涂覆藻酸盐的含多糖凝胶泡沫复合物,其制备方法及其应用转让专利
申请号 : CN200880103529.9
文献号 : CN101778891B
文献日 : 2013-01-16
发明人 : J·E·梅尔维克 , T·安德森
申请人 : FMC有限公司
摘要 :
本发明涉及复合物，所述复合物包含在泡沫体的孔中胶凝的多糖和多糖涂层，本发明还涉及所述复合物的制备方法和应用，例如用于生物医学应用，如细胞培养介质和移植物，控制释放的递送系统，食品应用，工业应用和包括化妆品和口腔卫生的个人护理应用。
权利要求 :
1.一种复合物，其包含：
i)多孔泡沫体，所述泡沫体包含聚合物和分布在至少部分泡沫体中的形成凝胶的离子，所述聚合物选自下组：藻酸盐、胶质、角叉菜胶、透明质酸盐、壳聚糖以及它们的组合；
ii)包含具有胶凝化位点的多糖的凝胶，其中所述凝胶在所述泡沫体的孔内形成，位于泡沫体孔内并与泡沫体相互作用，该相互作用是化学作用，通过由形成凝胶的离子形成桥键而在泡沫体和多糖之间产生键合；和iii)由所含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子形成的水凝胶涂层，其中，所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述藻酸盐选自细胞粘附序列改性的藻酸盐、RGD改性的藻酸盐以及它们的组合。
3.如权利要求1或2所述的复合物，其特征在于：所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：锶离子、钡离子、钙离子以及它们的组合；所述多糖选自下组：藻酸盐、胶质、角叉菜胶、透明质酸盐以及它们的组合；或者所述泡沫体和所述涂层中的所述形成凝胶的离子各自独立地选自下组：三磷酸根离子、磷酸根离子、柠檬酸根离子或者它们的组合；所述多糖包括壳聚糖。
4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子的摩尔量等价于所述凝胶的所述多糖的所述胶凝位点的至少5％。
5.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述凝胶中的所述多糖选自下组：藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、透明质酸盐、胶质、以及它们的组合并且/或者所述涂层包含透明质酸盐、藻酸盐、壳聚糖、细胞粘附序列改性的多糖或RGD改性的藻酸盐。
6.如权利要求5所述的复合物，所述藻酸盐选自细胞粘附序列改性的藻酸盐、RGD改性的藻酸盐以及它们的组合。
7.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，多糖包括古罗糖醛酸盐(G)含量为
20-80％的藻酸盐和/或甘露糖醛酸盐(M)含量至少为20％的藻酸盐，和/或甘露糖醛酸盐与古罗糖醛酸盐的比值大于或等于1。
8.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，多糖包括具有重均分子量4-300kD的藻酸盐。
9.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，多糖包括具有重均分子量150-250kD的藻酸盐。
10.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，多糖包括具有重均分子量75-150kD的藻酸盐。
11.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述涂层中包含的所述多糖的量为所述涂层的0.2-10％。
12.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述涂层中包含的所述多糖的量为所述涂层的1-8％。
13.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述涂层中包含的所述多糖的量为所述涂层的2-7％。
14.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述涂层中包含的所述多糖的量和为所述涂层的3-6％。
15.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述泡沫体具有以下性质：该泡沫体能吸收为其重量的1-30倍的液体，所述液体选自下组：水、生理溶液、可溶性多糖溶液和包含功能组分的多糖溶液；和/或该泡沫体包含藻酸盐，所述复合物还包含选自药物活性剂和/或抗粘附剂的功能组分；和/或该泡沫体进一步包含网状物。
16.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，复合物的弹性模量为0.1-1000kPa。
17.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，复合物进一步包含选自下组的功能组分：调味剂、芳香剂、微粒、细胞、多细胞聚集体、治疗剂、组织再生剂、生长因子、营养制品以及它们的组合。
18.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述凝胶进一步包含胰岛细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、间质干细胞和卵巢细胞。
19.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物任选包含细胞，所述复合物选自下组：a)具有以下特性的复合物：
i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；和
iv)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
b)具有以下特性的复合物：
i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
iv)所述涂层包含藻酸盐；和
v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
c)具有以下特性的复合物：
i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
iv)所述涂层包含藻酸盐；和
v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
d)具有以下特性的复合物：
i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
iv)所述涂层包含藻酸盐；和
v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和e)具有以下特性的复合物：i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子是钙离子；
iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
iv)所述涂层包含藻酸盐；和
v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子是钙离子。
20.如权利要求1所述的复合物，所述复合物具有以下特性：i)所述泡沫体中的所述聚合物是细胞粘附序列改性的藻酸盐；
ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合iii)所述凝胶中的所述多糖是细胞粘附序列改性的藻酸盐；和v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合。
21.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述孔的平均孔径为25-1000微米。
22.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物进一步包含固体支承结构。
23.如权利要求22所述的复合物，其特征在于，泡沫体包含为网状物形式的固体支承结构。
24.一种形成权利要求1-23中任一项所述的复合物的方法，该方法包括：i)使第一液体组分与多孔泡沫体接触，其中，所述第一组分包含具有能够在与所述离子接触时形成凝胶的胶凝位点的多糖，因此在与所述形成凝胶的离子接触时能够形成凝胶；和ii)在所述泡沫体外表面上形成所述涂层；
iii)任选地，在形成所述涂层之后，使所述复合物与锶离子和钙离子的溶液接触；
其中：
所述泡沫体包含形成凝胶的离子，其中所述离子分布在至少一部分泡沫体中；和由所含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子形成的水凝胶涂层，所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述形成涂层的步骤包括：i)在泡沫体的外表面施用第二液体组分，所述第二液体组分包含具有胶凝位点的多糖；和ii)所述施用步骤后，使所述第二液体组分与形成凝胶的离子的溶液接触，以形成所述涂层。
26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述第一液体组分包含0.2-10％w/v所述多糖；和/或所述第二液体组分包含0.2-10％w/v藻酸盐。
27.如权利要求24或25所述的方法，所述第一液体组分包含0.5-5％w/v所述多糖。
28.如权利要求24或25所述的方法，所述第一液体组分包含0.1-1.0％w/v的所述多糖。
29.如权利要求24或25所述的方法，所述第二液体组分包含2-7％w/v藻酸盐。
30.如权利要求24或25所述的方法，所述第二液体组分包含0.2-10％w/v改性藻酸盐。
31.如权利要求24或25所述的方法，所述第二液体组分包含2-7％w/v改性藻酸盐。
32.如权利要求1-23中任一项所述的复合物的用途，其特征在于，所述复合物用作用于细胞固定的基质和/或用于体外组织培养的增殖应用。
33.权利要求1-23中任一项所述复合物用于制造防止组织与相邻组织粘连的药物的用途。
34.权利要求1-23中任一项所述复合物用于制造治疗糖尿病或者调控血糖水平的药物的用途，所述凝胶包含胰岛细胞。
35.如权利要求34所述的用途，所述药物是用于降低血糖水平的药物。
说明书 :
涂覆藻酸盐的含多糖凝胶泡沫复合物，其制备方法及其应
用
发明领域
[0001] 本发明涉及包含位于泡沫体孔中胶凝化的多糖和多糖涂层的复合物，该复合物的制备方法及其应用。该复合物特别适用于生物医学应用，例如细胞培养介质和移植物，控制释放的递送系统，食品应用，工业应用和包括化妆品和口腔卫生的个人护理应用。
[0002] 发明背景
[0003] 需要提供能适用于例如创伤处理、组织工程、组织再生和细胞固定的产品。本发明涉及这类需求和其他的需求。
[0004] 发明概述
[0005] 在一个方面，本发明提供包含以下组分的复合物：
[0006] i)多孔泡沫体，所述泡沫体包含分布在至少部分泡沫体中的形成凝胶的离子；
[0007] ii)包含具有胶凝化位点的多糖的凝胶，其中所述凝胶位于泡沫体孔内并与泡沫体相互作用；和
[0008] iii)包含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子的涂层，其中，所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
[0009] 在另一个方面，本发明还提供包含位于凝胶中的细胞的复合物，所述凝胶在该复合物的泡沫体孔内。
[0010] 在另一个方面，本发明还提供制备本发明的任一复合物的方法，包括在此所述的各种复合物实施方式以及这些实施方式的组合，该方法包括：
[0011] i)使第一液体组分与多孔泡沫体接触，其中，所述第一组分包含具有能够在与所述离子接触后形成凝胶的胶凝位点的多糖，因此在与所述形成凝胶的离子接触后能够形成凝胶；和
[0012] ii)在所述泡沫体外表面上形成所述涂层；
[0013] 其中：
[0014] 所述泡沫体包含聚合物和形成凝胶的离子，其中所述离子分布在至少一部分泡沫体中；和
[0015] 所述涂层包含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子的多糖，其中所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
[0016] 在又一个方面，本发明提供制备方法和按照本发明方法制备的复合物的应用。所述复合物特别适用于医学应用，例如，创伤处理、组织工程、组织再生和细胞固定。
[0017] 本发明提供给予有需要的患者一种或多种复合物的方法，该方法包括将所述一种或多种复合物移植在所述患者体内。
[0018] 本发明还提供在此所述的复合物用于治疗人或动物体的使用方法。在一些实施方式中，所述复合物用于治疗糖尿病或者降低血糖水平。
[0019] 本发明还提供用于在有需要的患者体内移植一种或多种复合物(包括本发明的一种或多种复合物)的试剂盒。
[0020] 本发明还提供了促进在所述复合物中的细胞增殖的方法，该方法包括用溶液清洗该复合物，调整对活细胞中性的渗透压，所述溶液含有形成凝胶的离子。
[0021] 本发明还提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括：采用本发明方法形成复合物，其中液体组分包含细胞，所述多糖能在泡沫体的孔内发生胶凝，泡沫体中形成凝胶的离子包括锶离子。
[0022] 本发明还提供从所述复合物回收细胞的方法，该方法包括使包含回收剂的水溶液与包含可溶性多糖的凝胶接触，其中，调节所述水溶液以提供对活细胞为中性的渗透压。
[0023] 本发明还提供一种促进细胞生长的方法，该方法包括将所述的复合物移植到人或动物体内以达到建立细胞生长目的，其中，复合物中的泡沫体包含藻酸盐。
[0024] 本发明还提供一种防止组织与相邻组织粘连的方法，该方法包括在所述组织上施加所述复合物，使得提供在组织和相邻组织之间的阻挡层。
[0025] 本发明还提供了所述复合物作为用于细胞固定的基质的用途和/或用于体外组织培养的增殖应用或体内组织工程应用。
[0026] 附图简要描述
[0027] 图1显示泡沫复合物实施方式的代表，其中的细胞是凝胶的一部分。
[0028] 发明详述
[0029] 定义
[0030] 如本文中所用，术语“约”表示某数值的±10％以内。
[0031] 如本文中所用，术语“藻酸盐”表示藻酸的盐和改性的藻酸盐。藻酸可以从海藻中分离，是由两种糖醛酸(D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸)构成的多糖醛酸。甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的比例随诸如海藻种类，植物年龄和和海藻的部分(如茎、叶)的因素而不同。藻酸基本上不溶于水。藻酸能与以下物质形成水溶性盐：碱金属，例如钠、钾和锂；镁；铵；
和源自低级胺(例如甲胺、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)的取代的铵阳离子。所述盐在pH大于4的水性介质中是可溶性的，但是在pH降低至低于约4时会转化为藻酸。在如钙、钡、锶、锌、铜(+2)、铝和它们的混合物的形成凝胶离子存在下，在适当浓度下形成热不可逆的水不溶性藻酸盐凝胶。通过将藻酸盐凝胶浸在可溶性阳离子或用于形成凝胶的离子的螯合剂(例如EDTA，柠檬酸盐等)的溶液中使藻酸盐凝胶溶解。
和源自低级胺(例如甲胺、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)的取代的铵阳离子。所述盐在pH大于4的水性介质中是可溶性的，但是在pH降低至低于约4时会转化为藻酸。在如钙、钡、锶、锌、铜(+2)、铝和它们的混合物的形成凝胶离子存在下，在适当浓度下形成热不可逆的水不溶性藻酸盐凝胶。通过将藻酸盐凝胶浸在可溶性阳离子或用于形成凝胶的离子的螯合剂(例如EDTA，柠檬酸盐等)的溶液中使藻酸盐凝胶溶解。
[0032] 在褐藻科类海藻的叶和茎中发现主要阳离子是钙的水不溶性藻酸盐，所述海藻的实例有：水疱墨角藻(Fucus vesiculosus)，螺旋墨角藻(Fucusspiralis)，岩衣藻(Ascophyllum nodosum)，梨形巨藻(Macrocystispyrifera)，可食用翅 藻(Alaria esculenta)，兴 红 藻(Eclonia maxima)，褐 海 藻 (Lessonia nigrescens)，褐 藻 (Lessonia trabeculata)， 海 带 (Laminariajaponica)， 褐 藻 (Durvillea Antarctica)，极北海带(Laminariahyperborean)，长股褐藻(Laminaria longicruris)，褐 藻 海 带(Laminariadigitata)，糖 海 带(Laminaria saccharina)，克 氏 海 带(Laminariacloustoni)，和南海马尾藻(Saragassum sp)。从天然来源回收藻酸和其水溶性盐，尤其是藻酸钠盐的方法是众所周知的，在以下专利中描述，Green的美国专利第2,036,934号和Le Gloahec的美国专利第2,128,551号。合适的藻酸盐包括但不限于PRONOVA UP和SLM系列(NovaMatrix，FMC公司(FMC Corp.)，挪威的奥斯陆)。
[0033] 如本文中所用，术语“壳聚糖”指线型多糖，包括β-(1→4)-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃(型)葡萄糖(GlcNAc)和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃(型)葡萄糖(GlcN)以及改性壳聚糖。壳聚糖是甲壳质的N-脱乙酰基化衍生物，甲壳质几乎完全由β-(1→4)-连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃(型)葡萄糖(GlcNAc)组成。工业化壳聚糖是通过对甲壳质进行碱N-脱乙酰基化制备。结合去除不溶性化合物的多相脱乙酰基化过程产生壳聚糖产物，该产物具有GlcNAc和GlcN-单元沿聚合物链的无规分布。壳聚糖中的氨基的表观pKa-值约为6.5，并且在pH低于该值时，游离氨基将被质子化，使溶解于溶液的壳聚糖盐带正电荷。因此，壳聚糖能够与带负电荷的组分反应，与壳聚糖的正电荷密度呈正比关系。
[0034] 较好地，壳聚糖的阳离子特性提供了生物粘附性质。此外，因为红血球的负电荷性质，壳聚糖能沉淀红血球，提供在形成血块和降低复原期间纤维蛋白水平的益处，因此减少疤痕组织的形成。壳聚糖可以通过溶解酵素以及哺乳动物例如人的体内产生的其他相关酶降解。在使用壳聚糖时，本发明的泡沫体通过在哺乳动物的唾液、眼泪、血清和组织液中的溶解酵素而适当降解。具有壳聚糖泡沫体的复合物可有利地用于创伤处理，作为人或动物体内的生物粘附和其他应用。壳聚糖的降解产物是葡糖胺和N-乙酰葡糖胺，它们对哺乳动物无毒性。移植的壳聚糖泡沫体被溶解酵素降解的速率可以通过改变壳聚糖脱乙酰基化的程度来改进，因为乙酰基化可防止聚合物发生酶降解。具有较高脱乙酰基化程度的壳聚糖因为正电荷的保护作用，具有较高的抵抗酸水解造成的无规解聚效果。
