中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列、构建方法及其氨基酸序列和用途

摘要

本发明公开了一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列，其特征在于，为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明林蛙核糖核酸酶介导的肿瘤细胞凝集和对肿瘤细胞的选择性杀伤作用与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否无关，并且不产生基因的变异，其稳定性较之现有技术更好。在长期的抑瘤实验中可以看出，本发明Rd-RNase3基因重组融合蛋白在极低浓度下对肿瘤细胞具有很强大的杀伤作用，但对正常细胞无杀伤性，因此在制备抗肿瘤药物方面较之现有基因药物存在很大的优势。

权利要求

1.一种中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3，其特征在于，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3所编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3的构建方法，其特征在于，其具体步骤为：提取出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引物，进行PCR扩增，产物电泳，所述的基因特异性引物为序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸，为正反引物对：正向引物N275：TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C反向引物C715：CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR初步鉴定目标基因后，测序。

4.根据权利要求3所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3的构建方法，其特征在于，所述进行PCR扩增步骤的PCR反应体系及参数：基因组DNA、dNTPs、H2O、10×Taq Buffer、Taq DNA Polymerase和基因特异性引物至总体积50μl，混合均匀；

扩增条件为：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

5.根据权利要求3所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3的构建方法，其特征在于，所述与质粒连接的具体步骤为：(1)目标DNA片断、载体、T4 DNA Ligase、10×T4 DNA Ligase Buffer至总体积10μl；

(2)16℃连接10～12小时制备成连接好目标基因的载体；

(3)对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物1μl、dNTPs、10×Taq Buffer

5μ1、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物各10pmol，补无菌超纯水至总体积50μl，混合均匀；PCR扩增条件：94℃30s，48℃ 30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束；

(4)2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。

6.根据权利要求3所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3的构建方法，其特征在于，所述转移到细胞的具体步骤为：(1)将5μl目标基因与质粒连接的产物加入到100μl感受态细胞中，混匀，冰浴

30min；

(2)42℃水浴中热激90s；取出后立即置于冰浴2min；

(3)加入500μl提前37℃预热好的不含抗生素的LB培养基，37℃，150rpm摇床培养

45min；

(4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养16h；

(5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床

37℃、180rpm培养12h。

7.根据权利要求3所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNase3的构建方法，其特征在于，所述PCR初步鉴定目标基因步骤的PCR反应体系及参数为：提取的重组质粒、dNTPs、10×Taq Buffer、H2O、Taq DNA Polymerase和引物至总体积

20μl，混合均匀；

PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

8.一种权利要求1所述的中国林蛙(Rana dybowskii)功能基因Rd-RNa7se3在制备治疗抗卵巢癌药物中的应用。

说明书

中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列、构建方法及其氨基酸

序列和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中国林蛙功能序列及其编码的蛋白序列，具体地说是一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列及其编码的氨基酸序列和其用途。

背景技术

[0002] 全世界每年新诊断的癌症病例达1亿，每10万人中250人死于癌症，因此战胜癌症是现代医药最重大的挑战之一。尽管外科手术可以治愈可切除的癌症，不可切除的癌症只能采用化学治疗或放射治疗。常规药物用于治疗存在的主要问题是，缺乏选择性，毒性强烈及外来蛋白的免疫原性，经常会导致副反应，如暂时性腹泻、恶心、脱发、易感染。有时会对心、肺、肾、骨髓产生长期影响。

[0003] 大多数降解DNA的药物所导致的凋亡与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否关系密切，在p53缺失的情况下，降解DNA的药物对肿瘤无效。目前人类的大部分肿瘤(尤其是实质性肿瘤)都能通过变异使p53失活，或产生p53抗体。而且，导致DNA损伤的药物往往能够使正常细胞产生基因变异。

[0004] 因此需要开发毒性适度的、人类具有免疫耐受性的药物来解决这些问题。

[0005] RNases能够降解RNA引起细胞死亡，被认为是一种毒素。活细胞大约含有20种外切和内切核糖核酸酶，把RNA处理为成熟形式并调控RNA转录。RNase参与RNA代谢、细胞成熟、细胞生理死亡、促进血管生成，而且发挥抵御RNA病毒的宿主防御功能。

[0006] 当外源RNases进入细胞，它们可能通过降解RNA、削弱蛋白生物合成、引起凋亡而杀死细胞。

[0007] 实际上，已经发现多种核糖核酸酶在体外实验中具有细胞毒性，但在体内实验中却毫无毒性。该家族的典型代表是牛胰腺核糖核酸酶(RNase A)，由于受到哺乳动物体内普遍存在的核糖核酸酶抑制剂(RI)的作用，不具备抗肿瘤作用。而从牛精液中发现的天然二聚体形式的核糖核酸酶(BS-RNase)，尽管与RNase A的氨基酸序列相似性高达80％，但是不受RI的抑制作用，在体内外实验中均显示出强大的选择性地抗肿瘤作用。BS-RNase不仅作用于肿瘤细胞，还具有胚胎毒性，精子生成抑制，免疫抑制活性。EDN和ECP是来源于嗜酸性粒细胞的核糖核酸酶A超家族成员，尽管序列相似，但是具有不同的功能。EDN具有抗病毒功能，而ECP主要表现出强大的杀菌、杀寄生虫的功能。从家鸡(Gallus gallus)白细胞中分离到两种核糖核酸酶RNases A-1和A-2，二者具有81％氨基酸序列相同，二者都与人血浆核糖核酸酶抑制剂(hRI)相互作用。RNases A-2同时具有血管生成活性和杀菌作用，RNases A-1没有这两种活性。目前的研究发现，核糖核酸酶A超家族成员是一组快速进化的蛋白家族，不同的物种中核糖核酸酶序列的微小差异导致功能的显著变化。

