提前12小时接种培养。

[0057] (2)加入待测化合物溶液(化合物单体固定浓度40uM初筛，粗提物100ug/ml初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200ul，每种处理均设3个复孔。

[0058] (3)显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液100ul以避免细胞丢失，每孔加20％的SDS100ul，过夜孵育(温度37℃)，使结晶物充分融解。

[0059] (4)比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC50值。

[0060] (5)阳性对照：顺铂

[0061] 二、结果：

[0062] 表1.薄叶山橙素甲(melotenine A)对人肿瘤细胞株生长的半数抑制浓度(IC50，μM)

[0063]

[0064] 三、结论：

[0065] 在本实验条件下，化合物薄叶山橙素甲(melotenine A)对以上包括人乳腺癌细胞株(SK-BR-3)，人肝癌细胞株(SMMC7721)，人白血病细胞株(HL-60)，人胰腺癌细胞株(PANC-1)，人肺癌细胞株(A549)生长的半数抑制浓度(IC50)在0.9-10.7μM之间，化合物D、G对以上肿瘤株的生长的半数抑制浓度(IC50)在1.7-25.9μM之间，依据中国医药工业杂志1993，24：455-457，周建军等提出的评价抗肿瘤物质活性的改良MTT法得出结论：上述数据显示了明显的抑制癌症的作用。

[0066] 实施例1：

[0067] 风干后的14kg植物全株薄叶山橙(Melodinus henryi Craib)用90％乙醇加热(70℃)回流提取3次，回收溶剂，浓缩到小体积，加入5％HCl调节pH值至2，用乙酸乙酯萃取3次，水层用10％氨水调节pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯层后称重得17g。乙酸乙酯部分用适量硅胶拌样后，进行硅胶柱层析(400g，200-300目，青岛海洋化工厂)划分为7段(Frs 1-6)，用石油醚/丙酮梯度洗脱分段(分配比例：1∶0，15∶1，10∶1，6∶1，3∶1，1∶1，0∶1)。Fr1(1.8g)用石油醚/丙酮＝12/1为洗脱剂，硅胶
100g柱层析分离得薄叶山橙素甲(melotenine A)。

[0068] 薄叶山橙素甲(melotenine A)的化学结构式为：

[0069]

[0070] 分子量334，分子式C21H22N2O2。旋光：[α]25D＝-136.5°(c 0.20，CHCl3)。无色晶体。易溶于氯仿，丙酮，甲醇等有机溶剂。

[0071] 薄叶山橙素甲(melotenine A)的结构是基于它的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱而确定。

[0072] 紫外光谱数据：UVλ(max)(MeOH)：328(3.92)，298(3.82)，265(4.21)，221(4.64)nm

[0073] 红外光谱数据：IR v(max)(KBr)：3440，2948，1680，1610，1436，1244[0074] 质谱数据：HR-ESI-MS(m/z)：335.1772[M+H]+

[0075] 1H NMR和13C NMR数据见表2。

[0076] 以上数据结合2D NMR分析证实了薄叶山橙素甲(melotenine A)的化学结构为式(II)所示。

[0077] 表2.薄叶山橙素甲(melotenine A)的1H NMR和13C NMR数据(CDCl3)[0078]

[0079] 实施例2

[0080] 按实施例1的方法先制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的硫酸乙醇溶液， 过滤，干燥，制成硫酸薄叶山橙素甲(melotenine A)。

[0081] 实施例3：

[0082] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的盐酸酸溶液，过滤，干燥，制成盐酸薄叶山橙素甲(melotenineA)。

[0083] 实施例4：

[0084] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的磷酸酸溶液，过滤，干燥，制成磷酸薄叶山橙素甲(melotenineA)。

[0085] 实施例5：

[0086] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A))，加入4％的酒石酸溶液，过滤，干燥，制成薄叶山橙素甲(melotenineA)。

[0087] 实施例6：

[0088] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的柠檬酸溶液，过滤，干燥，制成柠檬酸薄叶山橙素甲(melotenine A)。

[0089] 实施例7：

[0090] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的甲酸溶液，过滤，干燥，制成甲酸薄叶山橙素甲(melotenineA)。

[0091] 实施例8：

[0092] 按实施例1的方法制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，加入4％的乙二酸溶液，过滤，干燥，制成乙二酸薄叶山橙素甲(melotenine A)。

[0093] 实施例9

[0094] 薄叶山橙素甲类似物的制备

[0095]

[0096] 实施例10

[0097] 薄叶山橙素甲类似物的制备

[0098]

[0099] 制剂实施例1：

[0100] 按实施例1-10的方法先制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

[0101] 制剂实施例2：

[0102] 按实施例1-10的方法先制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

[0103] 制剂实施例3：

[0104] 将所分离得到薄叶山橙素甲(melotenine A)，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

[0105] 制剂实施例4：

[0106] 按实施例1-10的方法先制得薄叶山橙素甲(melotenine A)，以及利用有机酸(酒