[0035] 适用于本发明的壳聚糖可以是壳聚糖碱、水溶性壳聚糖盐或改性壳聚糖的形式。壳聚糖碱可能需要稀酸进行溶解，例如1重量％的乙酸。壳聚糖可溶解于酸性pH的水性介质中，在此情况下多糖带有较高程度的正电荷。高分子量的壳聚糖在单体单元无规分布且脱乙酰基化程度(DA)为40-60％时，在中性pH条件下可溶。随DA下降，壳聚糖在较高pH值时的溶解度提高。通过使DA大于60％的壳聚糖解聚，可以提高其在中性pH值时的水溶性。
[0036] 一般而言，壳聚糖需要酸性环境进行溶解。通过将壳聚糖溶解于适当酸中，在干燥后获得合适的壳聚糖盐。合适的壳聚糖盐包括以下：盐酸壳聚糖、谷氨酸壳聚糖、乳酸壳聚糖、马来酸壳聚糖、苹果酸壳聚糖、丙二酸壳聚糖、琥珀酸壳聚糖、甲酸壳聚糖、壳聚糖、天(门)冬氨酸壳聚糖、硝酸壳聚糖、烟酸壳聚糖和己二酸壳聚糖。谷氨酸壳聚糖是通过将壳聚糖溶解于谷氨酸而转化为谷氨酸盐。谷氨酸以相对于GlcN单元数量的化学计量量存在。盐酸壳聚糖含有相对于GlcN单元数量的化学计量量的盐酸。
[0037] 壳聚糖的盐一般是水溶性的，1％壳聚糖盐溶液的pH通常为4-6。壳聚糖的功能性质受到脱乙酰基化程度以及分子量和分子量分布的影响。适当地，乙酰基化程度范围为40-100％，优选50-100％。在一些实施方式中，乙酰基化程度优选为80-99％，更优选80-95％。合适的分子量在10-1000kDa范围。
[0038] 合适的改性壳聚糖含有与壳聚糖共价键合的部分，例如肽偶联的壳聚糖。改性的壳聚糖可以通过选择改性壳聚糖中的部分以及它们的浓度进行调节，以增添、改性或者改变壳聚糖的性质或官能度，例如交联能力，溶解度，生物降解速率，结合例如特定细胞、药物或肽的能力。
[0039] 酶降解使能够以特定方式设计泡沫体，使产物能够行使其功能，然后通过降解从体内除去。合适的壳聚糖包括但不限于：Protasan系列(NovaMatrix，FMC公司，挪威奥斯陆)。
[0040] 如本文中所用，术语“胶质”是在各种植物的根、茎、叶和果实中发现的天然生成的多糖，尤其可以从柑橘类水果如酸橙、柠檬、柚子和橙的果皮中发现。胶质含有源自D-半乳糖醛酸的聚合单元。商业产品包含高甲氧基胶质和低甲氧基胶质(以及衍生物，如酰胺化胶质)，其中，依据胶质的来源，源自D-半乳糖醛酸的20-60％单元被甲基酯化。果胶酸盐(胶质化盐)是完全脱酯化的胶质，含有最多20％源自D-半乳糖醛酸的单元。
[0041] 如本文中所用，“角叉菜胶”指可从红海藻中提取的硫酸化半乳聚糖的基团。角叉菜胶是交替连接(1→3)α-D和(1→4)β-D-糖苷键的D-吡喃半乳糖基(galactopyranosyl)单元的直链。角叉菜胶部分地可以通过硫酸化程度和位点来区分。大多数糖单元具有一个或两个与C-2或C-6的碳上的羟基酯化的硫酸酯基团。合适的角叉菜胶包括κ-角叉菜胶、ι-角叉菜胶和κII角叉菜胶以及它们的掺混物。角叉菜胶钠在室温下是可溶的。角叉菜胶可以采用已知技术由低含量的形成凝胶的离子制备。角叉菜胶的凝胶化是热可逆的。高含量的形成凝胶的离子可以提高凝胶的熔化温度。κ-角叉菜胶可产生高刚性凝胶，而ι-角叉菜胶是弹性和顺应性的。κII角叉菜胶是κ-和ι-形式的弱凝胶的共聚物。对特定角叉菜胶的形成凝胶的离子为本领域已知的，包括钾和钙。λ-角叉菜胶在水中不形成凝胶，但是可以用于掺混物，例如，改进制成的凝胶的机械性质。优选的角叉菜胶是ι-角叉菜胶。ι-角叉菜胶具有D-半乳糖-4-硫酸酯-3，6-酐-D-半乳糖-2-硫酸酯的重复单元，提供硫酸酯含量约为25-34％。
[0042] 如本文中所用，“透明质酸”指透明质酸(HA)、其盐和改性的透明质酸盐。透明质酸钠是在所有高级动物的皮肤、关节、眼以及大多数器官和组织的细胞外基质中大量存在的糖胺聚糖。非源自动物的HA可以从非动物来源的兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)透明质酸发酵得到，非动物来源的HA优选用于本发明。透明质酸是由(β-1，4)-连接的D-葡萄糖醛酸(D)和(β-1，3)-N-乙酰基-D-葡糖胺(N)构成的线型共聚物。透明质酸盐的螺旋结构可以截留其重量的约1000倍的水。这些特性使所述分子具有有利的物理化学性质以及独特的生物学功能，这是用作药物递送、组织工程和粘性补充(viscosupplementation)的生物相容和生物相互作用材料的构建材料所需要的。
[0043] 透明质酸或透明质酸盐是哺乳动物的生物体中天然存在的组分，可以通过透明质酸酶进行酶促生物降解。透明质酸盐在内皮组织中的半衰期小于1天，该聚合物在成人体内的自然周转量(natural turnover)约为7克/天。透明质酸盐的温和至适度共价改性会提高体内稳定性，将保留时间从数天提高到数月或者一年。
[0044] 适当改性的透明质酸盐包括含与透明质酸盐共价键合的部分，可以包括例如肽偶联的透明质酸盐。优选改性的透明质酸盐适当地具有分别在D和N单体上的共价改性的羧基和/或羟基。改性的透明质酸盐可以通过选择改性透明质酸盐中的部分以及它们的浓度进行调节，以增添、改性或者改变透明质酸盐的性质或功能，例如交联能力，溶解度，生物降解速率，结合例如特定细胞、药物或肽的能力。
[0045] 发明人相信透明质酸在以下方面发挥重要作用：结缔组织复原的早期和无疤胎儿创伤复原以及调节细胞运动性、粘附和增殖，尤其能用于组织工程和组织再建应用。
[0046] 如本文中所用，术语“相互作用”表示例如通过将凝胶和泡沫体物理互锁而保留在泡沫体孔中的方式，使凝胶与泡沫体物理接触。或者，该相互作用是化学作用，例如通过由形成凝胶的离子形成“桥键”而在泡沫体和多糖之间产生的键合。
[0047] 如本文中所用，术语“位于”表示凝胶基本上位于泡沫体的孔中，例如所述凝胶中的大于50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或99.9％位于泡沫体的孔中。
[0048] 如本文中所用，术语“分布在泡沫体的至少一部分中”表示形成凝胶的离子分布在泡沫体部分中的量足以与凝胶中的至少一部分多糖形成凝胶。较好地，形成凝胶的离子基本上均匀地分布。较好地，形成凝胶的离子存在于泡沫体的至少部分内部孔中而不仅仅是表面孔中。形成凝胶的离子优选基本均匀地分布在泡沫体中。
[0049] 如本文中所用，术语“胶凝位点”指在可以与形成凝胶的离子通过离子键合的相互作用而促进形成凝胶的凝胶、涂层或第一液体组分中的多糖上的官能团。例如，藻酸盐的胶凝位点是能与形成凝胶的离子如钙离子相互作用的羧酸根基团。
[0050] 如本文中所用，术语“改性的藻酸(盐/酯)”包括与有机部分或肽共价键合的藻酸(盐/酯)。例如，藻酸可以与有机部分如环氧烷烃(如环氧乙烷或环氧丙烷)反应，形成藻酸二醇酯。二醇通过羧基与藻酸键合。通常，藻酸与环氧丙烷反应形成藻酸丙二醇酯(PGA)。在以下美国专利中公开了藻酸丙二醇酯的制备：Strong的美国专利第3,948,881号，Pettitt的美国专利第3,772,266号和Steiner的美国专利第2,426,125号。较好地，藻酸丙二醇酯的酯化度约为40-95％，更优选约为70-95％。也可以使用不同分子量的藻酸丙二醇酯的混合物。铝离子适合用于使藻酸二醇酯胶凝。
[0051] 如本文中所用，术语“细胞粘附序列改性的多糖”表示与至少一个包含一个或多个细胞粘附序列的肽共价键合的多糖。例如，肽偶联的多糖可以采用本领域已知的方式制备。例如，在美国专利US 6,642,363(Mooney)中公开了改性藻酸盐。肽偶联的多糖优选用于例如固定细胞以促进细胞增殖和细胞分化。肽偶联的多糖优选与未改性的多糖组合使用。
[0052] 美国专利第4,988,621号，第4,792,525号，第5,965,997号，第4,879,237号，第4,789,734和第6,642,363号(这些专利通过参考结合于本文)公开了许多细胞粘附序列肽的例子。合适的肽包括但不限于含有约小于或等于10个氨基酸的肽。在一些实施方式中，细胞粘附的肽包括：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：2)，REDV(SEQ ID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQID NO：5)，GRGDS(SEQ ID NO：6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ IDNO：8)，RYVVLPR(SEQ ID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ IDNO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：13)，VTCG(SEQ IDNO：14)，SDGD(SEQ ID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20) 和GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22)。在一些实施方式中，细胞粘附肽包括：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：2)，REDV(SEQID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQ ID NO：5)，GRGDS(SEQ ID NO：6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ ID NO：8)，RYVVLPR(SEQ ID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：13)，VTCG(SEQ ID NO：14)，SDGD(SEQ ID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)和GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22)，还包含另外的氨基酸，例如，1-10个额外氨基酸，包括但不限于在N或C末端的
1-10G残基。例如，合适的肽具有通式(Xaa)n-SEQ-(Xaa)n，其中，Xaa是各自独立的任何氨基酸，n＝0-7，SEQ＝选自下组的肽序列：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：
2)，REDV(SEQID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQ ID NO：5)，GRGDS(SEQ ID NO：
6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ ID NO：8)，RYVVLPR(SEQ ID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：
13)，VTCG(SEQ ID NO：14)，SDGD(SEQ ID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)以及GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22，氨基酸总数量小于22，优选小于20，优选小于18，优选小于16，优选小于14，优选小于12，优选小于10。在一些实施方式中，细胞粘附的肽由以下组成：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：2)，REDV(SEQ ID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQ ID NO：5)，GRGDS(SEQID NO：6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ ID NO：8)，RYVVLPR(SEQID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：13)，VTCG(SEQ ID NO：14)，SDGD(SEQID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ IDNO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)和GGGGRGDY(SEQID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22)。用于细胞粘附或其他细胞相互作用的生物活性分子可包括：EGF，VEGF，b-FGF，FGF，TGF，TGF-β或蛋白聚糖。在一些实施方式中，包含RGD的细胞粘附肽的长度可以是3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸。例子包括但不限于：RGD，GRGDS(SEQ ID NO：6)，RGDV(SEQ IDNO：7)，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)和GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)。包含RGD的合适的细胞粘附肽包括但不限于：NOVATACH RGD(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威奥斯陆(FMC BioPolymer，Oslo，Norway))和在美国专利第6,642,363号(其全文参考结合于本文)中公开的那些。从许多公司可以获得肽合成服务，包括公共健康生物技术公司(CommonwealthBiotechnologies，Inc.，美国佛吉尼亚州里士满(Richmond，Virginia，USA))。将肽偶联至藻酸盐主链的化学技术在美国专利第6,642,363号中揭示。
1-10G残基。例如，合适的肽具有通式(Xaa)n-SEQ-(Xaa)n，其中，Xaa是各自独立的任何氨基酸，n＝0-7，SEQ＝选自下组的肽序列：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：
2)，REDV(SEQID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQ ID NO：5)，GRGDS(SEQ ID NO：
6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ ID NO：8)，RYVVLPR(SEQ ID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：
13)，VTCG(SEQ ID NO：14)，SDGD(SEQ ID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)以及GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22，氨基酸总数量小于22，优选小于20，优选小于18，优选小于16，优选小于14，优选小于12，优选小于10。在一些实施方式中，细胞粘附的肽由以下组成：RGD，YIGSR(SEQ ID NO：1)，IKVAV(SEQ ID NO：2)，REDV(SEQ ID NO：3)，DGEA(SEQ ID NO：4)，VGVAPG(SEQ ID NO：5)，GRGDS(SEQID NO：6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO：7)，PDSGR(SEQ ID NO：8)，RYVVLPR(SEQID NO：9)，LGTIPG(SEQ ID NO：10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQID NO：12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO：13)，VTCG(SEQ ID NO：14)，SDGD(SEQID NO：15)，GREDVY(SEQ ID NO：16)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ IDNO：18)，VAPG(SEQ ID NO：19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)和GGGGRGDY(SEQID NO：21)和FTLCFD(SEQ ID NO：22)。用于细胞粘附或其他细胞相互作用的生物活性分子可包括：EGF，VEGF，b-FGF，FGF，TGF，TGF-β或蛋白聚糖。在一些实施方式中，包含RGD的细胞粘附肽的长度可以是3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸。例子包括但不限于：RGD，GRGDS(SEQ ID NO：6)，RGDV(SEQ IDNO：7)，RGDS(SEQ ID NO：11)，RGDF(SEQ ID NO：12)，GRGDY(SEQ ID NO：17)，GRGDSP(SEQ ID NO：18)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO：20)和GGGGRGDY(SEQ ID NO：21)。包含RGD的合适的细胞粘附肽包括但不限于：NOVATACH RGD(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威奥斯陆(FMC BioPolymer，Oslo，Norway))和在美国专利第6,642,363号(其全文参考结合于本文)中公开的那些。从许多公司可以获得肽合成服务，包括公共健康生物技术公司(CommonwealthBiotechnologies，Inc.，美国佛吉尼亚州里士满(Richmond，Virginia，USA))。将肽偶联至藻酸盐主链的化学技术在美国专利第6,642,363号中揭示。
[0053] 如本文中所用，术语“细胞粘附序列改性的藻酸盐”表示与至少一个包含一个或多个细胞粘附序列的肽共价键合的藻酸盐。
[0054] 如本文中所用，术语“细胞粘附序列改性的壳聚糖”表示与至少一个包含一个或多个细胞粘附序列的肽共价键合的壳聚糖。
[0055] 如本文中所用，术语“细胞粘附序列改性的透明质酸盐”表示与至少一个包含一个或多个细胞粘附序列的肽共价键合透明质酸盐。
[0056] 如本文中所用，术语“RGD改性的多糖”表示与至少一个包含一个或多个RGD序列的肽共价键合的多糖。
[0057] 如本文中所用，术语“RGD改性的藻酸盐”表示与包含一个或多个RGD序列的肽共价键合的藻酸盐。合适的RGD肽偶联的藻酸盐包括但不限于：NOVATACHRGD(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威奥斯陆(FMC BioPolymer，Oslo，Norway))和在美国专利第6,642,363号(其完全参考结合于本文)中公开的那些。
[0058] 如本文中所用，术语“RGD改性的壳聚糖”表示与包含RGD的肽共价键合的壳聚糖。
[0059] 如本文中所用，术语“RGD改性的透明质酸盐”表示与包含RGD的肽共价键合的透明质酸盐。
[0060] 如本文中所用，术语“重均分子量”表示通过尺寸排阻色谱与多角度激光器光散射检测(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle LaserLight Scatter Detection(SEC-MALS))测定的分子量。