[0008] 目前文献报道的蛙类核糖核酸酶抗肿瘤的研究，仅局限于豹蛙、牛蛙和日本稻田蛙。不同蛙物种核糖核酸酶的氨基酸序列不同，结构的差异导致功能不同。

[0009] 在两栖动物蛙属中，最早被鉴定的核糖核酸酶是Onconase，是1991年Ardelt等从R.pipiens卵中基于其抗肿瘤作用而分离的蛋白。Onconase完整氨基酸顺序的阐明，揭示出其属于核糖核酸酶A超家族。另外三种核糖核酸酶从蛙的卵和肝被鉴定：牛蛙Rana catesbeiana(蛙卵rc-RNase，蛙肝rc-L1)日本稻田蛙Ranajaponica(蛙卵rj-lec)。1998年Huang等首先分离出编码蛙核糖核酸酶的cDNA，发现mRNA仅在雌蛙的肝脏表达，最终合成的蛋白定位于蛙卵细胞中。2000年Liao等从蛙卵黄颗粒提取物和肝中分离出
5个编码牛蛙R.catesbeiana核糖核酸酶的cDNA序列(rc-01编码rc-L1，rc-02，rc-03，rc-04，rc-06)，2000年Chen等从r.pipiens中发现了性别特异性的细胞毒性核糖核酸酶(rp-rap)。2001年Rosenberg等以牛蛙Rana catesbeiana基因组DNA为模板，采用PCR得到了五个新的蛙核糖核酸酶基因顺序(rc-203，rc-204，rc-208，rc-212，rc-218)。表明来源于蛙属的核糖核酸酶基因通过正向选择快速分化的方式进化，暗示了这个独特的蛋白家族可能具有新的生理功能。

[0010] 以核糖核酸酶A为代表的大多数嘧啶碱基特异性核糖核酸酶具有四个分子内的二硫键，而且其位置非常保守。蛙蛋白保留了核糖核酸酶A四个二硫键中的三个，在靠近C端出现一个新的二硫键。尽管与RNase A具有相似的三维结构，来源于两栖动物的RNases在体外实验中不受人RI抑制，这归因于其与RNase A的序列相似性低。进化地位更低的鱼类却受到RI抑制。

[0011] 从豹蛙中分离出的核糖核酸酶Onconase是通过内化进入细胞引起细胞毒性。已经发现Onconase能减小动物体内肿瘤的大小，能增强几种化学治疗剂的细胞毒功效。但是，Onconase还具有胚胎毒性，抑制精子生成、免疫抑制活性及肾毒性。Onconase作为治疗不能手术的恶性间皮瘤的抗肿瘤药进入临床三期实验。

[0012] 从日本稻田蛙的卵中分离出一种具有凝集活性的核糖核酸酶jSBL，可优先凝集大量的各种人类和动物的肿瘤细胞，而不是正常的红细胞，淋巴细胞，或成纤维细胞。从牛蛙卵中也分离出具有凝集各种肿瘤细胞作用的核糖核酸酶cSBL。具有凝集活性的核糖核酸酶可识别大量的各种肿瘤细胞的细胞表面糖蛋白特征的具体组织结构和方向，这无疑对于人类癌症提供了一个重要的基础诊断和治疗。

[0013] cSBL和jSBL蛋白对体内的多种癌细胞均表现出细胞毒性，其中cSBL已被证明是一种在体外也非常有效用的化疗药物。在一项有关的实验研究中，研究人员将肿瘤细胞注入小鼠腹膜内腔，24小时后开始每天按一定剂量对其中部分小鼠进行治疗。研究结果表明，被治疗小鼠的存活时间显著高于未被治疗小鼠的存活时间。

[0014] 对cSBL进行的研究显示，cSBL的酶活性不受人类RNase酶抑制因子的抑制，它们一旦进入细胞中，其降解肿瘤细胞RNA、杀死癌细胞的作用能很好地发挥，有利于作为抗癌药物应用。

[0015] 蛙具有独特的嘧啶碱基特异性的核糖核酸酶，结构相似于乌龟、蜥蜴、鸡的核糖核酸酶。但是来源于蜥蜴的核糖核酸酶没有发现细胞毒性。尽管进行了大量的研究，然而，并非所有的实验结果都一致。抗肿瘤主要问题：免疫原性、细胞毒性的选择性、稳定性。

发明内容

[0016] 本发明的目的在于补充现有技术的不足而提出一种中国林蛙Onconase样功能基因Rd-RNase3序列。

[0017] 本发明另一目的在于提出一种上述中国林蛙Onconase样功能基因Rd-RNase3序列的构建方法。

[0018] 本发明的又一目的在于提出上述中国林蛙Onconase样功能基因Rd-RNase3序列的氨基酸序列及由该氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的且与该氨基酸序列功能相同的氨基酸衍生序列。

[0019] 本发明的再一目的在于提出一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的用途。

[0020] 为实现上述目的，本发明的发明思路为：

[0021] Onconase的抗肿瘤作用机制是基于其内化进入肿瘤细胞，降解RNA，抑制蛋白质的合成，诱导肿瘤细胞凋亡。处于对数生长期的细胞在Onconase药物作用24h后，细胞增殖停止，而对处于停滞期的细胞没有作用。这可能与细胞识别有关，在药物作用剂量下，Onconase只作用于肿瘤细胞，而对正常生长细胞没有影响。除了与化学药物不同的作用靶点外，提高肿瘤细胞氧压、使抗性细胞恢复对药物的敏感性是Onconase使实体瘤减小的另一因素，也是与其它药物协同作用原因。在实体瘤中，细胞间流体压力的增大往往导致抗肿瘤药物的输送障碍：Onconase诱导肿瘤微血管压力升高，血液流动加快，使肿瘤血管氧化压力显著增高。因此它可能成为新的放射增强剂，关于它辐射反应的体内研究已获得许可。本发明从中国林蛙的基因组中克隆编码Onconase样核糖核酸酶成熟蛋白的基因，找到具有Onconase样抗肿瘤活性的核糖核酸酶，作为制备治疗肿瘤生物药物的应用。本发明是以中国林蛙DNA中制备一种新的Onconase样基因序列Rd-RNase3，以其为基础作为制备新型、高效的抗肿瘤功能生物药物的应用，具有重要的医药开发应用价值。本发明采用的具体技术方案为：

[0022] 一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列，其为序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体如下：

[0023] 成熟蛋白编码区基因序列

[0024] caagactgga aaacatttca gaagaaacac ctgacaaaca cccggaatat taaatgtgat 60[0025] aaaatcatgc caataaactt gttccactgc aagtacagga acacatttat ctattcacgt 120[0026] cctcgtggag tggaaaacct ctgtagagga aaaataaatg ccacaaatgt gtcaagtagt 180[0027] tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaa aaatccaggc cttgcaagta taaattaaag 240[0028] aaacaaacta atgtaatttg tataacatgt gagcataaag ttccagtaca ttttgtcggt 300[0029] gtcggaagtt gc 312[0030] 一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列，其为序列表中SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列，具体如下：

[0031] 由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列

[0032] Gln Asp Trp Lys Thr Phe Gln Lys Lys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn[0033] 1 5 10 15[0034] Ile Lys Cys Asp Lys Ile Met Pro Ile Asn Leu Phe His Cys Lys Tyr[0035] 20 25 30

[0036] Arg Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys[0037] 35 40 45

[0038] Arg Gly Lys Ile Asn Ala Thr Asn Val Ser Ser Ser Ser Lys Phe Ala[0039] 50 55 60

[0040] Leu Phe Glu Cys Ile Glu Lys Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys[0041] 65 70 75 80[0042] Lys Gln Thr Asn Val Ile Cys Ile Thr Cys Glu His Lys Val Pro Val[0043] 85 90 95[0044] His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys

[0045] 100

[0046] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的衍生序列，其是由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的且与序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。

[0047] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的构建方法，其具体步骤为：提取出中国林蛙的基因组DNA，设计基因特异性引物，进行PCR扩增，产物电泳，所述的基因特异性引物为序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，为正反引物对：

[0048] 正向引物N275：TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C

[0049] 反向引物C715：CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC

[0050] 从电泳胶中回收目标DNA片段，与质粒连接，转移到细胞，提取质粒，PCR初步鉴定目标基因后，测序。

[0051] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的构建方法，其中，所述PCR反应体系及参数：

[0052] 基因组模板100ng、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNAPolymerase3U和引物(N275，C715)各30pmol、补无菌超纯水至总体积为50μl，混合均匀；

[0053] 扩增条件为：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

[0054] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列氨基酸序列的构建方法，其中，所述与质粒连接的具体步骤为：

[0055] (1)目标DNA片断(20ng)、pGM-T载体(50ng)、T4DNA Ligase 3U、10×T4DNA Ligase Buffer 1μl，补无菌超纯水至总体积10μl；

[0056] (2)16℃连接10～12小时制备成连接好载体的基因；

[0057] (3)对步骤(2)连接好的样品进行PCR检测；连接产物1μl、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNA Polymerase 3U和质粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，补无菌超纯水至总体积50μl，混合均匀；PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束；

[0058] (4)2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测，紫外分析仪中，观察DNA条带。

[0059] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列构建方法，其中，所述转移到细胞的具体步骤为：

[0060] (1)将5μl(50ng)目标基因与质粒连接的产物(重组质粒pGM-RNase3)加入到100μl感受态细胞DH5α中，混匀，冰浴30min；

[0061] (2)42℃水浴中热激90s；取出后立即置于冰浴2min；

[0062] (3)加入500μl提前37℃预热好的不含抗生素的LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养45min；

[0063] (4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养12～16h；

[0064] (5)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床37℃、180rpm培养12～16h。

[0065] 上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的构建方法中，所述提取质粒PCR鉴定的PCR反应体系及参数为：

[0066] 提取的重组质粒(pGM-RNase3)1μl、dNTPs(10mM)0.5μL、10×Taq Buffer2μl、Taq DNA Polymerase 1.5U和质粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，补无菌超纯水至总体积20μl，混合均匀；

[0067] PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

[0068] 一种所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的扩增引物为序列表中SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，为正反引物对。

[0069] 上述中国林蛙上述的一种中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

[0070] 本发明的优点与效益：

[0071] 本发明首先提取中国林蛙的基因组DNA，设计特异性引物，PCR扩增基因，测定基因顺序。经过数据库检索，确定为中国林蛙Onconase样新功能基因Rd-RNase3。

[0072] 本发明林蛙功能基因Rd-RNase3序列经核糖核酸酶介导的肿瘤细胞凝集和对肿瘤细胞的选择性杀伤作用与野生型p53肿瘤遏制物的存在与否无关，并且该基因的稳定性较之现有技术更好。该基因表达研究显示该基因编码的蛋白质具有细胞毒性，能抑制肿瘤细胞的生长，符合制备抗肿瘤药物的条件。在抑瘤实验中可以看出，本发明Rd-RNase3基因重组融合蛋白在极低浓度下对肿瘤细胞具有很强大的杀伤作用，但对正常细胞无杀伤性，因此在制备抗肿瘤药物方面较之现有基因药物存在很大的优势。并且重组蛋白Rd-RNase3具有很好的抗氧化功能，这是其对肿瘤细胞抗增殖、细胞毒活性的重要影响因素。因为细胞的氧化还原状态影响细胞功能的各个方面。许多药物的细胞毒效果是由活性氧调节的。氧化应激可以干扰癌症化学药物治疗，包括阿霉素等化学治疗药物引起Burkitt淋巴瘤细胞凋亡可以被过氧化氢酶抑制。重组蛋白Rd-RNase3在肿瘤治疗方面具有很好的功效，并且其在与氧化应激有关的病理条件，如炎症、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、败血症休克、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化等疾病的治疗方面具有应用的潜能。