[0061] 如本文中所用，术语“复合物”可表示其中的各组分可以是相同或不同材料的组合物。
[0062] 如本文中所用，术语“低粘度溶液”相对于第一液体组分指多糖的浓度小于约2％w/v。
[0063] 如在泡沫体中形成凝胶的离子内容中所用，术语“形成凝胶的离子”表示能够与多糖形成凝胶或者不会与凝胶的多糖形成可溶性盐的离子。这些形成凝胶的离子优选是二价离子或二价离子。
[0064] 如在涂层中形成凝胶的离子的内容中所用，术语“形成凝胶的离子”表示能够与藻酸盐、改性藻酸盐或者它们的组合形成凝胶的离子，或者不与藻酸盐、改性藻酸盐或者它们的组合形成可溶性盐的离子。这些形成凝胶的离子优选是钙、锶或钡离子。
[0065] 如本文中所用，术语“完全覆盖”表示涂层覆盖表面，使覆盖物中没有可看到的间隙，或者复合物的免疫原性没有损失。即，将泡沫体完全涂覆至能够在移植该复合物后泡沫体内的凝胶与个体的免疫系统隔离。在一些实施方式中，所述涂层是水凝胶。
[0066] 还应理解，在各实施方式的内容中清楚描述的本发明的一些特征还可以在单一实施方式中组合后提供。与之相对的是，在单一实施方式中简单描述的本发明的各特征还可以单独或者以任何适当的子组合提供。
[0067] 在一个方面，本发明提供一种包含以下组分的复合物：
[0068] i)多孔泡沫体，所述泡沫体包含分布在至少部分泡沫体中的形成凝胶的离子；
[0069] ii)包含具有胶凝位点的多糖的凝胶，其中所述凝胶位于泡沫体孔内并与泡沫体相互作用；和
[0070] iii)包含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子的涂层，其中，所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
[0071] 较好地，所述复合物中的凝胶具有用于其预定用途的优良结构整体性，例如，除非需要，所述凝胶不会从泡沫体中渗出。可使用该组合物承载功能组分，例如药物和细胞群体，提供需要的递送特性，例如释放待释放的材料。所述释放可以任何适当方式引发，例如通过与溶剂接触，通过温度变化或者通过机械操作。该复合物可有利地用于固定细胞。本发明用于治疗人或动物体的复合物的组分应是生物相容并任选是可生物降解的。
[0072] 因为在添加的含有具有胶凝位点的形成凝胶的多糖液体与泡沫体的胶凝离子之间的相互作用，在泡沫体孔内形成凝胶。泡沫体孔中存在的胶凝离子(i)诱发形成凝胶的多糖(ii)的胶凝。在孔内形成凝胶，并且凝胶/泡沫体的组合组分上覆盖有涂层，以形成抵抗免疫侵袭的阻挡层。
[0073] 在一些实施方式中，复合物的弹性模量为0.1-1000kPa。
[0074] 在一些实施方式中，复合物具有两个侧面，每个侧面的面积约为1厘米2。在一些2
实施方式中，复合物具有两个侧面，每个侧面的面积约为0.5-2厘米 。在一些实施方式中，复合物的宽度约为0.5-3.0毫米。在一些实施方式中，复合物的宽度约为0.5-2.0毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为1毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为0.5-2毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为0.5-3毫米。
实施方式中，复合物具有两个侧面，每个侧面的面积约为0.5-2厘米 。在一些实施方式中，复合物的宽度约为0.5-3.0毫米。在一些实施方式中，复合物的宽度约为0.5-2.0毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为1毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为0.5-2毫米。在一些实施方式中，泡沫体的宽度约为0.5-3毫米。
[0075] 在一些实施方式中，泡沫体包含聚合物。在一些实施方式中，泡沫体包含生物聚合物。在一些实施方式中，泡沫体包含多糖。在一些实施方式中，泡沫体包含选自下组的聚合物：藻酸盐、胶质、角叉菜胶、透明质酸盐、壳聚糖、细胞粘附序列改性的多糖、RGD改性的藻酸盐以及它们的组合。
[0076] 合适的泡沫体包括具有开孔网络的那些泡沫体，所述开孔网络的孔径优选为5-1000微米，25-1000微米，更优选在25-500微米范围，能够将添加的包含多糖的液体组分吸收到其孔中。在一些实施方式中，泡沫体的平均孔径约为50-250微米。适合用于本发明的泡沫体在至少一个表面上具有开孔，优选具有至少一部分的互连孔，能够将吸收的多糖转移到泡沫体内和/或有效增加被泡沫体吸收的液体组分的体积。
[0077] 泡沫体可适当溶胀，优选可吸收最多为其重量的30倍，更优选1-20倍的液体，例如，生理水溶液或多糖溶液。泡沫体可具有均匀或不均匀的孔径分布。不要求所有的孔都吸收液体组分。
[0078] 在一些实施方式中，泡沫体可吸收其重量的1-30倍的液体，所述液体选自下组：水、生理溶液、可溶性多糖溶液和包含功能组分的多糖溶液。
[0079] 在一些实施方式中，所述复合物或泡沫体是已灭菌的。在一些实施方式中，泡沫体经过灭菌处理。在一些实施方式中，所述灭菌处理包括γ射线-辐照，E-束辐射，环氧乙烷，高压灭菌或在添加液体组分或与NOx气体接触之前使泡沫体与醇类接触，氢气等离子体灭菌。当灭菌会对复合物或者复合物中包含的功能组分产生负面影响时不应进行灭菌。
[0080] 泡沫体优选是干燥的吸收剂泡沫体。干燥的吸收剂泡沫体具有开孔网络和孔以及包含使随后添加的多糖溶液胶凝的形成凝胶的离子，该干燥的吸收剂泡沫体可采用包括以下步骤的方法形成：
[0081] a)由包含多糖和发泡剂以及任选的增塑剂、交联剂和pH调节剂中的一种或多种的的含水分散体或水溶液形成湿泡沫体；
[0082] b)任选通过机械搅拌，混合来自含水分散体的泡沫体；
[0083] c)任选进行以下步骤i)-ii)中的一个或者多个：
[0084] i)将泡沫体模塑或成形；和
[0085] ii)由该泡沫体形成交联的泡沫体；
[0086] d)干燥该泡沫体，形成干燥的含开孔的泡沫体；和
[0087] e)在步骤a)至d)的一个或多个步骤中或者在步骤d)之后添加形成凝胶的离子。
[0088] 在特别优选的实施方式中，在步骤a)添加形成凝胶的离子，使所述形成凝胶的离子基本均匀地分布在整个泡沫体中。
[0089] 可以使用降低或提高pH的已知pH调节剂和增塑剂，例如在WO2005023323中所述的那些。
[0090] 泡沫体可以采用空气干燥方式进行干燥，需要时可以进行模塑、成形或压缩。
[0091] 泡沫体优选使用单一的泡沫体形成，或者由包含不同密度和孔径的泡沫体，泡沫区域和非泡沫区域的不均匀结构形成。
[0092] 泡沫体中的聚合物可以是可离子交联或共价交联的，但不一定是可交联的，只要凝胶的多糖能与泡沫体中的聚合物或者泡沫体中的组分例如形成凝胶的离子发生交联。
[0093] 在一些实施方式中，所述泡沫体的聚合物是生物聚合物。在优选的实施方式中，泡沫体由源自植物或动物的生物聚合物形成。这类泡沫体可按照现有技术方法形成，例如在以下文献中描述的方法形成：美国专利第5,888,987号(Hayes)或WO2005023323(Gaserod)，美国专利第6,203,845号(Qin)或美国专利第6,656,974号(Renn)，这些文献的全文通过参考结合于本文。
[0094] 在一些实施方式中，用于形成泡沫体基质的聚合物包括能被形成凝胶的离子导致胶凝的多糖。在优选的实施方式中，泡沫体包含已交联的生物聚合物，任选包含发泡剂，例如在WO2005023323中所述。
[0095] 泡沫体优选包含多糖和/或改性的多糖。
[0096] 在一些实施方式中，泡沫体中的聚合物选自下组：藻酸盐、胶质、角叉菜胶、透明质酸盐、壳聚糖以及它们的组合。在一些实施方式中，聚合物选自下组：藻酸盐、壳聚糖和透明质酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括藻酸盐或改性的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括藻酸盐。
[0097] 在一些实施方式中，聚合物是细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，聚合物选自下组：细胞粘附序列改性的藻酸盐、细胞粘附序列改性的壳聚糖，细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，聚合物包括细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，聚合物包括细胞粘附序列改性的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括细胞粘附序列改性的壳聚糖。在一些实施方式中，聚合物包括细胞粘附序列改性的透明质酸盐。
[0098] 在一些实施方式中，聚合物是RGD改性的多糖，在一些实施方式中，聚合物选自下组：RGD改性的多糖、RGD改性的藻酸盐、RGD改性的壳聚糖、细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，聚合物包括RGD改性的多糖。在一些实施方式中，聚合物包括RGD改性的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括RGD改性的壳聚糖。在一些实施方式中，聚合物包括RGD改性的透明质酸盐。
[0099] 在一些实施方式中，聚合物的平均分子量约为4-300kDa。在一些实施方式中，聚合物的平均分子量约为10-500kDa。在一些实施方式中，聚合物的平均分子量约为50-300kDa。
[0100] 在一些实施方式中，聚合物包括平均分子量约为4-300kDa的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括平均分子量约为10-500kDa的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物包括平均分子量约为50-300kDa的藻酸盐。
[0101] 在一些实施方式中，聚合物包括古罗糖醛酸盐(guluronate)(G)含量大于20％的藻酸盐。
[0102] 在一些实施方式中，泡沫体包含藻酸盐，复合物进一步包含选自药物活性剂和/或抗粘附剂的功能组分。
[0103] 在一些实施方式中，泡沫体进一步包含与泡沫体接触的结构支承体，特别是可渗过的结构支承体例如网状物。合适的网状材料包括但不限于聚酯网状物。泡沫体可以多种方式结合在单层或双层泡沫构形中。在一些实施方式中，可将网状物以单层构形置于泡沫体的表面上，然后形成凝胶。凝胶将有助于保持网状物定位。在添加涂层期间形成结构。在一些实施方式中，将湿泡沫体置于放置在模具中的网状物顶部，然后干燥。在一些实施方式中，在干燥之前将所述网状物置于湿泡沫体的顶部。在一些实施方式中，模塑一层湿泡沫体，在该湿泡沫体顶部添加网状物，然后用另一层湿泡沫体覆盖。当采用双层构形时，两种泡沫体的组成可以相同或不同。双层构形的两个泡沫体的组成无论是相同或者是不同，可具有彼此相同或不同的孔径。或者，结构支承体与泡沫体间接接触，例如，通过粘附到在泡沫体上面的涂层上，或者粘附到与泡沫体粘连的另一种材料上。
[0104] 在一些实施方式中，网状物的网孔约为10微米至1毫米。在一些实施方式中，网状物的网孔约为20-500微米。在一些实施方式中，网状物的网孔约为300微米。
[0105] 通过包含网状物可以增强泡沫基质的结构整体性，并使泡沫体易于移植和在移植后易于取出。
[0106] 多孔泡沫体可以采用本领域的任何已知方法制备，包括但不限于：机械搅拌，冷冻-干燥，织造、编织或层铺纤维。较好地，泡沫体适合使用混合器制备，例如厨房用混合器，装备有搅打器，以对聚合物水溶液充气，用于和其他组分例如增塑剂(例如甘油和山梨醇)一起制备泡沫体。
[0107] 发泡剂可以包含在水性分散体中以帮助发泡。存在发泡剂时，发泡剂适当产生能抗泡沫塌陷的湿泡沫体。发泡剂可以是有助于发泡的单一材料或者材料的混合物。发泡剂可以是聚合物发泡剂、表面活性剂或它们的混合物。
[0108] 一般优选聚合物发泡剂例如表面活性的水状胶体用于大多数生物应用，因为水状胶体与表面活性剂相比较难从产生的胶凝化泡沫体浸出。表面活性的水状胶体的例子包括：甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基丙基纤维素(HPC)、羟基乙基纤维素(HEC)、白蛋白和二醇藻酸，例如丙二醇藻酸。对某些应用，除了发泡剂外加入另外的多糖，例如纤维素衍生物(如羧甲基纤维素)将是有益的。聚合物发泡剂优选是溶解于水的，使得能够形成均匀的胶凝泡沫体。优选的水溶性发泡剂包括白蛋白和羟基丙基甲基纤维素，因为这类发泡剂产生小起泡，因而在泡沫体中产生小孔。
[0109] 将高钙含量的干燥、交联的泡沫体浸在水中时，泡沫体结构因为其高度交联的结构通常不会发生破裂。但是，泡沫体中可溶性组分包括水溶性发泡剂如羟基丙基甲基纤维素可能扩散到泡沫体以外。例如在创伤复原的应用中通过使用在使用条件下不溶的发泡剂可以防止发泡剂的这种损失。一些发泡剂在体温条件形成凝胶，例如甲基纤维素在高于35℃的温度形成凝胶。在使用包含甲基纤维素作为发泡剂的泡沫体的应用中，泡沫体处于体温条件下，甲基纤维素将保持胶凝态并保留在泡沫体中，有助于泡沫体的湿强度。
[0110] 当使用聚合物发泡剂如羟丙基甲基纤维素时，聚合物发泡剂在水性分散体中的浓度通常约为0.5-6重量％，优选约为1-4重量％，更优选约为1.5-2重量％。这种方式产生的泡沫体包含约3-37重量％，优选约6-25重量％，更优选约6-12.5重量％的聚合物发泡剂，不包括存在于泡沫体中的水和任何一种或多种添加剂。
[0111] 对特定应用，可以使用表面活性剂与聚合物发泡剂或仅表面活性剂作为发泡剂。表面活性剂为本领域技术人员皆知，例如在McCutcheon’s Detergentsand Emulsifiers和Laughlin的美国专利第3,929,678号(其完全参考结合于本文)中描述。非离子型表面活性剂通常是疏水性有机脂族或烷基芳香族化合物和亲水性环氧乙烷和/或环氧丙烷的缩合产物。可以调节产生的聚醚链长度，以达到在疏水性和亲水性之间的所需平衡。非离子型表面活性剂包括，例如在直链或支链烷基包含约8-18个碳原子的烷基苯酚(例如，叔辛基苯酚和叔壬基苯酚)与约5-30摩尔环氧乙烷的乙氧基化产物，例如与约9.5摩尔环氧乙烷缩合的壬基苯酚、与12摩尔环氧乙烷缩合的二壬基苯酚；乙氧基化和丙氧基化醇，特别是C10-20醇，每摩尔醇与2-100摩尔的环氧乙烷和/或环氧丙烷，特别是在直链或支链构形中包含约8-18个碳原子的伯醇与5-30摩尔环氧乙烷的乙氧基化物，例如癸醇、鲸蜡醇、月桂醇或肉豆寇醇的乙氧基化物；在直链或支链构形中包含约8-18个碳原子仲脂族醇与5-30摩尔环氧乙烷的乙氧基化物；含8-20个碳原子的脂族醇与环氧乙烷和环氧丙烷的缩合产物；
聚乙二醇和聚环氧乙烷；乙氧基化蓖麻油( CO 40)；乙氧基化氢化蓖麻油；
乙氧基化椰子油；乙氧基羊毛脂；乙氧基化妥尔油；乙氧基化牛油醇；山梨醇酯的乙氧基化物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯( 20)，聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯(
40)，聚氧乙烯山梨醇单硬脂酸酯( 60)，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯( 80)
和聚氧乙烯山梨醇三油酸酯( 85)。对身体应用例如创伤敷料，当干燥的胶凝泡沫体中包含表面活性剂时，优选非离子型表面活性剂，例如山梨醇酯的乙氧基化物。阴离子型表面活性剂的例子是硬脂酸钠、鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵、月桂基硫酸三乙醇胺、肉豆蔻基硫酸钠和硬脂基硫酸钠、十二烷基苯磺酸三乙醇胺、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠和聚氧乙烯月桂基醚硫酸铵。优选的阴离子表面活性剂是月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠)。阳离子表面活性剂包括例如季铵盐，例如鲸蜡基溴化三甲铵，月桂基氯化三甲基铵，氯化烷基苄基甲铵，溴化烷基苄基二甲铵，鲸蜡基溴化吡啶鎓，季胺化聚氧乙基烷基胺的卤化物盐。也可以使用两性表面活性剂。
聚乙二醇和聚环氧乙烷；乙氧基化蓖麻油( CO 40)；乙氧基化氢化蓖麻油；
乙氧基化椰子油；乙氧基羊毛脂；乙氧基化妥尔油；乙氧基化牛油醇；山梨醇酯的乙氧基化物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯( 20)，聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯(
40)，聚氧乙烯山梨醇单硬脂酸酯( 60)，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯( 80)
和聚氧乙烯山梨醇三油酸酯( 85)。对身体应用例如创伤敷料，当干燥的胶凝泡沫体中包含表面活性剂时，优选非离子型表面活性剂，例如山梨醇酯的乙氧基化物。阴离子型表面活性剂的例子是硬脂酸钠、鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸铵、月桂基硫酸三乙醇胺、肉豆蔻基硫酸钠和硬脂基硫酸钠、十二烷基苯磺酸三乙醇胺、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠和聚氧乙烯月桂基醚硫酸铵。优选的阴离子表面活性剂是月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠)。阳离子表面活性剂包括例如季铵盐，例如鲸蜡基溴化三甲铵，月桂基氯化三甲基铵，氯化烷基苄基甲铵，溴化烷基苄基二甲铵，鲸蜡基溴化吡啶鎓，季胺化聚氧乙基烷基胺的卤化物盐。也可以使用两性表面活性剂。
[0112] 当表面活性剂与聚合物发泡剂一起使用时，有用的表面活性剂是山梨醇酯，例如20表面活性剂。当表面活性剂例如 20表面活性剂与聚合物发泡剂一起
使用时，干燥的胶凝泡沫体可包含约0.05-1.0重量％，通常0.1-0.5重量％的表面活性剂。
但是，对特定应用，例如口腔护理应用，使用表面活性剂，例如月桂基硫酸钠，但不使用聚合物发泡剂，干燥的胶凝泡沫体包含约0.5-5.0重量％，通常1.5-3.0重量％的表面活性剂，不包括存在于泡沫体中的水和一种或多种添加剂例如氧化硅或其他磨料或研磨剂。
使用时，干燥的胶凝泡沫体可包含约0.05-1.0重量％，通常0.1-0.5重量％的表面活性剂。
但是，对特定应用，例如口腔护理应用，使用表面活性剂，例如月桂基硫酸钠，但不使用聚合物发泡剂，干燥的胶凝泡沫体包含约0.5-5.0重量％，通常1.5-3.0重量％的表面活性剂，不包括存在于泡沫体中的水和一种或多种添加剂例如氧化硅或其他磨料或研磨剂。
[0113] 用于形成凝胶的合适多糖包括能溶解于溶剂例如水中，并能通过与形成凝胶的离子的相互作用形成凝胶的那些多糖。合适的多糖的例子包括：藻酸盐、胶质、角叉菜胶、壳聚糖、透明质酸盐以及它们的混合物，只要单独的多糖或其与另一种多糖的混合物可以形成凝胶。藻酸盐和改性的藻酸盐是优选用于本发明的多糖。改性的多糖，也称作多糖衍生物可用于本发明的应用中，只要这些多糖能与形成凝胶的离子反应。
[0114] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖选自下组：藻酸盐、壳聚糖、角叉菜胶、透明质酸盐、胶质以及它们的组合。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖选自下组：藻酸盐、壳聚糖和透明质酸盐。
[0115] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖是细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖选自下组：细胞粘附序列改性的藻酸盐、细胞粘附序列改性的壳聚糖、细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括细胞粘附序列改性的藻酸盐。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括细胞粘附序列改性的壳聚糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括细胞粘附序列改性的透明质酸盐。
[0116] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖是RGD改性的多糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖选自下组：RGD改性的藻酸盐、RGD改性的壳聚糖、细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括RGD改性的多糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括RGD改性的藻酸盐。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括RGD改性的壳聚糖。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括RGD改性的透明质酸盐。
[0117] 在一些实施方式中，所述凝胶或所述涂层中的泡沫体和/或多糖包含超纯多糖，其内毒素含量很低。在一些实施方式中，在所述凝胶或所述涂层中的泡沫体和/或多糖包含内毒素含量小于100EU/g的藻酸盐。
[0118] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包括藻酸盐。
[0119] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含G含量约为20-80％的藻酸盐。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含M含量至少为20％的藻酸盐。
[0120] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含平均分子量约为4-1000kD，约4-500kD，或者约4-300kD的藻酸盐。
[0121] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含粘度约为10-200mPas的藻酸盐。在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含粘度约为2-500mPas的藻酸盐。
[0122] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖选自藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸盐、胶质以及它们的组合；在所述泡沫体中的形成凝胶的离子选自钙离子、钡离子、锶离子或它们的组合。
[0123] 在一些实施方式中，所述凝胶中的多糖包含壳聚糖，所述泡沫体中的形成凝胶的离子选自下组：三磷酸根离子、磷酸根离子、柠檬酸根离子或者它们的组合。
[0124] 存在复合物的涂层，使得泡沫体的外表面(包括在泡沫体表面上的任何凝胶)被该涂层完全覆盖。虽然不希望受到特定理论的束缚，但本发明人相信，所述涂层是免疫防护(immunoprotective)的并能降低纤维化的可能性。
[0125] 在一些实施方式中，所述涂层的多糖包括壳聚糖、透明质酸盐或藻酸盐。
[0126] 在一些实施方式中，所述涂层中的多糖是细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖选自下组：细胞粘附序列改性的藻酸盐、细胞粘附序列改性的壳聚糖、细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖包括细胞粘附序列改性的多糖。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖包括细胞粘附序列改性的藻酸盐。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖包括细胞粘附序列改性的壳聚糖。在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括细胞粘附序列改性的透明质酸盐。
[0127] 在一些实施方式中，所述涂层中的多糖是RGD改性的多糖。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖选自下组：RGD改性的藻酸盐、RGD改性的壳聚糖、细胞粘附序列改性的透明质酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括RGD改性的多糖。在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括RGD改性的藻酸盐。在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括RGD改性的壳聚糖。在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括RGD改性的透明质酸盐。
[0128] 在一些实施方式中，涂层包含重均分子量约为4-300kD的藻酸盐。在一些实施方式中，涂层包含重均分子量约为50-300kD的藻酸盐。在一些实施方式中，涂层包含重均分子量约为150-250kD的藻酸盐。在一些实施方式中，涂层包含重均分子量约为75-150kD的藻酸盐。在一些实施方式中，聚合物的重均分子量约为50-300kD，约为150-250kD，或者约为75-150kD。
[0129] 在一些实施方式中，涂层包含藻酸盐，该藻酸盐的甘露糖醛酸盐(mannuaronate)与古罗糖醛酸盐的比值约大于或等于1。
[0130] 在一些实施方式中，涂层包含源自macrocystitis purifera的藻酸盐。
[0131] 在一些实施方式中，涂层包含选自下组的藻酸盐：PRONOVA SLM100或SLM20(NovaMatrix，FMC公司，挪威奥斯陆)。
[0132] 在一些实施方式中，涂层包含改性的藻酸盐，其中，所述改性的藻酸盐包含至少一个藻酸链部分，通过共价键合至少一个含一个或多个RGD序列的细胞粘附肽。
[0133] 可以使用能提供所需的形成凝胶的离子或者形成凝胶的离子的混合物的一种盐或盐的组合作为形成凝胶的离子。用于形成凝胶或涂层的合适的形成凝胶的离子包括单价离子和多价离子，优选二价和/或三价离子，或者能与多糖形成凝胶或者不能与多糖形成可溶性盐的离子的混合物。用于特定多糖的形成凝胶的离子可从文献中了解。对藻酸盐，适当的多价阳离子包括例如，钙(2+)、钡(2+)、锶(2+)、铁(2+)、锌(2+)、铜(2+)和铝(3+)。优选的阳离子是二价金属阳离子，更优选钙(2+)阳离子。认为单价阳离子例如钾是不适合于藻酸盐的胶凝离子，因为藻酸钾是一种可溶性藻酸盐；但是，钾阳离子可以是用于κ-角叉菜胶或κ-II角叉菜胶的合适胶凝离子。当多糖盐是带正电荷例如壳聚糖时，可以使用带负电荷的形成凝胶的离子，例如，磷酸根或柠檬酸根。在一些实施方式中，形成凝胶的离子包括磷酸根或柠檬酸根，其中凝胶中的多糖是壳聚糖。
[0134] 在一些实施方式中，所述涂层中的多糖选自藻酸盐、透明质酸盐以及它们的组合；所述泡沫体中形成凝胶的离子选自下组：钙离子、钡离子、锶离子以及它们的组合。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖选自藻酸盐、透明质酸盐以及它们的组合；所述涂层中形成凝胶的离子各自独立地选自下组：锶离子、钡离子、钙离子以及它们的组合。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖选自藻酸盐、透明质酸盐以及它们的组合；所述涂层中形成凝胶的离子各自独立地选自下组：锶离子、钙离子以及它们的组合。
[0135] 在一些实施方式中，所述涂层中的多糖是藻酸盐；所述泡沫体中形成凝胶的离子选自下组：钙离子、钡离子、锶离子或它们的组合。在一些实施方式中，所述涂层中的多糖是藻酸盐；所述涂层中形成凝胶的离子各自独立地选自下组：锶离子、钡离子、钙离子以及它们的组合。在一些实施方式中所述涂层中的多糖是藻酸盐；所述涂层中形成凝胶的离子各自独立地选自下组：锶离子、钙离子以及它们的组合。
[0136] 在一些实施方式中所述涂层中的多糖包括壳聚糖；所述泡沫体中形成凝胶的离子选自选自下组：三磷酸根离子、磷酸根离子、柠檬酸根离子或者它们的组合。
[0137] 在一些实施方式中，涂层包含约0.2-10％w/v，0.5-10％w/v，1-8％w/v，2-7％w/v，3-6％，或者2-6％w/v的具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，所述第二液体组分的多糖包含约3％w/v具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v的PRONOVA SLM20(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v PRONOVA SLM100(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。
[0138] 在一些实施方式中，涂层包含约0.2-10％w/v，约0.5-10％w/v，1-8％w/v，约2-7％，约3-6％，或者约2-6％w/v的藻酸盐，细胞序列改性的藻酸盐、或者它们的组合。在一些实施方式中，所述第二组分的多糖包含约3％w/v藻酸盐、细胞序列改性的藻酸盐以及它们的组合。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v藻酸盐、细胞序列改性的藻酸盐或者它们的组合。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v PRONOVA SLM20(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。在一些实施方式中，涂层包含约5％w/v PRONOVA SLM100(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。
[0139] 形成凝胶的离子能够与泡沫体的聚合物和/或多糖形成凝胶。形成凝胶的离子可以在泡沫体和可溶性多糖之间形成键合。较好地，泡沫体中“形成凝胶的离子”能供给多糖，并以一定含量存在于泡沫体中使得液体组分与泡沫体接触后占据多糖的至少一部分的胶凝位点。适当地，相对于键合形成凝胶的离子的位点，形成凝胶的离子可以以亚化学计量量、化学计量量或超化学计量量存在于泡沫体中，只要存在足够形成凝胶的离子来占据添加的多糖中至少一部分的胶凝位点即可。
[0140] 在一个实施方式中，形成凝胶的离子不能与泡沫体的聚合物形成凝胶。
[0141] 在另一个方面，泡沫体包含相对于可溶性多糖中胶凝位点为过量的形成凝胶的离子。在添加可溶多糖之前，至少一部分的形成凝胶的离子可结合到泡沫体，然后通过与泡沫体结构中形成凝胶的离子的相互作用发生胶凝。在一些实施方式中，泡沫体包含相对于可溶多糖中的胶凝位点不过量的形成凝胶的离子。
[0142] 可以控制形成凝胶的离子在泡沫体或涂层中的浓度，以使制成的凝胶或涂层包含具有未与形成凝胶的离子完全反应的胶凝位点的多糖或藻酸盐；即，形成凝胶的离子或者形成凝胶的离子的混合物的存在量小于使100％的多糖胶凝位点饱和所需的摩尔量。例如，当存在足够的形成凝胶的离子如钙离子与可得到的所有胶凝位点(如，在藻酸盐情况的L-古洛糖醛酸单元，在胶质物质情况的D-半乳糖醛酸单元)反应的时候，形成凝胶的多糖或藻酸盐被100％饱和。发明人认为使藻酸盐的凝胶位点完全饱和所需的阳离子量如下：在胶凝时只使用二价阳离子或者只使用三价阳离子时，为1摩尔二价阳离子/2摩尔藻酸盐中L-古洛糖醛酸，或者1摩尔三价阳离子/3摩尔藻酸盐中L-古洛糖醛酸。当使用一种或多种二价阳离子和一种或多种三价阳离子的混合物时，因为二价阳离子占据两个胶凝位点，三价阳离子占据三个胶凝位点，因此可以确定使藻酸盐饱和所需的量。因此，可以认为小于该量是小于使藻酸盐的胶凝位点完全饱和所需的量。适当地，在泡沫体中存在的形成凝胶的离子量应足以饱和约5-250％，优选5-200％，更优选约35-150％，最优选约5-100％的多糖胶凝位点。
[0143] 泡沫体本身可以使用多糖制备，并且还需要形成凝胶的离子。在泡沫体和多糖都依赖于相同的形成凝胶的离子的情况，单独的泡沫体在制备时具有最初的饱和度，例如150％，但是，当添加为液体的另外多糖且该多糖被吸收到泡沫体的孔中时，使用某些形成凝胶的离子来使添加的多糖胶凝。在这种情况，可根据形成凝胶的离子的总量以及对泡沫体中多糖以及添加的在孔中形成凝胶的多糖的胶凝位点总量，计算添加的多糖的饱和度。
[0144] 在一些实施方式中，所述泡沫体中存在的形成凝胶的离子的摩尔量等于所述凝胶的所述多糖的胶凝位点的至少10％。在一些实施方式中，所述泡沫体中存在的形成凝胶的离子的摩尔量等于所述凝胶的所述多糖的所述胶凝位点的5-250％。在一些实施方式中，在所述泡沫体中形成凝胶的离子包括钙离子，其摩尔量等于所述凝胶的所述多糖的所述胶凝位点的5-200％。在一些实施方式中，在所述泡沫体中的形成凝胶的离子包括锶离子，其存在的摩尔量等于所述凝胶的所述多糖的所述胶凝位点的至少5％至200％。在一些实施方式中，在所述泡沫体中形成凝胶的离子包括钡离子，其摩尔量等于所述凝胶的所述多糖的所述胶凝位点的至少5％至200％。
[0145] 对于藻酸盐，通过藻酸盐与多价阳离子反应形成的凝胶的强度与藻酸盐的分子量、藻酸盐的古洛糖醛酸含量(“G含量”)以及古洛糖醛酸和甘露糖醛酸在聚合物链上的排列相关。此外，泡沫体的孔径和厚度、藻酸盐浓度、形成凝胶离子的量和使用的离子类型也对强度有影响。藻酸盐用于凝胶的G含量适当地至少约为30％，优选约40-90％，更优选约50-80％。源自例如褐藻(Lessoniatrabeculata)和极北海带的茎的藻酸盐具有高G含量，可优选用来形成本发明的胶凝的泡沫体。高G含量的完全饱和的藻酸盐得到的凝胶具有最高机械强度。
[0146] 根据形成一个离子交联需要2个古洛糖醛酸加1个二价阳离子，可以计算各种类型藻酸盐与这些G-嵌段化学计量量反应所需的二价阳离子如钙离子的量。下表列出1％藻酸钠溶液化学计量量饱和所需的钙量：
[0147]海藻源 ％G mM Ca
极北海带(茎) 70 14-16
极北海带(叶) 54 11-13
褐藻(Lessonia trabeculata) 68 13-15
巨藻 39 8-9
极北海带(茎) 70 14-16
极北海带(叶) 54 11-13
褐藻(Lessonia trabeculata) 68 13-15
巨藻 39 8-9
[0148] 所列的商业可得的各种藻酸盐，其性质和来源可在Shapiro的美国专利第6,334,968号，表1，第16栏第49行至第17栏第18行描述，该专利可完全参考结合于本文。
可以使用藻酸盐的混合物，例如不同分子量和/或G含量作为形成凝胶的聚合物。
可以使用藻酸盐的混合物，例如不同分子量和/或G含量作为形成凝胶的聚合物。
[0149] 当组合物包含1摩尔二价阳离子/2摩尔L-古洛糖醛酸单元时，胶凝位点完全饱和(100％饱和)。例如，使从极北海带的茎提取的1％藻酸钠溶液达到100％饱和需要约15mM钙离子溶液，使从极北海带的叶提取的1％藻酸钠溶液达到100％饱和需要约12mM钙溶液，使从褐藻(Lessonia trabeculata)提取的1％藻酸钠溶液达到100％饱和需要约14mM钙离子溶液。因此，当使用藻酸盐作为形成凝胶或形成涂层的聚合物时，对藻酸盐中存在的每2mM L-古洛糖醛酸单元，形成凝胶的组合物优选包含0.2-0.9mM二价阳离子，优选
20-90％钙(2+)离子。当使用较低溶解性的盐作为形成凝胶的离子时，通过控制在胶凝时存在的胶凝剂例如碳酸钙量和/或溶解剂例如pH调节剂(葡糖酸δ-内酯)量可以控制交联程度。较好地，在pH调节剂和胶凝剂之间应是化学计量关系，使得可以得到基本上所有形成凝胶的离子。
20-90％钙(2+)离子。当使用较低溶解性的盐作为形成凝胶的离子时，通过控制在胶凝时存在的胶凝剂例如碳酸钙量和/或溶解剂例如pH调节剂(葡糖酸δ-内酯)量可以控制交联程度。较好地，在pH调节剂和胶凝剂之间应是化学计量关系，使得可以得到基本上所有形成凝胶的离子。
[0150] 当凝胶或涂层上多糖或藻酸盐的胶凝位点没有全部被形成凝胶的离子饱和时，剩余的位点被非交联性离子占据。需要时，可以使用活性离子，例如Ag(1+)阳离子来占据部分或者全部剩余的位点。Scherr的U.S.2003/0021832 A1公开可以使用藻酸银用来处理烧伤、创口、溃疡伤口以及相关的病理症状。
[0151] 含多糖的凝胶或第一液体组分还包含功能组分，该组分适当设置例如被截留在多糖凝胶中。可以加入任何功能组分，只要该组分不会阻止第一液体组分被吸收到泡沫体中或者阻止多糖形成凝胶。功能组分可以是液体或固体，如果是不溶性的，可将其以细粒分散在液体中。设置在凝胶中的有利组分包括：有益制剂，例如调味剂，芳香剂，药物和兽药，酶，生长改进剂和前生命学(probiotics)，活细胞包括植物细胞、动物细胞和人细胞，干醇母，细菌等。结合药物、微粒、细胞、多细胞聚集体、组织等需要在多糖(优选藻酸盐)溶液中进行温和搅拌。所述组分可包括热敏材料，例如细胞，药物，调味剂或芳香剂，需要时它们可以稍后从凝胶释放。
[0152] 在一些实施方式中，凝胶进一步包含功能组分。在一些实施方式中，所述功能组分选自下组：调味剂，芳香剂，微粒，细胞，多细胞聚集体，治疗剂，组织再生剂，生长因子，营养制品以及它们的组合。在一些实施方式中，凝胶对所述功能组分为惰性或能稳定所述功能组分。
[0153] 在一些实施方式中，凝胶还包含细胞。适合用于本文所述的复合物的各种细胞为细胞移植领域的技术人员所易于理解。适当的细胞(自体的，同种基因，异种基因的)包括例如，肝细胞，所有类型的干细胞，产生胰岛素细胞包括源自任何来源的干细胞的细胞(如，胰岛细胞，分离的抑酞酶β细胞，胰岛瘤细胞等)，产生内分泌激素(如，甲状旁腺，甲状腺，肾上腺等)细胞以及能分泌治疗剂的任何遗传工程细胞，例如用于治疗疾病或其他病症的蛋白质或激素，以及分泌诊断剂的遗传工程细胞。在一些实施方式中，凝胶包含胰岛细胞，肝细胞，神经细胞，血管内皮细胞，甲状旁腺细胞，甲状腺细胞，肾上腺细胞，胸腺细胞，间质干细胞和卵巢细胞。在一些实施方式中，凝胶包含选自下组的细胞：胰岛细胞，间质干细胞，甲状旁腺细胞和甲状腺细胞。在一些实施方式中，凝胶包含选自下组的制备：胰岛细胞和甲状旁腺细胞。在一些实施方式中，凝胶包含胰岛细胞。在一些实施方式中，凝胶包含遗传改性的间质干细胞以表达生长因子或凝结因子VIII。在一些实施方式中，凝胶包含间质干细胞。在一些实施方式中，凝胶还包含细胞，只要所述细胞不是胚胎干细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包括本文所述的任何形成的组织。