[0073] 本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的构建对进一步研究RNases有很大的启示性作用。氨基酸序列与现有序列的差异显著，功能性更强，可作为一种有选择性的细胞毒素，具有重要的医药开发应用价值。

[0074] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

[0075] 图1为目的基因PCR扩增结果图；

[0076] 图2为载体连接检测结果图；

[0077] 图3为转移到细胞的转化结果图；

[0078] 图4为质粒PCR扩增检测结果图；

[0079] 图5为空载体诱导表达对宿主菌生长无影响图；

[0080] 图6为Rd-RNase3经IPIG诱导表达后对宿主菌生长有抑制作用图；

[0081] 图7为大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE图；

[0082] 图8为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图；

[0083] 图9为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western blotting检测图；

[0084] 图10为重组融合蛋白对人卵巢癌CoC1细胞和中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞的生长抑制作用图；

[0085] 图11重组蛋白Rd-RNase3对小鼠肝组织丙二醛含量的影响。

具体实施方式

[0086] 本发明具体实施方式所用材料及设备来源：

[0087] 1、实验动物：中国林蛙(Rana dybowskii)来源：吉林省桦甸市；选择标准：识别特征：皮色多为深褐色，肚黄色，嘴端略钝圆，耳膜边有羊角黑瘢，颈背处有″∧″形黑斑，四肢有环行黑斑。

[0088] 2、所用菌种和载体：大肠杆菌感受态细胞DH5α，pGM-T载体(均购于TIANGEN生物技术有限公司)。

[0089] 3、工具酶与生化试剂：

[0090] 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，硅胶膜型PCR产物(DNA片断)纯化试剂盒，普通质粒小提试剂盒，Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，dNTPs，T4DNA Ligase，λDNA/HindIII，Taq DNA Polymerase，EcoR I，HindIII，1kb DNA Ladder，DNA Marker I(均购于TaKaRa公司)，基因组DNA提取试剂盒、核酸染料GoldView，50bp DNALadder(购于北京赛百盛生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯。

[0091] 4、设备和器材

[0092] TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；

[0093] HQ-60型旋涡混合器，北方同正生物技术发展公司；

[0094] PCR扩增仪9700型，Gene Amp公司；

[0095] THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；

[0096] UV-IV型紫外分析仪，北京市新科技应用研究所；

[0097] SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；

[0098] DYY-6C型电泳仪北京市六一仪器厂；

[0099] DYCP-31DN型电泳槽，北京六一仪器厂；

[0100] LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；

[0101] LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂；

[0102] SWCJ-B型净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司；

[0103] DZKW型电子恒温水浴锅，光明牌。

[0104] 实施例1：本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的具体构建方法：

[0105] 1、引物设计

[0106] 基因特异性引物：

[0107] 正向引物N275：TAT TTG CAG TTG TTT TGA GTC TCA C

[0108] 反向引物C715：CTG CTT ATC ACA TCC CTG TTG TC

[0109] 2、目标基因的PCR扩增

[0110] (1)使用血液基因组提取试剂盒，从林蛙新鲜血液中提取基因组DNA，1％琼脂糖电泳检测分子量及浓度。

[0111] (2)向无 菌PCR管中加 入基因 组模 板100ng、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer5μl、Taq DNA Polymerase 3U和引物(N275，C715)各30pmol、补无菌超纯水至总体积为50μl，混合均匀；

[0112] (3)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

[0113] (4)PCR结束后，在2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测并切胶纯化目标基因。紫外分析仪中，观察DNA条带。

[0114] 经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳如图1所示，以Marker I为参照标准，在紫外分析仪中，可看到约在400bp位置(包括部分信号序列，准确值为387bp)出现明亮的荧光条带，证明目的基因扩增成功，可用于接下来的载体连接。

[0115] 3、pGM-T载体连接

[0116] (1)向无菌PCR管中加入目标基因片断(20ng)、pGM-T载体(50ng)、T4 DNALigase3U、10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，补无菌超纯水至总体积10μl；

[0117] (2)16℃连接10～12小时制备成连接好目标基因的载体；

[0118] (3)对连接好的样品进行PCR检测。向无菌PCR管中加入连接产物1μl、dNTPs(10mM)1μL、10×Taq Buffer 5μl、Taq DNA Polymerase3U和质粒通用引物(T7，SP6)各10pmol，补无菌超纯水至总体积50μl，混合均匀。

[0119] (4)将加入样品的PCR管放入已经预热好的PCR仪中进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。

[0120] (5)PCR结束后，在2.5％TAE琼脂糖凝胶中上样电泳检测。紫外分析仪中，观察DNA条带。

[0121] 对16℃连接过夜的结果进行PCR及琼脂糖电泳检测如图2所示，在紫外分析仪中，以Marker I为参照标准，可看到在600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，证明载体连接成功，可进行后续实验。

[0122] 4、制备转化平板

[0123] (1)配制LB及LB/Agar培养基

[0124] ①LB液体培养基配制(500ml)：Tryptone 5g、Yeast Extract 2.5g、NaCl 5g，加入400ml水，充分搅拌溶解，滴加5N NaOH(约0.2ml)，调pH值到7.0，再加水定容至500ml(取出200ml用于配制固体培养基，300ml分装两瓶，各150ml)。121℃，0.1MPa，高压灭菌20min。4℃存放。