[0154] 在一些实施方式中，凝胶进一步包含胰岛细胞。在一些实施方式中，凝胶进一步包含源自人、成熟猪或新生猪的胰岛细胞。在一些实施方式中，凝胶进一步包含约20,000-40,000胰岛细胞。
[0155] 在一些实施方式中，细胞包括源自人或者猪的细胞。在一些实施方式中，细胞包括源自人、新生猪或成熟猪的细胞。在一些实施方式中，细胞包括源自人的细胞。在一些实施方式中，细胞包括源自新生猪或成熟猪的需。在一些实施方式中，细胞包括源自新生猪的细胞。在一些实施方式中，细胞包括源自成熟猪的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自人或猪的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自人、新生猪或成熟猪的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自人的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自新生猪或成熟猪的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自新生猪的细胞。在一些实施方式中，胰岛细胞包括源自成熟猪的细胞。
[0156] 存在功能组分时，根据复合物的预定用途选择所述功能组分。
[0157] 在一些实施方式中：
[0158] i)所述泡沫体中的所述聚合物选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；
[0159] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子包括多价阳离子；
[0160] iii)所述凝胶中的所述多糖选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；和
[0161] iv)所述涂层中的所述形成凝胶的离子包括多价阳离子。
[0162] 在一些实施方式中：
[0163] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合：
[0164] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0165] iii)所述凝胶中的所述多糖选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；和
[0166] iv)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合。
[0167] 在一些实施方式中：
[0168] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0169] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0170] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0171] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；和
[0172] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合。
[0173] 在一些实施方式中：
[0174] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0175] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0176] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0177] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；和
[0178] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合。
[0179] 在一些实施方式中：
[0180] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0181] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0182] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0183] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；和
[0184] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合。
[0185] 在一些实施方式中：
[0186] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0187] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子是钙离子；
[0188] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0189] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；和
[0190] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子是钙离子。
[0191] 在一些实施方式中：
[0192] i)所述泡沫体中的所述聚合物选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；
[0193] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子包括多价阳离子；
[0194] iii)所述凝胶中的所述多糖选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；
[0195] iv)所述涂层中的所述形成凝胶的离子包括多价阳离子；和
[0196] v)凝胶进一步包含细胞。
[0197] 在一些实施方式中：
[0198] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；
[0199] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0200] iii)所述凝胶中的所述多糖选自下组：藻酸盐、细胞粘附序列改性的藻酸盐以及它们的组合；和
[0201] iv)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；和
[0202] v)凝胶进一步包含细胞。
[0203] 在一些实施方式中：
[0204] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0205] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0206] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0207] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0208] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；和
[0209] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0210] 在一些实施方式中：
[0211] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0212] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0213] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0214] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0215] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子、钡离子以及它们的组合；
[0216] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0217] 在一些实施方式中：
[0218] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0219] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0220] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0221] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0222] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0223] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0224] 在一些实施方式中：
[0225] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0226] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子是钙离子；
[0227] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0228] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0229] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子是钙离子；
[0230] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0231] 在一些实施方式中：
[0232] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0233] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0234] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0235] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0236] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0237] vi)所述复合物进一步包含网状物。
[0238] 在一些实施方式中：
[0239] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0240] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0241] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0242] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0243] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0244] vi)所述复合物进一步包含网状物。
[0245] 在一些实施方式中：
[0246] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0247] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0248] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0249] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0250] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0251] vi)凝胶进一步包含胰岛细胞。
[0252] 在一些实施方式中：
[0253] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0254] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0255] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0256] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；
[0257] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0258] vi)凝胶进一步包含胰岛细胞。
[0259] 在一些实施方式中：
[0260] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0261] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0262] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0263] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；其中，所述藻酸盐占所述涂层的约0.5-7％；
[0264] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0265] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0266] 在一些实施方式中：
[0267] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0268] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0269] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0270] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；其中，所述藻酸盐占所述涂层的约0.5-7％；
[0271] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0272] vi)凝胶进一步包含细胞。
[0273] 在一些实施方式中：
[0274] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0275] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0276] iii)所述凝胶中的所述多糖是藻酸盐；
[0277] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；其中，所述藻酸盐占所述涂层的约0.5-7％；
[0278] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0279] vi)凝胶进一步包含胰岛细胞。
[0280] 在一些实施方式中：
[0281] i)所述泡沫体中的所述聚合物是藻酸盐；
[0282] ii)所述泡沫体中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；
[0283] iii)所述凝胶中的所述多糖是RGD改性的藻酸盐；
[0284] iv)所述涂层中的所述多糖包括藻酸盐；其中，所述藻酸盐占所述涂层的约0.5-7％；
[0285] v)所述涂层中的所述形成凝胶的离子选自下组：钙离子、锶离子以及它们的组合；和
[0286] vi)凝胶进一步包含胰岛细胞。
[0287] 在一些实施方式中，复合物已在约1.8mM钙的溶液中达到平衡。在一些实施方式中，所述复合物已在包含生理浓度钙离子的溶液中达到平衡。
[0288] 在一些实施方式中，泡沫体包含藻酸盐，复合物进一步包含选自药物活性剂和/或抗粘连剂的功能组分。
[0289] 在一些实施方式中，泡沫体吸收其重量的1-30倍的液体，所述液体选自水、生理溶液、可溶性多糖溶液和包含功能组分的多糖溶液。
[0290] 制备复合物的方法
[0291] 本发明还提供制备本发明的任一复合物的方法，所述复合物包括本文所述各复合物实施方式以及这些实施方式的组合，所述方法包括：
[0292] iii)使第一液体组分与多孔泡沫体接触，其中，所述第一液体组分包括具有在与所述离子接触后形成凝胶的胶凝位点的多糖，因此在与所述形成凝胶的离子接触后形成凝胶；和
[0293] iv)在所述泡沫体的外表面上形成涂层；
[0294] 其中：
[0295] 所述泡沫体包含形成凝胶的离子，其中所述离子分布在至少一部分的泡沫体中；和
[0296] 所述涂层包含具有胶凝位点的多糖和形成凝胶的离子，其中，所述涂层完全覆盖所述泡沫体的外表面。
[0297] 在一些实施方式中，形成涂层的步骤包括：
[0298] i)在泡沫体的外表面上施加包含具有胶凝位点的多糖的第二液体组分；和[0299] ii)所述施加步骤之后，使所述第二液体组分与形成凝胶的离子的溶液接触，形成所述涂层。
[0300] 可以使用在此所述的方法制备在此所述的任一实施方式，或这些实施方式的组合的复合物。
[0301] 在一些实施方式中，泡沫体还包含聚合物。
[0302] 合适的方法包括将包含多糖的第一液体组分吸收到多孔泡沫体中，其中形成凝胶的离子被结合在泡沫体中，并使多糖在泡沫体的孔内胶凝。第一液体组分中的多糖能与泡沫体中形成凝胶的离子适当反应，以形成凝胶。
[0303] 泡沫体包含形成凝胶的离子，在添加包含多糖的第一液体组分后，多糖可有利地通过泡沫体中的孔和通道渗透到泡沫体的内部，并与形成凝胶的离子反应，以形成复合物。这样，在泡沫体的至少一部分内部体积内形成所述凝胶。在结合形成凝胶的离子之前向泡沫体中添加多糖是不利的，因为在添加所述离子时，在泡沫体表面或表面附近很可能发生反应，使形成凝胶层，该层可能阻止所述离子穿透到泡沫体内部体积中。此外，凝胶和复合物可能是不均匀的，是不利的。在优选的实施方式中，复合物包含基本均匀的凝胶。