[0125] ②LB/Agar/Amp固体培养基配制：按LB液体培养基准备好，高压灭菌前加入Agar 3g/200ml，高压灭菌，冷却至50～60℃，在超净台上向其中加入抗生素(氨苄青霉素)0.2ml，混匀，倒平板(20ml/板)，4℃存放。

[0126] (2)在超净台上，向铺好含有相应抗生素的LB/Agar/Amp固体培养基表面加入16μl IPTG(50mg/ml)、40μl X-Gal(20mg/ml)，使用无菌涂棒涂匀，避光37℃恒温箱中放置1～3小时后使用。

[0127] 5、转化感受态细胞DH5α

[0128] (1)5μl(50ng)连接产物加入到100μl感受态细胞中，混匀，冰浴30min。

[0129] (2)42℃水浴中热激90s。取出后立即置于冰浴2min。

[0130] (3)加入500μl提前37℃预热好的LB培养基(不含抗生素)，37℃，150rpm摇床培养45min。

[0131] (4)4000rpm离心2min，弃部分上清液，浓缩后取100μl涂转化平板，涂匀，干燥，倒置平板，37℃恒温箱培养16h。

[0132] 转化结果如图3所示，16h培养后，经连接、转化的目的基因在培养基上长出蓝色和白色两种菌落，其中白色菌落为所需目的菌，在经过菌落检测后，若结果正确，则可用于液体培养及质粒提取。

[0133] 6、提取质粒、扩增及测序

[0134] (1)挑取分离良好、中等大小的白色菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，摇床37℃、180rpm培养12h。

[0135] (2)用质粒提取试剂盒提取质粒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质粒。

[0136] (3)PCR检测重组质粒中的插入DNA片段。向无菌PCR管中加入提取的重组质粒(pGM-RNase3)1μl、dNTPs(10mM)0.5μL、10×Taq Buffer 2μl、Taq DNAPolymerase 1.5U和质粒通用引物(T7，SP6)各5pmol，补无菌超纯水至总体积20μl，混合均匀。PCR扩增条件：94℃30s，48℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸7min结束。2.5％琼脂糖凝胶检测。至总体积20μl，混合均匀。

[0137] PCR扩增检测质粒上目标基因片段插入如图4所示，经12h培养所得菌液进行质粒提取，对所得质粒进行PCR反应及琼脂糖电泳检测，以Marker I为参照标准，可看到在600bp位置出现明亮的荧光条带，与预期结果基本一致，证明质粒提取结果正确。

[0138] (4)将提取的质粒测序。

[0139] 质粒样品由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。得到成熟蛋白编码区基因序列为SEQ ID No.1所示，具体为：

[0140] caagactgga aaacatttca gaagaaacac ctgacaaaca cccggaatat taaatgtgat 60[0141] aaaatcatgc caataaactt gttccactgc aagtacagga acacatttat ctattcacgt 120[0142] cctcgtggag tggaaaacct ctgtagagga aaaataaatg ccacaaatgt gtcaagtagt 180[0143] tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaa aaatccaggc cttgcaagta taaattaaag 240[0144] aaacaaacta atgtaatttg tataacatgt gagcataaag ttccagtaca ttttgtcggt 300[0145] gtcggaagtt gc 312[0146] 由基因序列推导得到成熟蛋白编码区蛋白序列如SEQ ID No.2所示，具体为：

[0147] Gln Asp Trp Lys Thr Phe Gln Lys Lys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn[0148] 1 5 10 15[0149] Ile Lys Cys Asp Lys Ile Met Pro Ile Asn Leu Phe His Cys Lys Tyr[0150] 20 25 30

[0151] Arg Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys[0152] 35 40 45

[0153] Arg Gly Lys Ile Asn Ala Thr Asn Val Ser Ser Ser Ser Lys Phe Ala[0154] 50 55 60

[0155] Leu Phe Glu Cys Ile Glu Lys Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys[0156] 65 70 75 80[0157] Lys Gln Thr Asn Val Ile Cys Ile Thr Cys Glu His Lys Val Pro Val[0158] 85 90 95[0159] His Phe Val Gly Val Gly Ser Cys

[0160] 100

[0161] 将上述测序结果与Genbank数据库进行序列比对，结果表明，本发明所述的中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列为新的基因。

[0162] 实施例2：本发明构建的中国林功能基因Rd-RNase3序列及氨基酸序列的生物学实验

[0163] 一、材料和方法

[0164] 1、材料

[0165] (1)菌种和载体

[0166] 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载体购于sigma-aldrich。

[0167] (2)工具酶与生化试剂：

[0168] Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，其它试剂均为市售分析纯。

[0169] (3)设备和器材

[0170] 设备

[0171] THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；

[0172] SPN202F型电子天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；

[0173] LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；

[0174] LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂；

[0175] SWCJ-B型净化工作台，天津市中环实验电炉有限公司；

[0176] 2、实验方法

[0177] 将携带有空质粒pFLAG-CTS或携带有中国林蛙Rd-RNase3基因的重组质粒pFLAG-RNase3的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于LB/agar/Amp平板上活化，挑取LB/agar/Amp平板上过夜生长的单菌落，接种于20ml LB/Amp培养基中，37℃，180rpm摇菌过夜。次日在20ml菌液中再加入新鲜LB/Amp培养基20ml，37℃，180rpm摇菌至对数生长中期(OD600＝
0.8)，分出20ml菌液于已灭菌并预热至37℃的三角瓶中，加入终浓度为20uM的IPTG诱导表达，剩余的20ml菌液中不加IPTG，作为非诱导对照，定时检测OD600，记录IPTG诱导重组蛋白表达过程中对宿主菌生长的抑制情况。