[0304] 在制备泡沫体期间可结合用于与包含多糖的第一液体组分反应的形成凝胶的离子，或者优选在添加液体组分之前向泡沫体添加这些离子。在将混合物形成湿泡沫体之前，通过将形成凝胶的离子分散在混合物，优选生物聚合物混合物中的方式结合所述离子，或者将所述离子添加到形成的泡沫体中。任选地，在包含泡沫体和含添加的多糖的凝胶的复合物中加入另外的形成凝胶的离子。例如，通过用不溶解泡沫体的胶凝离子溶液清洗或浸渍泡沫体的方式，将形成凝胶的离子结合到泡沫体或用于制备泡沫体的混合物中。通过挤压去除过量的溶液。
[0305] 通过在引入包含多糖的液体组分之前在泡沫体中提供形成凝胶的离子，多糖可以与所述离子相互作用，使得在添加包含多糖的液体组分时，在泡沫体的至少一部分，优选基本所有的内部体积内形成凝胶。通过在包含多糖的液体组分中添加液体组分之前在泡沫体中提供足够的形成凝胶的离子，可以保证在所述复合物的至少一部分体积中形成包含凝胶的复合物。
[0306] 用于多糖泡沫体的典型清洗溶液含有约30-200mM，更优选50-100mM的水溶性胶凝盐，例如氯化钙、氯化钡或者氯化锶。合适地，通过在其缓慢溶解的pH条件下使用难溶性盐，可以控制胶凝速率以延迟胶凝，或者通过组合使用可溶性的形成凝胶的离子与螯合剂。可以采用清洗或浸渍来改进复合物的性质，其中可加入另外的形成凝胶的离子以增强或强化所述复合物，还控制细胞增殖，可以采用其他处理例如螯合剂或不会形成凝胶的离子来弱化或溶解该复合物。通过添加柠檬酸盐、EDTA或六偏磷酸盐(hexametaphosphate)的水溶液，使藻酸盐凝胶溶解。对活细胞的清洗处理必须是等静压的。因此可以根据需要可以调节复合物的性质。
[0307] 凝胶的形成将取决于形成凝胶的离子的量和类型、多糖特性如组成和分子量；和与吸收相关的液体组分的性质例如固体浓度、粘度，以及液体与可用孔体积的相对比例。在一些实施方式中，液体被吸收，多糖开始胶凝，凝胶填充所述孔。其他实施方式，例如，当液体被吸收时，显著比例的多糖在孔壁上胶凝成涂层。
[0308] 第一液体组分的吸收速率以及多糖的胶凝速率可能影响复合物的结构。液体组分的吸收速率和吸收能力将取决于泡沫体的特性，例如孔径和孔体积，多糖特性如组成和分子量；以及与吸收相关的液体组分的性质，例如固体浓度和粘度。当第一组分的粘度影响其被快速吸收到泡沫体中的能力时，使用较低浓度藻酸盐或使用较低分子量藻酸盐可能是合适的。
[0309] 影响凝胶的机械性质的因素包括：多糖浓度，多糖分子量，化学组成，适当的不同多糖组分的掺混物，例如富M和富G藻酸盐的比例，形成凝胶的离子的类型和含量以及凝胶的其他组分。根据预定应用，通过控制这些参数来调整凝胶的强度。
[0310] 适合添加至泡沫体的第一液体组分包含溶解于溶剂，通常是水中的多糖。
[0311] 第一液体组分的适当粘度约为5-1000mPas，典型地约为8-600mPas，更优选约10-200mPas。优选将液体组分完全吸收到泡沫体的孔中，除非要求只在一部分泡沫体例如在泡沫体表面上形成凝胶层。液体应充分胶凝，使得液体保留在孔内，避免未胶凝或部分胶凝的材料从泡沫体渗出，除非是要求仅涂覆孔。
[0312] 在一些实施方式中，是第一液体组分是低粘度溶液。
[0313] 在一些实施方式中，第一液体组分包含小于约5％w/v多糖。在一些实施方式中，第一液体组分包含约0.2-10％w/v多糖。在一些实施方式中，第一液体组分包含约0.5-5％w/v多糖。在一些实施方式中，所述第一液体组分包含约0.1-1.0％w/v多糖。
[0314] 在一些实施方式中，在形成所述凝胶之后但在形成所述涂层之前洗涤该泡沫体。
[0315] 在一些实施方式中，第二液体组分包含约0.2-10％w/v，约0.5-10％w/v，约1-8％w/v，约2-7％w/v，约3-6％，或者约2-6％w/v具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，所述第二液体组分的多糖包含约3％w/v具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/v具有胶凝位点的多糖。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/v PRONOVA SLM20(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/vPRONOVA SLM100(NovaMatrix，FMC生物聚合物，挪威)。
[0316] 在一些实施方式中，第二液体组分包含约0.2-10％w/v，约0.5-10％w/v，约1-8％w/v，约2-7％，约3-6％，或者约2-6％w/v的藻酸盐、细胞序列改性的藻酸盐或者它们的组合。在一些实施方式中，所述第二液体组分的多糖包含约3％w/v的藻酸盐、细胞序列改性的藻酸盐或者它们的组合。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/v的藻酸盐、细胞序列改性的藻酸盐或者它们的组合。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/v PRONOVA SLM20(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。在一些实施方式中，第二液体组分包含约5％w/v PRONOVA SLM100(NovaMatrix，FMC生物聚合物公司，挪威)。
[0317] 在一些实施方式中，形成凝胶的离子的溶液包含约50-200mM钙离子。在一些实施方式中，形成凝胶的离子的溶液包含约100mM钙离子。
[0318] 在一些实施方式中，所述方法还包括在形成所述涂层之后使所述复合物与锶离子和钙离子的溶液接触。在一些实施方式中，锶离子和钙离子的浓度各自独立地约为2-8mM，或者约5mM。在一些实施方式中，该步骤可提高制成的复合物的机械强度。
[0319] 在一些实施方式中，所述方法还包括在形成所述涂层之后，使复合物在包含约1.8mM钙离子的溶液中达到平衡进行清洗。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在形成所述涂层之后在包含生理浓度钙离子的溶液中达到平衡进行清洗。在一些实施方式中，该步骤提高了制成的复合物的生物相容性，因为钙离子浓度是生理浓度。
[0320] 在一些实施方式中，第一液体组分还包含功能组分。在一些实施方式中，所述功能组分选自下组：调味剂，芳香剂，微粒，细胞，多细胞聚集体，治疗剂，组织再生剂，生长因子，营养制品以及它们的组合。在一些实施方式中，第一液体组分进一步包含细胞。
[0321] 在一些实施方式中，第一液体组分包括胰岛细胞，肝细胞，神经细胞，血管内皮细胞，甲状腺细胞，甲状旁腺细胞，肾上腺细胞，胸腺细胞，间质干细胞和卵巢细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包含选自下组的细胞：胰岛细胞，间质干细胞，甲状旁腺细胞和甲状腺细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包含选自下组的细胞：胰岛细胞和甲状旁腺细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包含胰岛细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包含遗传改性的间质干细胞以表达生长因子或凝结因子VIII。在一些实施方式中，第一液体组分不含胚胎干细胞。在一些实施方式中，第一液体组分包含间质干细胞。
[0322] 在一些实施方式中，第一液体组分进一步包含胰岛细胞。在一些实施方式中，第一液体组分进一步包含源自人或猪的胰岛细胞。在一些实施方式中，第一液体组分进一步包含源自人、成熟猪或新生猪的胰岛细胞。在一些实施方式中，第一液体组分进一步包含约20,000-40,000胰岛细胞。
[0323] 可以采用本领域已知的各种方法制备涂层。在一些实施方式中，可采用以下方式制备涂层，在容器中放置少量多糖，然后使泡沫体的表面与溶液接触；和再使多糖溶液与形成凝胶的离子的溶液接触。多糖溶液还可以采用本领域的其他已知方法施用，例如浸涂，喷涂，或下拉法。在一些实施方式中，通过使多糖与自胶凝组合物接触形成所述涂层，所述组合物例如是在美国专利公开2006/0159823(于2006年7月20日公开)(全文参考结合于本文)。
[0324] 适合在复合物中结合入对温度敏感的材料，因为所述复合物适于在环境温度或接近环境温度下的方法形成。本发明的方法不必包括在升高温度或降低温度条件的干燥步骤，例如冷冻干燥步骤，但是需要时可以包括该步骤。为避免干燥复合物，尤其是在升高温度下干燥的步骤的设想能有利于制备均匀分布有加入的对温度敏感的材料的复合物，所述对温度敏感的材料未发生失活或变化。
[0325] 本发明进一步提供了采用本发明方法制造的产品。
[0326] 该复合物的用途和使用的方法
[0327] 在又一个方面，本发明提供按照本发明方法制造的复合物的用途和使用方法。所述复合物特别适合用于医学应用，例如创口处理，组织工程和组织再生和细胞固定。
[0328] 在此所述的用途和方法可用于本文所述的任一复合物，所述方法的产品，或其实施方式，包括所述实施方式的组合。
[0329] 本发明还提供促进细胞在本文所述复合物中增殖的方法，该方法包括用溶液清洗复合物，调节对活细胞为中性的渗透压，所述溶液包含形成凝胶的离子。在一些实施方式中，选择形成凝胶的离子，使清洗步骤能够改进复合物的机械性质。在一些实施方式中，用于清洗复合物的溶液包含选自钙盐、钡盐和锶盐的盐，其浓度约为5-200mM。
[0330] 本发明还提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括：采用本文所述的方法形成复合物，其中第一液体组分包含细胞，所述多糖能在泡沫体的孔内发生胶凝，形成凝胶的离子包括锶离子。
[0331] 本发明还提供从所述复合物回收细胞的方法，该方法包括使包含回收剂的水溶液与包含多糖的凝胶接触，其中，调节所述水溶液以提供对活细胞为中性的渗透压。在一些实施方式中，所述回收剂包括柠檬酸钠或者其他可溶性柠檬酸盐，EDTA钠或者其他可溶性EDTA盐，或者六偏磷酸盐。
[0332] 本发明还提供一种促进细胞生长的方法，该方法包括将所述的复合物移植到人或动物体内以达到建立细胞生长目的，其中，泡沫体包含藻酸盐。
[0333] 本发明还提供一种防止组织与相邻组织粘连的方法，该方法包括在所述组织上施加所述复合物，使得提供在组织和相邻组织之间的阻挡层。
[0334] 本发明还提供了所述复合物作为用于细胞固定基质的用途和/或用于体外组织培养的增殖应用或体内组织工程应用的基质的用途。
[0335] 本发明提供给予有需要的患者一种或多种复合物的方法，该方法包括将所述一种或多种复合物移植在所述患者体内。在一些实施方式中，皮下移植所述一种或多种复合物。在一些实施方式中，将三种至四种复合物移植到患者体内。在一些实施方式中，复合物的凝胶包含胰岛细胞，所述患者需要治疗糖尿病或调节血糖水平。
[0336] 在一些实施方式中，移植治疗有效的量的细胞。治疗特定病症所需的细胞量将依据治疗的特定病症、个体的大小、年龄和响应方式、病症的严重程度、临床医生的判断，给药方式和给药目的(如预防或治疗)而变化。词语“有效量”表示由研究人员、兽医、医生或其临床医生寻求的在组织、系统、动物、个体、患者或人中得出生物或医学响应的细胞数量。所需的生物或医学响应包括防止个体中的病症(如，防止在可能易感所述病症，但还未经历或显示该病症的病理学或症候学的个体中的该病症)。所需的生物或医学响应还包括在正经历或显示该病症的病理学或症候学的个体中抑制该病症(即，阻止或减慢该病理学和/或症候学的进一步发展)。所需的生物或医学响应还包括在正经历或显示该病症的病理学或症候学的个体中改善该病症(即，逆转该病理学和症候学)。
[0337] 在患者体内中可以移植一种或多种复合物，以达到治疗有效量的细胞。在一些实施方式中，凝胶独立地包含大于或等于约5,000个细胞。在一些实施方式中，凝胶包含约5,000-300,000个细胞，约5,000-200,000个细胞，约5,000-100,000个细胞，约10,000-100,000个细胞，约5,000-60,000个细胞，约10,000-约60,000个细胞，约20,000-约60,000个，或者约20,000-40,000个细胞。
[0338] 本发明还提供所述方法的用途。本发明还提供本文所述复合物在治疗人或动物体的方法中的用途。在一些实施方式中，所述复合物可用于治疗糖尿病或降低血糖水平的方法。
[0339] 本发明还提供用于在有需要的患者体内移植一种或多种复合物的试剂盒，该试剂盒包含一种或多种本发明的复合物。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于在患者体内移植所述复合物的说明书。
[0340] 在一些实施方式中，复合物用作功能组分的承载体，在使用中释放组分。可以调整该复合物在功能组分是一种药物的情况以特定方式释放该组分。该组分的“释放曲线”根据需要可以是即刻的、快速释放、可控释放或者脉动释放。
[0341] 在一些实施方式中，复合物进一步包含治疗剂，以体内受控释放的方式向人或动物体提供活性剂。在一些实施方式中，复合物进一步包含用于处理创口的组分，提供体内创口处理。
[0342] 在一些实施方式中，需要从凝胶释放被截留的组分。可以通过以下方式达到释放，通过凝胶的物理特性，从凝胶提取，或者分解凝胶，或者通过从凝胶简单扩散或渗出。根据应用和待释放的组分的特性选择释放组分的方法，该方法可以包括施加机械能或声能，温度或者pH变化，或者添加“解胶凝”剂例如螯合剂。
[0343] 在一些实施方式中，该复合物可用于组织生长和组织工程，其中利用接种在三维支架(scaffold)的细胞产生功能组织，所述支架提供模板来引导新组织生长并保证营养素到达细胞和去除废产品。在一些实施方式中，可以构建复合物以促进所需的向内生长并以可控制和可预测的方式发生降解。例如，当新生成的组织通过该复合物增殖时，复合物适当降解并提供新组织形成用的空间。在一些实施方式中，可将复合物设计成能刺激固定的细胞和/或在移植复合物的区域的细胞之间特定的相互作用，例如通过释放细胞相互作用的分子和生长因子，例如用于骨、神经、皮肤和软骨的再生。在一些实施方式中，复合物可以释放生长因子以促进细胞根据要求的几何形状向内生长，移植物的受控降解能够使再生的骨组织成能承载负荷。在一些实施方式中，通过使用钙离子或锶离子分别作为形成凝胶的离子，可将复合物设计成能适当促进或阻止细胞的增殖。
[0344] 在一些实施方式中，固定在复合物中的细胞可以移植到动物体内，其中，凝胶和涂层用作免疫屏障，防止被免疫系统检测，因而使得能够移植异种移植物。在一些实施方式中，当需要将动物细胞用于移植(异种移植物)时可以使用锶作为形成凝胶的离子，因为当使用这类人造器官时，重要的一点是细胞不会脱离移植的复合物生长和不会与免疫系统接触。在一些实施方式中，例如癌症研究中，复合物还可用于在动物体内构建细胞、肿瘤和组织异种移植物。将多细胞聚集体例如胰岛(islets Langerhan)固定在复合物中能够将多细胞聚集体移植到动物或人体内而免于免疫排斥，然后，这类移植的细胞聚集体可发挥人造器官的作用，用于例如产生胰岛素。
[0345] 可以使用细胞培养液来制备生物材料，例如，酶，激素，免疫生物制品(如单克隆抗体，白介素，淋巴因子)和抗癌剂。细胞可以在本发明的复合物中培养以增加细胞总数。例如，从患者分离的细胞可以在本发明的复合物中培养以增加细胞数量，然后将从复合物重新得到该细胞并用于组织工程应用。本发明复合物中的细胞培养物还可以用于探究、表征和详细说明细胞分化和生长，以产生组织类结构。例如，细胞受到通过外部应力的影响，改进复合(凝胶/泡沫体)材料的弹性可能影响基因表达。
[0346] 可以使用回收剂，从培养物中适当回收在复合物中体外产生的细胞。合适的回收剂包括柠檬酸钠或柠檬酸的其他可溶盐，EDTA钠或EDTA的其他可溶盐，和六磷酸盐。
[0347] 不希望受任何理论的限制，发明人相信，固定细胞的复合物和凝胶的硬挺性是用于细胞生长的重要因素，因为很明显凝胶的机械性质可调节增殖，并且已经观察到基于细胞类型的分化。其上附连细胞的凝胶硬挺性(例如由弹性模量度量)决定了由外骨骼产生的力的量级以及随后细胞扩展的程度。通过藻酸盐浓度、形成凝胶的离子的饱和以及形成凝胶的离子的类型可改变藻酸盐凝胶的性质。此外，藻酸盐可以化学改性以添加用于细胞粘附的肽序列，例如细胞粘附肽序列，如RGD三肽。
[0348] 在一些实施方式中，复合物可用于人或动物体的处理，以防止组织之间的粘连。外科手术可能造成例如肌肉之间、肌肉和肌腱或神经或其他组织之间的组织粘连或组织生长在一起。为防止这种不希望的组织生长，在一些实施方式中，可在肌肉之间、肌肉和肌腱或神经之间插入抗粘附层，覆盖创口并防止在愈合过程中形成术后粘附。在一些实施方式中，通过选择材料例如复合物中的透明质酸盐(hyalouronate)泡沫体和阻止或防止细胞生长并侵入抗粘附层的胶凝离子，配制的复合物可用作抗粘附层，因此避免愈合过程组织间的粘连。在一些实施方式中，该复合物可以由可生物降解的材料构建，所述生物降解材料能随创口愈合分解(通过适当改变交联离子量、聚合物类型、聚合物浓度)并降解或从体内排泄。
[0349] 在一些实施方式中，根据制剂的性质，所述复合物可以配制成在不同的时间周期内降解并因此释放固定的材料例如治疗剂或组织再生剂。本发明的优选用途是组织修复，其中，将有机或无机材料固定在复合物内，用作供组织再生的支架。这样的一个实例是将羟磷灰石容纳在泡沫体的凝胶中，然后移植到骨质缺损中，以诱发骨再生到该泡沫体/凝胶的复合物中。另一个实例是将趋化性物质或者细胞引诱剂物质包含在复合物内，随后将该复合物移植在组织损害位点，以促进组织再生。
[0350] 当需要将复合物用于受控递送应用，例如药物、生长因子、营养素、调味剂或芳香剂受控递送时，可以改进机械性质和化学性质，达到在所需环境中适当释放。
[0351] 需要时，可以在使用之前或期间将泡沫体成形。可以用紧固件例如缝合线将泡沫体固定在基材上，然后将可溶多糖加入该泡沫体，以产生凝胶并形成复合物。按照需要，形成复合物，然后使用紧固件例如缝合线固定在基材上。
[0352] 为了更好理解在此揭示的本发明，提供以下实施例。应理解，这些实施例仅用于说明目的，不以任何方式构成对本发明的限制。
[0353] 术语表
[0354]
[0355]
[0356]
[0357] 实施例1
[0358] 此实施例显示泡沫体的刚性或弹性随形成凝胶的离子的饱和度以及温度的变化情况。
[0359] 在表1中列出测试的三种不同泡沫体的湿泡沫体配方。这些配方中的碳酸钙用量不同，使钙离子足以使藻酸盐的胶凝位点饱和程度分别为66％，111％和155％。
[0360] 表1：湿泡沫体配方
[0361]
[0362] 制备藻酸盐水溶液，搁置一边。在一混合碗中将碳酸钙分散在水中(25克，小于表1示出的量)。在同一碗中加入甘油、山梨醇专用品、藻酸盐水溶液和HPMC，用Hobart厨房用混合器(装备有搅打器)以中等速度掺混该分散体1分钟确保均匀。以高速再混合7分钟，然后加入新混合的GDL溶液(即，GDL加25克水)，再以高速混合1分钟，制得湿泡沫体，其密度为0.25克/毫升(按照由填充100毫升容器所需的湿泡沫体的重量确定)。将该泡沫体浇铸在2毫米高的模具中，该模具涂覆Versi-Dry bench保护剂，聚乙烯侧朝向泡沫体(Nalgene Nunc International，NY，USA)，室温条件下保持未覆盖态60分钟，然后在干燥烘箱中于80℃干燥30分钟。干燥后的泡沫片因为孔径和厚度变化而显示略有不同。
如将湿泡沫体的胶凝速率与形成凝胶的离子的饱和度关联，对最低饱和度的泡沫体，发生孔合并的程度最高。
如将湿泡沫体的胶凝速率与形成凝胶的离子的饱和度关联，对最低饱和度的泡沫体，发生孔合并的程度最高。
[0363] 从该干燥泡沫片上冲切直径2.1厘米的圆形片。自111％饱和的泡沫体冲切的泡沫圆片在121℃高压灭菌20分钟。
[0364] 制备片泡沫体用于进行机械测试，将泡沫片放置在直径3.5厘米的皮氏培养皿上，加入4毫升典型生理溶液(2.5mM CaCl2和9毫克/毫升NaCl)。泡沫体保持在该溶液中5分钟，然后转移到Bohlin CVO 120高分辨流变仪。将泡沫体置于锯齿状板(PP 25)之间，板间隙为500毫米，然后进行摆动测量。在施加0.5-50Pa剪切应力的条件下进行应力摆动变化。频率设定为1Hz。对每一种泡沫片进行三次摆动变化。在线性粘弹性区(G′lin读取弹性模量G’，列于表2。测试在两个不同温度下进行。添加生理溶液的温度，溶胀期间的温度和测量时的温度或为20℃，或为37℃。
[0365] 表2：泡沫体组合物在两种温度的G′lin(n＝3).
[0366]
[0367] *n＝6
[0368] 数据显示弹性模量随形成凝胶的离子的量增加而增大。高压灭菌条件似乎并不影响111％饱和的泡沫体的模量。
[0369] 实施例2
[0370] 此实施例显示形成凝胶的离子从泡沫体扩散至添加的藻酸盐溶液并因此引起胶凝的情况。测量添加藻酸盐溶液后弹性模量随时间的变化，以描述胶凝动力学以及材料弹性的增加。在此研究中不施加涂层。
[0371] 由干泡沫盘(直径2.1厘米)制备复合物，所述泡沫盘由实施例1制备的66％饱和和111％饱和的泡沫体以及250微升1％PRONOVA UP LVG(99mPas)制备，制备方法为采用将溶液从吸液管滴加到泡沫体顶表面的方式均匀分布溶液。添加的所有藻酸盐溶液被吸收并填充泡沫体的通孔。存在于66％饱和和111％饱和的泡沫体的钙离子使复合物中藻酸盐总量的43-71％饱和。加入藻酸盐溶液后，将复合物转移到流变仪中5分钟。间隙设定为300微米，频率和应变分别保持1Hz和0.001不变。复合物的弹性模量G随时间变化，列于表3。
[0372] 表3：在泡沫体中加入藻酸盐溶液后G随时间的变化
[0373]
[0374] 结果显示，两种泡沫体的弹性模量都随时间增大，这表明形成凝胶的离子从藻酸盐泡沫体扩散至添加的藻酸盐溶液中，造成胶凝。对111％饱和的泡沫体，G值快速增大，60分钟后达到稳定水平。对66％饱和泡沫体，G值较低，增加比较缓慢，结果表明在测试的105分钟内未完全扩散。
[0375] 实施例3
[0376] 此实施例显示通过使用含不同量形成凝胶的离子的泡沫体并添加G-量和分子量不同的藻酸盐溶液改进弹性的情况。在此研究中不施加涂层。
[0377] 进行测试的泡沫体是111％饱和泡沫体和实施例1中已经过高压灭菌处理的111％饱和泡沫体，以及按照实施例1制备的新的155％饱和泡沫体(但是使用碳酸钙掺混物，其中一半CaCO3被较大粒径的CaCO3(HuberCAL 250 Elite，8.7微米)替代。这种泡沫体的孔略大于实施例1的155％饱和泡沫体，并且能够吸收更多较高粘度的藻酸盐溶液。
155％饱和泡沫体的湿密度为0.24克/毫升。将如实施例1的泡沫体盘(直径2.1厘米)放置在皮氏培养皿中，使用吸液管在其顶表面上滴加250微升藻酸盐溶液。加入的所有藻酸盐溶液被吸收，所述溶液填充泡沫体中的孔。含泡沫体与藻酸盐溶液的培养皿保持室温条件60分钟，然后加入4毫升典型的生理溶液。5分钟之后，将泡沫体盘转移到流变仪中，按照实施例1所述进行应力摆动，但是间隙设定为300微米。这些样品测定的G′lin列于表4。
PRONOVA UP LVG的G-含量约为67％(高-G)，而PRONOVA SLM 20含有约43％G(高-M)。
通过将1％和2％的PRONOVA SLM 20和PRONOVA UP LVG的溶液分别在121℃高压灭菌20分钟，降低藻酸盐的分子量，制备低粘度的藻酸盐样品。
155％饱和泡沫体的湿密度为0.24克/毫升。将如实施例1的泡沫体盘(直径2.1厘米)放置在皮氏培养皿中，使用吸液管在其顶表面上滴加250微升藻酸盐溶液。加入的所有藻酸盐溶液被吸收，所述溶液填充泡沫体中的孔。含泡沫体与藻酸盐溶液的培养皿保持室温条件60分钟，然后加入4毫升典型的生理溶液。5分钟之后，将泡沫体盘转移到流变仪中，按照实施例1所述进行应力摆动，但是间隙设定为300微米。这些样品测定的G′lin列于表4。
PRONOVA UP LVG的G-含量约为67％(高-G)，而PRONOVA SLM 20含有约43％G(高-M)。
通过将1％和2％的PRONOVA SLM 20和PRONOVA UP LVG的溶液分别在121℃高压灭菌20分钟，降低藻酸盐的分子量，制备低粘度的藻酸盐样品。
[0378] 表4：对两种高M藻酸盐的分子量(1％粘度)，具有不同的藻酸盐溶液的藻酸盐浓度的复合物的G′lin
[0379]]aP
[
，
＝度 物合 ℃02，
粘02 MLS对 复的saPm29 MES±′G nil 802±3604 691±6483 861±8943 132±9803
]
aP[
，
＝度粘02 MLS 物合复的saP ℃02，MES±nil 42±373 *931±658 *461±027 83±369对 m9 ′G 3 2 2 2
物
合
复部 度和 ％ ％ ％ ％2
全 饱 28 88 49 01
02 M
LS A
VONO 盐酸 ％0 ％57 ％5 ％52
RP 藻 .1 .0 .0 .0
体沫 度和 ％11 ％11 ％11 ％11
泡 饱 1 1 1 1
[
，
＝度 物合 ℃02，
粘02 MLS对 复的saPm29 MES±′G nil 802±3604 691±6483 861±8943 132±9803
]
aP[
，
＝度粘02 MLS 物合复的saP ℃02，MES±nil 42±373 *931±658 *461±027 83±369对 m9 ′G 3 2 2 2
物
合
复部 度和 ％ ％ ％ ％2
全 饱 28 88 49 01
02 M
LS A
VONO 盐酸 ％0 ％57 ％5 ％52
RP 藻 .1 .0 .0 .0
体沫 度和 ％11 ％11 ％11 ％11
泡 饱 1 1 1 1
[0380] (*n＝5)
[0381] 表5：对两种高G藻酸盐的分子量(1％粘度)，具有不同的藻酸盐溶液的藻酸盐浓度的复合物的G′lin
[0382]泡沫体 PRONOVA UP 全部复合物 对LVG粘度＝ 对LVG粘度＝
饱和度 LVG 饱和度 25mPas的复合物 99mPas的复合物
20 G ′ lin±SEM，20 ℃，G ′lin±SEM，20 ℃，
藻酸盐 [Pa] [Pa]
155％ 1.0％ 98％ 5037±209 未测
155％ 0.5％ 120％ 3792±185 未测
111％ 1.2％ 67％ 4344±44 5060±259*
111％ 1.0％ 71％ 3870±197 4740±71
111％ 0.75％ 78％ 3485±114 3522±115
111％ 0.5％ 87％ 3189±61 3147±70
111％ 0.25％ 97％ 3241±174 2786±100
111％ 1.0％ 71％ 未测 4768±147
高压灭菌
饱和度 LVG 饱和度 25mPas的复合物 99mPas的复合物
20 G ′ lin±SEM，20 ℃，G ′lin±SEM，20 ℃，
藻酸盐 [Pa] [Pa]
155％ 1.0％ 98％ 5037±209 未测
155％ 0.5％ 120％ 3792±185 未测
111％ 1.2％ 67％ 4344±44 5060±259*
111％ 1.0％ 71％ 3870±197 4740±71
111％ 0.75％ 78％ 3485±114 3522±115
111％ 0.5％ 87％ 3189±61 3147±70
111％ 0.25％ 97％ 3241±174 2786±100
111％ 1.0％ 71％ 未测 4768±147
高压灭菌
[0383] (*n＝5)
[0384] 数据显示，在添加1.0％和0.5％藻酸盐的情况下具有最高弹性模量的复合物是加入高-G藻酸盐的155％饱和泡沫体。藻酸盐的分子量对高-G和高-M藻酸盐都很重要，因为弹性模量G′lin随粘度下降而减小，除了对浓度等于和低于0.75％的藻酸盐，在此情况下获得类似结果。一般而言，对155％饱和和111％饱和的泡沫体，对四种不同藻酸盐，弹性模量G′lin随加入的藻酸盐浓度下降而减小。在最低浓度情况下的低粘度藻酸盐观察到例外的结果。复合物的弹性模量G′lin通过对泡沫体高压灭菌的处理也不会改变。
[0385] 实施例4
[0386] 此实施例显示通过在含附加的形成凝胶的离子的溶液中清洗复合物，复合材料的弹性受到影响情况。在此研究中不施加涂层。
[0387] 将来自实施例1的111％饱和泡沫体盘(直径约2.1厘米)放置在皮氏培养皿上，在泡沫体顶表面上施加250微升1％PRONOVA UP LVG(99mPas)，于室温保持60分钟。然后，复合物在4毫升50mM CaCl2溶液或在50mM SrCl2溶液中培养。5分钟之后，用典型生理溶液替代该含过量形成凝胶的离子的溶液，再5分钟后，按照实施例1所述测定G′lin。在加入藻酸盐后60放置，未接受任何添加的过量形成凝胶的离子的样品中加入典型生理溶液，溶胀5分钟之后测定G′lin。测定结果列于表6。
[0388] 表6：用含过量形成凝胶的离子的溶液清洗或未清洗的复合物的模量G′lin(n＝3)[0389]
[0390] 数据显示，通过分别用含钙或锶离子的溶液清洗复合物，弹性模量G′lin增大四倍以上至接近六倍。用含锶离子溶液清洗的复合物获得较高值，与用钙离子溶液清洗的复合物相比，形成更高刚性的凝胶网络。
[0391] 实施例5
[0392] 此实施例显示，通过改变藻酸盐泡沫体的钙饱和度影响固定在藻酸盐中的MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞的增殖和成活力的情况，以及在细胞固定后复合物中添加另外的形成凝胶的离子的作用。在此研究中不施加涂层。
[0393] 用足以饱和藻酸盐的100％和200％的胶凝位点的钙离子制备两种不同的藻酸盐泡沫体。湿泡沫体的配方示于下表7。
[0394] 表7：湿泡沫体配方
[0395]
[0396] 制备藻酸盐水溶液。然后，在混合碗中，按照上面列出的将CaCO3分散在水中，不同之处在于用量为25克。在同一碗中加入甘油、山梨醇专用品、藻酸盐水溶液和HPMC，用Hobart厨房用混合器(装备有搅打器)以中等速度掺混该分散体1分钟确保均匀。对100％饱和的泡沫体，以高速再混合3分钟。将GDL溶解于剩余的25克的水中，加入湿泡沫体中。该分散体以高速再混合30秒。形成的100％泡沫体的湿密度为0.23克/毫升。对200％饱和泡沫体，高速混合时间为3.5分钟，然后加入GDL，再高速混合15秒。200％泡沫体的湿密度为0.26克/毫升。将两种泡沫体浇铸在1毫米高的涂覆特氟隆的模具中，室温条件下保持未覆盖态15分钟，然后在干燥烘箱中于80℃干燥30分钟。
[0397] 用解剖刀从该干燥泡沫片上切割直径3.6厘米的圆盘，并独立包装。然后泡沫体盘在121℃高压灭菌20分钟。
[0398] 将无菌藻酸盐(PRONOVA SLG 100)溶解于细胞生长介质(MEM)中至1％藻酸盐溶液。将该藻酸盐溶液以及MDCK细胞在生长介质中的悬浮液掺混，至最终浓度为0.8％藻酸盐和200000个细胞/毫升。将藻酸盐泡沫体盘转移到6孔孔板( Nalgene Nunc International)的孔中，盘尺寸与孔板孔尺寸紧密配合。用吸液管在各泡沫体上滴加1.0毫升藻酸盐细胞悬浮液，该藻酸盐复合物于37℃培养20分钟。在100％饱和和200％饱和的泡沫体中的钙离子分别足以使藻酸盐的胶凝位点达到67％和133％的饱和度。然后通过将一半样品加入约5毫升含50mM CaCl2和104mM NaCl的水溶液，对一半样品进行清洗后处理。10分钟后用细胞生长介质替代该盐溶液。培养20分钟后，在其余的样品中加入细胞生长介质。具有固定的细胞的藻酸盐复合物保持在37℃，每周三次替换生长介质。
[0399] 在固定后的不同时间定量测量细胞的增殖和成活力。通过将该藻酸盐复合物转移到含约8毫升等渗柠檬酸盐溶液(50mM二水合柠檬酸三钠和104mM NaCl)的离心管中分离固定的细胞。有规律地轻轻倒转离心管，直到在约2-10分钟内使复合物溶解，然后以13000转/分钟的转速离心5分钟。倒去上清液，将含细胞的球粒再悬浮于1.0毫升250mM甘露醇中。然后将再悬浮球粒的各100微升，80微升和50微升的三个样品转移到96孔板( Nalgene NuncInternational)的孔中。然后，分别加入0微升，20微升和50微升甘露醇(即，填充每个孔至总量为100微升)，然后再加入100微升活/死试剂(live/deadreagent)。所述活/死试剂由5毫升甘露醇溶液(250mM)、20微升乙啡啶溶液(2mM)
6
和5微升钙黄绿素溶液(4mM)制备。由在0-10 细胞范围的乙醇固定的活细胞制备标准曲线。
6
和5微升钙黄绿素溶液(4mM)制备。由在0-10 细胞范围的乙醇固定的活细胞制备标准曲线。
[0400] 使用Cytofluor微板读数计测量细胞增殖和成活力。用于钙黄绿素的滤光片是485nm(激发)和530nm(发射)的，用于乙啡啶的滤光片是530nm(激发)和620nm(发射)。
[0401] 表8：由不同复合物细胞成活力和增殖随时间的变化(n＝3，±SEM).
[0402]样品类型 龄期 总细胞计数 归一化 死细胞，％
100％未清洗 1周 231800±10200 1.2±0.1 9±2
3周 130300±28700 0.65±0.14 63±18
5周 224700±121000 1.1±0.6 45±23
7周 196800±28400 1.0±0.1 55±9
100％，清洗 1周 189600±5100 0.95±0.03 7±2
3周 304900±31500 1.5±0.2 37±4
5周 322200±82800 1.6±0.4 39±11
7周 660300±394600 3.3±2.0 40±8
200％未清洗 1周 212600±34700 1.1±0.2 8±3
3周 258300±62500 1.3±0.3 43±4
5周 283400±73300 1.4±0.4 44±6
7周 364800±22300 1.8±0.1 60±2
200％，清洗 1周 255600±48900 1.3±0.2 8±2
3周 712800±292600 3.6±1.5 18±2
5周 485600±217400 2.4±1.1 28±5
7周 663600±176500 3.3±0.9 42±5
100％未清洗 1周 231800±10200 1.2±0.1 9±2
3周 130300±28700 0.65±0.14 63±18
5周 224700±121000 1.1±0.6 45±23
7周 196800±28400 1.0±0.1 55±9
100％，清洗 1周 189600±5100 0.95±0.03 7±2
3周 304900±31500 1.5±0.2 37±4
5周 322200±82800 1.6±0.4 39±11
7周 660300±394600 3.3±2.0 40±8
200％未清洗 1周 212600±34700 1.1±0.2 8±3
3周 258300±62500 1.3±0.3 43±4
5周 283400±73300 1.4±0.4 44±6
7周 364800±22300 1.8±0.1 60±2
200％，清洗 1周 255600±48900 1.3±0.2 8±2
3周 712800±292600 3.6±1.5 18±2
5周 485600±217400 2.4±1.1 28±5
7周 663600±176500 3.3±0.9 42±5
[0403] 表8中的数据显示，添加额外钙离子的清洗步骤(提供更高刚性凝胶网络)促进了细胞增殖。因为细胞数量随时间推移增加，因此观察到细胞成活力下降。
[0404] 对复合物在活/死试剂中浸泡之后在荧光显微镜下观察复合物，显示清洗的复合物样品具有更多的细胞展开。
[0405] 实施例6
[0406] 此实施例显示通过在细胞固定后的清洗步骤影响快速生长的小鼠肌原细胞(C2C12细胞)的增殖和成活力的情况，以及清洗溶液中形成凝胶的离子类型的作用。在此研究中不施加涂层。
[0407] 藻酸盐泡沫体由作为形成凝胶的离子的钙制备，钙量足以使藻酸盐达到155％饱和。湿泡沫体的配方示于表9。
[0408] 表9：湿泡沫体配方.
[0409]
[0410] 按照实施例5中所述制备湿泡沫体，不同之处在于高速混合7分钟后，添加溶解于总量水的30克水中的GDL，然后再高速混合30秒。制成的湿泡沫体密度为0.29克/毫升，将该泡沫体浇铸在2毫米深涂覆Versi-Dry bench保护剂的模具中，聚乙烯侧朝向泡沫体。然后，泡沫体在环境条件下保持未覆盖态1小时，然后在干燥烘箱中于80℃干燥30分钟。
[0411] 从该干燥泡沫片上冲切直径2.1厘米的圆盘。该泡沫盘在121℃高压灭菌20分钟。
[0412] 将无菌藻酸盐泡沫体转移到12孔板( Nalgene NuncInternational)的孔中，盘尺寸与孔板孔尺寸紧密配合。用吸液管在各泡沫体上滴加分布300微升1％藻酸盐细胞溶液(PRONOVA SLG 20)，该溶液含25,000个细胞。泡沫体于37℃培养20分钟。泡沫体中的钙离子足以使复合物中藻酸盐总量的97％饱和。在三分之一的泡沫体中加入生长介质(D-MEM。在剩余的泡沫体的一半中加入约2毫升等渗钙溶液(50mM CaCl2和250mM甘露醇)，而另一半采用泡沫体接受等渗锶溶液(50mM SrCl2和250mM甘露醇)。约2-5分钟后，该胶凝溶液被生长介质替代。具有固定细胞的泡沫体保持在37℃，每周三次替换生长介质。
[0413] 在固定后的1天和10周定量测量细胞的增殖和成活力(图2)。按照实施例5所述分离固定的细胞，不同之处在于对1天和10周的测试使用不同的解胶凝溶液。将细胞固定后1天测试的泡沫体溶解于10毫升含50mM柠檬酸盐和250mM甘露醇的溶液中。将细胞固定后10周测试的泡沫体溶解于10毫升含添加50mM柠檬酸的Hanks溶液中。将回收的细胞球粒分散在1毫升活/死试剂(由4毫升Isoton II、1ml碘化丙锭(propidium iodide)(85微克/毫升)和20微升钙黄绿素(1毫克/毫升)构成。在荧光显微镜下，在Bürker计数室加入两滴用于荧光显微细胞计数，同时将剩余的细胞分散体通过60微米尼龙网过滤，重新悬浮后5分钟，使用Coulter EPICS Elite流动细胞计数器分析所述细胞。
[0414] 表10：C2C12细胞在三种不同复合物中、以三个或四个复合物的平均±SEM的形式的增殖和成活力
[0415]
[0416] 结果显示全部三种复合物中细胞总量都增加。对在细胞固定后用含另外的钙离子的溶液清洗的复合物中所固定的细胞，最大程度地促进了C2C12细胞的增殖。生长最慢的细胞是在细胞固定后用含锶离子的溶液清洗的复合物中所固定的那些细胞。
[0417] 在荧光显微镜下观察复合物显示，固定在用钙离子清洗的复合物中的细胞展开，并且在该结构上和通过该结构内部生长。看到固定在用锶离子清洗的复合物中的细胞是单独的细胞或小细胞簇。
[0418] 实施例7
[0419] 此实施例显示通过改变藻酸盐泡沫体中形成凝胶的离子的来源、细胞固定后的清洗步骤影响人软骨细胞的增殖和成活力的情况，以及清洗溶液中形成凝胶的离子类型的作用。在此研究中不加入涂层。
[0420] 藻酸盐泡沫体以钙或锶作为胶凝离子构成，足以分别使藻酸盐达到155％和105％的饱和。湿泡沫体配方示于表11。
[0421] 表11：湿泡沫体配方.