[0178] 3、实验结果

[0179] (1)空载体诱导表达对宿主菌生长无影响，如图5所示，用20uM IPTG诱导携带有空质粒pFLAG-CTS的Escherichia Coli BL21(DE3)表达后，宿主菌的生长情况与未诱导相比，没有差别。可见空载体的诱导表达不影响宿主菌的生长。

[0180] (2)重组质粒pFLAG-RNase3诱导表达过程中对宿主菌生长具有明显抑制作用，如图6所示，用20uM IPTG诱导携带有重组质粒pFLAG-RNase3的EscherichiaColi BL21(DE3)表达重组蛋白30min后，明显可见宿主菌的生长受到抑制，60min后抑制率达到23％，诱导120min后抑制率可达到58％。

[0181] 4、结论

[0182] 携带有本发明所述抗肿瘤功能基因Rd-RNase3的重组质粒pFLAG-RNase3的大肠杆菌BL21(DE3)，在加入诱导剂IPTG以后开始转录和表达Rd-RNase3基因，重组蛋白分泌至大肠杆菌的周质腔中储存。

[0183] 实验结果表明，诱导剂IPTG对带有空载体的大肠杆菌没有抑制作用，说明空载体本身的诱导表达对大肠杆菌没有细胞毒作用。

[0184] 诱导剂IPTG对带有Rd-RNase3重组质粒pFLAG-RNase3的大肠杆菌具有显著的抑制作用，说明重组蛋白的诱导表达对大肠杆菌具有显著的细胞毒作用。尤其值得注意的是携带有pFLAG-CTS质粒的宿主菌都是耐受Amp抗生素的耐药菌，说明了重组蛋白的细胞毒性较强，这些重组蛋白有可能在治疗耐药病原菌引起的感染性疾病方面具有应用价值，同样也说明了这些重组蛋白在治疗肿瘤细胞中具有应用价值。

[0185] 实施例3：本发明中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列的重组融合蛋白的制备[0186] 一、材料与设备

[0187] 1、菌种和载体

[0188] 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于TIANGEN生物技术有限公司，pFLAG-CTS载体购于sigma-aldrich。

[0189] 2、工具酶与生化试剂

[0190] Tryptone，Yeast Extract，Agarose，氨苄青霉素，X-Gal，IPTG等(均购于TIANGEN生物技术有限公司)，小鼠抗FLAG单克隆抗体(购于Sigma公司)，连接有碱性磷酸酶的羊抗小鼠二抗，BCIP/NBT显色试剂盒(购于北京中杉金桥生物公司)，其它试剂均为市售分析纯。

[0191] 3、设备

[0192] THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；

[0193] LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；

[0194] LS-835L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴江滨医疗设备厂；

[0195] 超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；

[0196] YC-1层析柜，北京博医康实验仪器有限公司；

[0197] 高速冷冻离心机(SORVALL RC6PLUS)，THERMO；

[0198] 冷冻干燥机(FD-1B-50)，北京亚泰科隆实验科技开发中心；

[0199] 超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；

[0200] 万分之一电子天平(AR2140)，奥豪斯公司；

[0201] PH仪(PHSJ-3F)，上海雷磁

[0202] 可见-紫外分光光度计(UV-1700)，SHIMADZU；

[0203] 垂直电泳槽(DYC2-24D)，北京六一仪器厂；

[0204] 电泳仪(DYY-8C)，北京六一仪器厂

[0205] 二、实验方法

[0206] 1、菌体的培养及超声裂解

[0207] 将携带重组质粒的菌体，在LB/Agar/Amp培养基的平板上划线，37℃恒温箱中培养过夜。次日用接种针挑取分离良好的单菌落，接入LB/Amp液体培养基中，置于摇床，于37℃，180rpm，培养12小时。按照5％接种量接种于预热好的LB/Amp培养基中，共培养6L菌液。使菌生长至对数期(OD600＝0.6～0.8)时加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h。

[0208] 离心收集菌体，PBS洗涤三次。加入破碎缓冲液，冰浴超声，裂解菌体。离心收集上清液。分离胶浓度为12％的SDS-PAGE及western blot检测裂解液中的目标蛋白。

[0209] 2、亲和胶纯化重组融合蛋白

[0210] 在重组蛋白的C端带有FLAG标签(其氨基酸序列为EFPGTRSVDYKDDDDK)，FLAG不会影响目标蛋白质正确折叠成三维结构，也不会影响目标蛋白质的活性。可方便地利用小鼠抗FLAG单克隆抗体偶联的琼脂糖亲和胶(购于sigma公司)进行纯化。具体方法是：将细胞裂解液高速冷冻离心(4℃，20000rpm，30min)后，取上清，与亲和胶孵育，4℃，过夜。离心(4℃，1500rpm，2min)，收集亲和胶。用TBS洗胶，五次。向亲和胶中加入1ml甘氨酸洗脱液，轻摇1min，离心(4℃，1500rpm，2min)，取上清，放入一支有10ul中和液的离心管内，分批共洗脱亲和胶5次，收集5管洗脱蛋白。

[0211] 3、检测样品纯度

[0212] 将得到的洗脱蛋白合并，对水充分透析后冻干。将冻干粉用100ul TBS溶解后，用Bradford法测定蛋白质浓度，进行SDS-PAGE，检测产品纯度，westernblotting鉴定重组蛋白。

[0213] 三、实验结果

[0214] 1、大肠杆菌裂解液中重组融合蛋白的检测

[0215] 携带有Rd-RNase3基因的重组质粒pFLAG-RNase3的大肠杆菌在LB/Amp培养基中培养至对数中后期(OD600＝0.6～0.8)，加入终浓度为20uM的IPTG诱导4h后，离心收集菌体，洗涤菌体后冰浴超声裂解细胞，将得到的裂解液进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％)，检测到裂解液中在预期分子量位置有重组融合蛋白的条带。如图7所示，为大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE图，图中：最左边泳道为大肠杆菌裂解液，中间泳道为核糖核酸酶A，最右侧为低分子量蛋白标准。由图可见，在分子量约13.7kDa处有目标蛋白表达。

[0216] 2、亲和胶纯化重组融合蛋白Rd-RNase3

[0217] 将细胞裂解液高速冷冻离心(4℃，20000rpm，30min)后，取上清，与连接有抗FLAG抗体的亲和胶一起孵育过夜，使目标蛋白吸附于亲和胶上。经过多次洗涤亲和胶去除杂蛋白后，采用分部酸洗脱，使目标蛋白Rd-RNase3从亲和胶上解析下来。洗脱后的Rd-RNase3重组蛋白立即用中和液中和至中性pH值。电泳检测重组蛋白Rd-RNase3的纯度。结果如图8示，为SDS-PAGE检测亲和胶纯化后重组蛋白的纯度图，由图可见，在分子量约为13.7kDa处重组蛋白为均一条带。采用亲和胶纯化得到了重组蛋白的单一组分。

[0218] 分别将大肠杆菌裂解液和纯化的重组蛋白经12％分离胶浓度的SDS-PAGE分离后，转印到PVDF膜上，分别用抗FLAG小鼠单克隆抗体(Sigma，300倍稀释)、二抗——碱性磷酸酶连接的羊抗小鼠抗体(中杉金桥生物公司，20倍稀释)与抗原反应，BCIP/NBT显色鉴定重组蛋白，如图9所示，为大肠杆菌裂解液总蛋白与纯化的重组蛋白Western blotting检测图，泳道1：大肠杆菌裂解液总蛋白；泳道2：纯化的重组蛋白。图中，左边为大肠杆菌裂解液，右边为Rd-RNase3纯品。由此可鉴定大肠杆菌裂解液总蛋白中有重组蛋白表达，经过亲和胶纯化后得到了重组蛋白的纯品。

[0219] 4、结论

[0220] 本实验将导入重组质粒的大肠杆菌进行培养，制备核糖核酸酶Rd-RNase3重组融合蛋白。由于核糖核酸酶为胞内酶，首先进行细胞破碎，上清液即为粗酶液。采用亲和胶分离纯化，得到林蛙Rd-RNase3重组融合蛋白，SDS-PAGE电泳检测到分子量约在13.7kDa左右的均一条带。Western blotting法鉴定了Rd-RNase3重组融合蛋白。建立了有效的Rd-RNase3重组融合蛋白的制备方法。

[0221] 实施例4：中国林蛙Rd-RNase3基因的重组融合蛋白的体外抗肿瘤作用研究[0222] 一、材料与设备

[0223] 1、细胞株、培养基与生化试剂

[0224] 人卵巢癌CoC1细胞和中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。RPMI 1640培养基购于Gibco，小牛血清、青霉素、链霉素、MTT、台盼蓝、DMSO购于鼎国生物技术有限公司，其它试剂均为市售分析纯。

[0225] 2、设备

[0226] 二氧化碳培养箱(日本Forma)；

[0227] 酶标仪(Lab systems Dragon well scan MK3)；

[0228] 倒置显微镜(Nikon 808434)；

[0229] 立式压力蒸汽灭菌锅(LS-835L型)江阴江滨医疗设备厂；

[0230] 净化工作台(SWCJ-B型)，上海新苗医疗器械制造有限公司。

[0231] 二、实验方法

[0232] 1、细胞培养

[0233] 人卵巢癌CoC1细胞和中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞生长于RPMI 1640培养液(Gibco公司)，内含体积分数为10％小牛血清(56℃灭活30min)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，于37℃、体积分数为5％CO2的培养箱中培养，每2～3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

[0234] 2、MTT实验检测重组融合蛋白Rd-RNase3对细胞生长的抑制作用

[0235] 收集对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化，配制成细胞悬液，于显微镜下用血球计4
数板计数，调整细胞初始浓度为1×10 细胞/ml。于96孔培养板内每孔接种100μl(每孔含1000个细胞)。培养24h后，吸出培养液，按实验设计分别加入含不同药物浓度的培养液，用培养基配制重组融合蛋白Rd-RNase3，设5个浓度：50μg/l、25μg/l、12.5μg/l、
6.25μg/l、3.12μg/l，空白对照组加入不含药物的等体积培养液，每组设3个平行孔，每孔加样100μl。置37℃、体积分数为5％CO2孵育箱中培养48h后弃去培养液，用培养液洗
2次，以去除药液，每孔加入0.5％MTT溶液(RPMI 1640配制)20μl。37℃保温4h，弃上清液，每孔加入DMSO 200μl溶解Formazan颗粒，平板振荡仪振荡10min，在酶标仪上490nm波长检测各孔吸光度值，绘制细胞存活率曲线。

[0236] 三、实验结果

[0237] 1、MTT实验检测重组融合蛋白对细胞的生长抑制作用，实验结果如图10所示，为重组融合蛋白对人卵巢癌CoC1细胞和中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞的生长抑制作用图，由图可见，重组融合蛋白对人卵巢癌CoC1细胞细胞的生长具有显著抑制作用，对CHO-K1细胞无抑制作用。

[0238] 四、结论

[0239] 卵巢癌由于其发病初期症状、体征较为隐蔽而难以发现，70％的卵巢癌患者在就诊时已为晚期，而目前中晚期恶性肿瘤缺乏有效的治疗手段，且治疗后出现不同克隆的新生肿瘤，故5年生存率仅为20％～30％。

[0240] 本发明的重组融合蛋白Rd-RNase3在极低浓度下对于受试的人卵巢癌CoC1细胞具有强大的体外细胞毒性，且呈现明显的剂量依赖效应。对CHO-K1细胞无抑制作用。可见，重组融合蛋白具有选择性杀伤肿瘤细胞的细胞毒性。对于肿瘤的临床治疗具有重要的开发应用价值。

[0241] 实施例5：中国林蛙Rd-RNase3基因的重组融合蛋白抗氧化作用

[0242] 一、材料与设备

[0243] 1、实验动物与试剂

[0244] ICR小鼠，体重18～22g，雌雄兼用。北京维通利华实验动物技术有限公司提供。硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硫酸亚铁、过氧化氢等试剂均为市售分析纯。

[0245] 2、设备

[0246] 万分之一电子天平(AR2140)，奥豪斯公司；

[0247] 高速冷冻离心机(SORVALL RC6PLUS)，THERMO；

[0248] TGL-16C型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；

[0249] DZKW型电子恒温水浴锅，光明牌。

[0250] 可见-紫外分光光度计(UV-1700)，SHIMADZU；

[0251] 二、实验方法

[0252] 检测重组蛋白对小鼠肝微粒体脂质过氧化产物丙二醛的作用。

[0253] 肝匀浆液的制备：取小鼠肝脏，用冷生理盐水洗净后称重，冰浴下匀浆，制成0.5％悬浮液，离心(4℃，5000rpm，20min)后取上清液用于抗氧化性测定。

[0254] 硫代巴比妥酸法：脂质过氧化反应的最终产物丙二醛在酸性条件下与硫代巴比妥酸共热(100℃，20min)，生成粉红色物质，于532nm有吸收峰，可计算出丙二醛的量，从而得出脂质过氧化的情况。

[0255] 小鼠肝组织丙二醛含量的测定：各取肝匀浆液1ml，加不同浓度的重组蛋白1ml，加入6mmol/L的FeSO4 100μl，最后加入60mmol/L H2O2 40μl，37℃水浴孵育1h后，加入1ml 15％三氯乙酸结束反应，再加入1ml 6.7％硫代巴比妥酸，于沸水浴中显色20min，冷却后离心，取上清于532nm处测定吸光度值。

[0256] 数据处理：结果经t检验。

[0257] 三、实验结果

[0258] 由图11可知，由于Fe2++H2O2体系生成的·OH具有极强的损坏性，导致小鼠肝微粒体脂质过氧化产物丙二醛含量增加，加入重组蛋白Rd-RNase3后，丙二醛产生的量减少，说+明重组蛋白Rd-RNase3能够抑制Fe2+H2O2体系生成的·OH，从而抑制肝微粒体脂质过氧化反应的进行。

[0259] 四、结论

[0260] 细胞的氧化还原状态影响细胞功能的各个方面。许多药物的细胞毒效果是由活性氧调节的。氧化应激可以干扰癌症化学药物治疗，包括阿霉素等化学治疗药物引起Burkitt淋巴瘤细胞凋亡可以被过氧化氢酶抑制。重组蛋白Rd-RNase3具有抗氧化功能，这是其对肿瘤细胞抗增殖、细胞毒活性的重要因素。重组蛋白Rd-RNase3在肿瘤治疗以及与氧化应激有关的病理条件，如炎症、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、败血症休克、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化等疾病的治疗方面具有应用的潜能。

[0261] 序列表

[0262] <110>北京联合大学生物化学工程学院

[0263] <120>中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列、构建方法及其氨基酸序列和用途[0264] <130>

[0265] <160>4

[0266] <170>PatentIn version 3.3

[0267] <210>1

[0268] <211>312

[0269] <212>DNA

[0270] <213>中国林蛙功能基因Rd-RNase3序列

[0271] <400>1

[0272] caagactgga aaacatttca gaagaaacac ctgacaaaca cccggaatat taaatgtgat 60[0273] aaaatcatgc caataaactt gttccactgc aagtacagga acacatttat ctattcacgt 120[0274] cctcgtggag tggaaaacct ctgtagagga aaaataaatg ccacaaatgt gtcaagtagt 180[0275] tcaaagtttg ctctctttga gtgcattgaa aaatccaggc cttgcaagta taaattaaag 240[0276] aaacaaacta atgtaatttg tataacatgt gagcataaag ttccagtaca ttttgtcggt 300[0277] gtcggaagtt gc 312[0278] <210>2

[0279] <211>104

[0280] <212>PRT

[0281] <213>中国林蛙功能基因Rd-RNase3氨基酸序列

[0282] <400>2

[0283] Gln Asp Trp Lys Thr Phe Gln Lys Lys His Leu Thr Asn Thr Arg Asn[0284] 1 5 10 15[0285] Ile Lys Cys Asp Lys Ile Met Pro Ile Ash Leu Phe His Cys Lys Tyr[0286] 20 25 30

[0287] Arg Asn Thr Phe Ile Tyr Ser Arg Pro Arg Gly Val Glu Asn Leu Cys[0288] 35 40 45

[0289] Arg Gly Lys Ile Asn Ala Thr Asn Val Ser Ser Ser Ser Lys Phe Ala[0290] 50 55 60

[0291] Leu Phe Glu Cys Ile Glu Lys Ser Arg Pro Cys Lys Tyr Lys Leu Lys[0292] 65 70 75 80[0293] Lys Gln Thr Asn Val Ile Cys Ile Thr Cys Glu His Lys Val Pro Val[0294] 85 90 95[0295] His Phe Val Gly Val Gl y Ser Cys

[0296] 100

[0297] <210>3

[0298] <211>25

[0299] <212>DNA

[0300] <213>正向引物N275

[0301] <400>3

[0302] tatttgcagt tgttttgagt ctcac 25

[0303] <210>4

[0304] <211>23

[0305] <212>DNA

[0306] <213>反向引物C715

[0307] <400>4

[0308] ctgcttatca catccctgtt gtc 23