[0422]
[0423] 按照实施例6所述制备湿泡沫体，不同之处在于使用8分钟高速混合，然后加入溶解于总量水的30克水中的GDL，最后高速混合45秒。制成的湿泡沫体的密度为0.30克/毫升，将该泡沫体浇铸在2毫米深涂覆Versi-Dry bench保护剂的模具中。然后，泡沫体在环境温度下保持未覆盖态1小时，然后在干燥烘箱中于80℃干燥30分钟。
[0424] 按照实施例7所述制备无菌藻酸盐泡沫体盘，在该泡沫体中加入细胞，不同之处在于向该泡沫体中加入300微升1％藻酸盐溶液(PRONOVA SLG 20)，该溶液具有195,000个细胞/毫升。对用钙离子胶凝的泡沫体和用锶离子胶凝的泡沫体，存在的形成凝胶的离子足以分别使藻酸盐中G-单体总量的97％、63％饱和。
[0425] 对将细胞固定在用钙离子胶凝的藻酸盐泡沫体(Ca-泡沫体)中后2周和11周，定量测量细胞的增殖和成活力两次，对将细胞固定在用锶离子胶凝的藻酸盐泡沫体(Sr-泡沫体)中后13周，定量测量细胞的增殖和成活力一次，数据示于表12。按照实施例6所述分离固定的细胞，不同之处在于对Sr-泡沫体使用15毫升解胶凝溶液(Hanks，具有50mM柠檬酸盐)。按照实施例6所述制备用于细胞定量的样品和使用流动细胞计数器。
[0426] 表12：软骨细胞在六种不同复合物以三个或四个复合物的平均±SEM的形式中的增殖和成活力
[0427]泡沫体 清洗 时间 总细胞计数 归一化细胞 死细胞，％
计数
Ca-泡沫体 未 2周 36,800±3,000 0.6±0.1 28±4
Ca-泡沫体 未 11周 65,400±4,200 1.1±0.1 50±4
Ca-泡沫体 CaCl2 2周 50,600±1,800 0.9±0.1 22±2
Ca-泡沫体 CaCl2 11周 132,700±12,900 2.3±0.4 64±5
Ca-泡沫体 SrCl2 2周 32800±2,500 0.6±0.1 27±2
Ca-泡沫体 SrCl2 11周 35400±4,800 0.6±0.2 36±2
Sr-泡沫体 未 13周 40,800±2,100 0.7±0.1 48±2
Sr-泡沫体 CaCl2 13周 89,700±11,600 1.5±0.1 63±5
Sr-泡沫体 SrCl2 13周 52,700±1,800 0.9±0.1 34±3
计数
Ca-泡沫体 未 2周 36,800±3,000 0.6±0.1 28±4
Ca-泡沫体 未 11周 65,400±4,200 1.1±0.1 50±4
Ca-泡沫体 CaCl2 2周 50,600±1,800 0.9±0.1 22±2
Ca-泡沫体 CaCl2 11周 132,700±12,900 2.3±0.4 64±5
Ca-泡沫体 SrCl2 2周 32800±2,500 0.6±0.1 27±2
Ca-泡沫体 SrCl2 11周 35400±4,800 0.6±0.2 36±2
Sr-泡沫体 未 13周 40,800±2,100 0.7±0.1 48±2
Sr-泡沫体 CaCl2 13周 89,700±11,600 1.5±0.1 63±5
Sr-泡沫体 SrCl2 13周 52,700±1,800 0.9±0.1 34±3
[0428] 表12中所示结果显示，用钙离子溶液清洗的复合物中的藻酸盐基质与其他复合物相比，11周后的相比数至少为后者的两倍。这表明因为添加钙离子促进细胞增殖和/或其提供更高刚性凝胶基质的作用。结果还显示，对固定在用锶离子溶液清洗的复合物的基质中的细胞，阻止了细胞增殖。对锶泡沫体观察到类似的趋势。用钙离子清洗的锶泡沫体显示在锶泡沫体系列中最佳的细胞生长。不经过清洗或者用含锶溶液清洗的锶泡沫体显示总细胞数没有增加或者几乎没有增加。当细胞增殖时观察到细胞死亡随时间增加。在含最慢生长细胞的复合物中观察到最高活细胞百分数。在荧光显微镜下观察复合物显示，固定在钙清洗的复合物中的细胞展开，在该结构上生长或通过该结构之内生长。可看到固定在用锶离子清洗的复合物中的细胞是单独的细胞或小细胞簇。
[0429] 实施例8
[0430] 测试的藻酸盐泡沫体与实施例1中制备的相同，加入的钙量足以使藻酸盐胶凝位点达到111％饱和。用穿孔器冲切直径为1.0厘米的泡沫体盘。由PRONOVAUP LVG(FP-502-04)制备1.1％藻酸盐水溶液。该藻酸盐溶液用MQ-水和具有荧光右旋糖酐的溶液(6.25毫克/毫升)稀释，得到四种藻酸盐浓度以及荧光右旋糖酐种类不同的溶液，示于表13。用吸移管在藻酸盐泡沫体上加入80微升含藻酸盐和荧光右旋糖酐的溶液，10分钟后，所示溶液被完全吸收到泡沫体内。该藻酸盐泡沫体中的钙量足以使得溶液和泡沫体中的藻酸盐总量的胶凝位点达到62％饱和。加入各泡沫体盘的荧光右旋糖酐量为45.63微克。泡沫体盘在室温条件下保持只用氧化铝箔覆盖以避开光线。然后将各泡沫体盘独立转移到含10毫升Hanks的管中。以约20转/分钟水平搅拌该管，收集100微升样品用于对可能已从复合物渗出的荧光右旋糖酐定量。使用Cytofluor微板读数计分析收集的样品和标准溶液(荧光右旋糖酐10kDa和-70kDa，在Hanks中稀释)中荧光右旋糖酐的浓度。使用的滤光片是485nm(激发，带宽20nm)和530nm(发射，带宽度为25nm)。以两种类型的荧光右旋糖酐在0-0.01毫克/毫升范围中的五组相似试验绘制标准曲线。拟合曲线得到对10kDa和70kDa的校正系数分别为R2＝0.998和R2＝0.979。
[0431] 在将盘转移到Hanks溶液后的5分钟，15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，90分钟，120分钟150分钟收集样品。150分钟后测定的值得到高稳定态。使用由f(t)＝100-100e-kt(k：速率常数，t：时间)所述的非线性拟合曲线，GraFitWorkspace中的计算程序是测定半衰期。结果示于表13。结果显示，两种分子量的荧光右旋糖酐的释放速率明显不同。结果还表明固定在较低浓度藻酸盐中的两个右旋糖酐的释放速率较快。
[0432] 表13：添加溶液的藻酸盐泡沫体盘(V＝80微升/盘，n＝3).
[0433]
[0434] 实施例9
[0435] 在此实施例中使用的藻酸盐泡沫体中加入钙，其量足以达到125％的藻酸盐饱和。湿泡沫体配方示于表14。
[0436] 表14：湿泡沫体配方.
[0437]
[0438] 按照实施例1所述制备泡沫体，不同之处在于湿密度为0.24克/毫升，和将泡沫体浇铸在2毫米高度的涂覆特氟隆的模具中。使用的装置或通过在250℃热处理4小时进行脱热解(depyrogenized)或者在1M NaOH中清洗。干燥的沫体通过γ-辐照(剂量：9.5kGy)进行灭菌。
[0439] 使用穿孔器冲切无菌泡沫盘(直径＝2.1厘米)，转移到12孔板的孔中。表15列出制备的三种不同的细胞(C2C12)和藻酸盐的掺混物。将细胞悬浮于生长介质(DMEM)中，使用Bürker细胞计数室进行定量。将常规的藻酸盐(PRONOVA SLG20，批号：221105)溶解于DMEM，而将肽偶联的藻酸盐(NOVATACH VAPG和NOVATACH RGD)溶解于250mM甘露醇中。对NOVATACH VAPG和NOVATACH RGD，测定肽偶联的藻酸盐的密度分别为0.045微摩尔/毫克固体和0.031微摩尔/毫克固体(采用氨基酸法测定)。
[0440] 表15：用于细胞固定的悬浮液
[0441]
[0442] 各悬浮液的藻酸盐总浓度为1.0％。在各泡沫体盘上加入250微升表15所示的悬浮液，不同的盘有不同的悬浮液。泡沫体中的钙足以使藻酸盐总量的77％中的G单体饱和。各盘中肽浓度为0.025微摩尔，细胞量为25000个细胞/盘。使用吸液管将悬浮液滴在泡沫体上。泡沫体吸收所有加入的溶液，水合后的厚度约为1.2毫米。在加入细胞悬浮液后将泡沫体转移到保温箱，在37℃保持20分钟。然后在一半泡沫体盘中加入约2.5毫升DMEM，而另一半加入约2.5毫升50mM CaCl2和250mM甘露醇的等渗溶液。约5分钟后，对于添加含钙溶液的泡沫体，该溶液被DMEM替代。
[0443] 2天后，按照实施例5所述分离细胞，不同之处在于将泡沫体盘溶解于含50mM柠檬酸三钠和250mM甘露醇的溶液中。离心后的细胞球粒重新悬浮于600微升250mM甘露醇中。重新悬浮的三个各100微升和80微升的样品转移到96孔板的孔中。然后，分别加入0微升和20微升甘露醇(即，填充各孔，至总量为100微升)，然后再加入100微升活/死试剂。活/死试剂由5毫升甘露醇溶液(250mM)，20微升乙啡啶溶液(2mM)和5微升钙黄
5
绿素溶液(4mM)构成。由在0-10 细细胞范围的乙醇固定的活细胞绘制标准曲线。拟合曲
2 2
线对活细胞和室细胞的校正系数分别为R ＝0.988和R ＝0.984。
5
绿素溶液(4mM)构成。由在0-10 细细胞范围的乙醇固定的活细胞绘制标准曲线。拟合曲
2 2
线对活细胞和室细胞的校正系数分别为R ＝0.988和R ＝0.984。
[0444] 按照实施例5所述，使用Cytofluor微板读数计对从各泡沫体盘分离的活细胞定量。结果示于表16。所有样品对死细胞的信号约为空白值，因此未示出这些数据。
[0445] 表16：对不同复合物，细胞成活力和增殖随时间的变化(n＝3，±SEM)[0446]
[0447] 实施例10
[0448] 此实施例提出制备壳聚糖泡沫体的方法以及泡沫体与密度和吸收相关的特性。
[0449] 使用PROTASAN CL 210(214)制备含4％壳聚糖盐的水溶液。在混合碗中加入77.0克MQ-水和14.0克山梨醇(干)，通过在该碗中温和涡流使山梨醇溶解。在同一混合碗中加入100克壳聚糖溶液、6.0克甘油和3.0克HPMC。用Hobart厨房用混合器(装备有搅打器)以中等速度掺混该分散体1分钟确保均匀。以高速继续混合2.5分钟。测定湿密度为0.23克/毫升(由填充100ml容器所需的湿泡沫体的重量测定)。将该湿泡沫体浇铸在2毫米高和4毫米高涂覆特氟隆的模具中，然后置于80℃的干燥烘箱中分别干燥30分钟和
60分钟。
60分钟。
[0450] 采用上述方式制备另一种泡沫体，但是将湿泡沫体在8毫米深的模具中模塑。该泡沫体于80℃干燥1小时，然后于40℃干燥3小时。
[0451] 制成的干燥泡沫体是柔韧和软的开孔网状物。当在该泡沫体中加入水时立刻吸收水，泡沫体显著膨胀。水合后的泡沫体保持其形状，但是该湿泡沫体不牢固，因为不能通过从一个角上掀起而进行整块转移。在水合前压缩干泡沫体对泡沫体的吸收速率或吸收容量没有明显作用。
[0452] 为测量吸收容量，使用解剖刀切割3.5×3.5厘米的泡沫片。对泡沫片称重、放置在网(网孔直径为0.71毫米)上，使用吸液管加入Hanks平衡盐溶液(作为典型生理溶液)。加入过量液体，泡沫体成为透明的。观察到没有从泡沫体滴液时，测量该湿泡沫体的重量。测量三种不同泡沫体的干密度和吸收容量，结果示于表17。
[0453] 表17不同厚度的壳聚糖泡沫体的干密度和典型生理溶液的吸收容量(n＝3，±SD)
[0454]
[0455] 实施例11
[0456] 此实施例提供两层泡沫体测量，包含作为第一层的藻酸盐泡沫体和作为第二层与藻酸盐泡沫体附连的壳聚糖泡沫体。可以采用这种类型的复合物来改进壳聚糖泡沫体的整体性、强度、生物降解和吸收容量。
[0457] 如下制备藻酸盐泡沫体：首先制备含4％藻酸盐(PRONOVA UP MVG)的溶液。将111.2克藻酸盐溶液转移到混合碗中。在该混合碗中加入6.0克甘油、18.0克山梨醇专用品、3.0克HPMC、0.85克CaCO3(足以125％饱和藻酸盐中的古洛糖醛酸残余物)和33.3克MQ-水。用Hobart厨房用混合器(装备有搅打器)以中等速度掺混该分散体1.5分钟确保均匀。以高速继续混合7分钟，然后加入2.69克GDL和25.0克MQ-水的新混合的GDL溶液。以高速继续混合1分钟，产生的泡沫体的湿密度为0.23克/毫升。将该湿泡沫体浇铸在4毫米高和2毫米高涂覆Versi-Dry bench保护剂的模具中，聚乙烯侧朝向该泡沫体(NalgeneNunc International，NY，USA)，室温条件下保持未覆盖状态60分钟。
[0458] 在2毫米和4毫米厚度的胶凝的湿藻酸盐泡沫体顶部分别添加2毫米和4毫米的湿壳聚糖泡沫体层(通过增大模具高度)。按照实施例10所述制备壳聚糖泡沫体，不同之处在于使用18.0克山梨醇专用品替代干山梨醇和在该泡沫体中加入73.0克MQ-水。以中等速度混合的时间为2分钟，然后高速混合3分钟，产生的泡沫体的湿密度为0.22克/毫升。然后将装有两层泡沫体的模置于80℃的干燥烘箱中保持1.5小时，然后转移到37℃的烘箱继续干燥过夜。
[0459] 制成的干泡沫体是软和柔韧的，具有开孔网状。藻酸盐泡沫体部分的孔小于由壳聚糖形成的泡沫体中的孔。干燥后不能将两种泡沫体分离。各泡沫体层即刻吸收水(壳聚糖泡沫体在第一次加水滴液的吸收时间小于1秒，藻酸盐泡沫体约为3秒)，各泡沫体层在水合后保持附连。水合后泡沫体的水合藻酸盐部分具有较高抗张强度，而水合壳聚糖部分强度很低。当手指压向壳聚糖泡沫体侧时或者通过压向相反(藻酸盐泡沫体)侧来展开壳聚糖泡沫体时，水合的壳聚糖泡沫体片破碎。未能分层。
[0460] 实施例12
[0461] 此实施例描述交联壳聚糖泡沫体的方法，所述交联能使泡沫体对生物降解更稳定并提供较高的湿整体性。
[0462] 按照实施例11所述制备壳聚糖泡沫体，不同之处在于以中等速度和高速混合的时间分别为1.5分钟和4.5分钟。制成的湿泡沫体的密度为0.20克/毫升。将该湿泡沫体浇铸在2毫米和4毫米深度的模具中。然后，在喷雾瓶中充入100mM三磷酸钠溶液，该喷雾瓶的喷嘴可以调节以产生细小液滴。在2毫米和4毫米的湿泡沫体上分别喷雾约50毫升和100毫升的三磷酸钠溶液。湿泡沫体吸收一部分喷雾的溶液，因此这种喷雾添加进行几次，每次之间的间隔小于1分钟。然后，对浇铸在2毫米和4毫米模具中的湿泡沫体在80℃的干燥烘箱中分别干燥1小时和2小时。
[0463] 干泡沫体是软和柔韧的，并具有开孔网络。泡沫体即刻吸收水，在水合后的变形较小，强度大于实施例10中的未交联的壳聚糖泡沫体。
[0464] 实施例13
[0465] 此实施例显示含胶凝离子的壳聚糖泡沫体具有引发外部添加的壳聚糖溶液原位胶凝的能力。
[0466] 使用穿孔器从实施例12中浇铸在4毫米高的模具的泡沫体冲切泡沫体圆片(直径＝2.1厘米)。然后将该泡沫体圆片放置在和前面实施例中使用的同样流变仪的缺口圆片上。然后将泡沫体圆片加入过量的MQ-水的溶液或1.0％壳聚糖(PROTASAN UP CL 213)的溶液中。将上板(PP25)降低到间隙为500微米，施加0.5-5Pa的剪切应力进行应力变换。在添加溶液后的约3分钟开始摆动测试。频率设定为1Hz。对每一泡沫体片进行两次变换。弹性模量G’在线性粘弹性区域(G′lin)的读数和相角都列于表18。
[0467] 表18：对添加水和壳聚糖溶液的交联壳聚糖泡沫体测定的G′lin和相角。
[0468]
[0469] 表中弹性模量和相角的结果表明添加壳聚糖溶液后泡沫体更类似凝胶的性质。
[0470] 实施例14
[0471] 此实施例显示混合时间和壳聚糖泡沫体中结合的空气量对不同泡沫体性质的影响程度。
[0472] 按照实施例10所述制备壳聚糖泡沫体，但是采用不同的混合时间以获得不同的泡沫体密度。以中等速度混合形成湿泡沫体的所有成分1.5分钟。然后以高速继续混合1分钟，产生的湿密度为0.45克/毫升。将约一半泡沫体浇铸在4毫米和2毫米高的模具中。然后将剩余泡沫体以高速再混合1分钟。产生的湿密度为0.29克/毫升，如上所述浇铸剩余的泡沫体。重复上述类似的过程，除了以高速混合的时间第一次为45秒，第二次为4分
45秒。湿密度分别为0.52克/毫升和0.18克/毫升。具有最高湿密度的两种泡沫体在模具表面形成薄膜。这是因为当泡沫体在底部附近缓慢干燥时发生孔合并。用直径1厘米的穿孔器从浇铸在4毫米高模具中的泡沫体冲切泡沫体圆片，测定干泡沫体密度，并称重。用卡规测量不同泡沫体的密度和厚度，结果示于表18。泡沫体还可以用其弹性模量，G′lin表征，具体使用和实施例10中所述的相同的流变仪设置，除了施加的应力范围为0.5-18Pa，每种泡沫体片继续三次变换。结果示于表19，列出对直径1厘米的三种不同泡沫体的最后两次变换的平均值。泡沫体片在转移到流变仪之前保持在2毫升Hanks溶液中约5分钟。
使用SMS纹理分析仪和A/TG张力把手测量干燥的泡沫体的抗张强度。读取以0.5毫米/秒拉伸泡沫体直到破裂所需的力，泡沫体破坏时的最大力和拉伸的距离示于表19。用解剖刀切割骨形泡沫体，其长3.15厘米，端部宽1.75厘米，中心宽1.25厘米，从距端部1厘米处开始变窄。切割这种形状的泡沫体，保证在泡沫体中部，不在附连与把手的部分发生破裂。
用泡沫体片各端约0.3厘米的部分将其固定于把手。
45秒。湿密度分别为0.52克/毫升和0.18克/毫升。具有最高湿密度的两种泡沫体在模具表面形成薄膜。这是因为当泡沫体在底部附近缓慢干燥时发生孔合并。用直径1厘米的穿孔器从浇铸在4毫米高模具中的泡沫体冲切泡沫体圆片，测定干泡沫体密度，并称重。用卡规测量不同泡沫体的密度和厚度，结果示于表18。泡沫体还可以用其弹性模量，G′lin表征，具体使用和实施例10中所述的相同的流变仪设置，除了施加的应力范围为0.5-18Pa，每种泡沫体片继续三次变换。结果示于表19，列出对直径1厘米的三种不同泡沫体的最后两次变换的平均值。泡沫体片在转移到流变仪之前保持在2毫升Hanks溶液中约5分钟。
使用SMS纹理分析仪和A/TG张力把手测量干燥的泡沫体的抗张强度。读取以0.5毫米/秒拉伸泡沫体直到破裂所需的力，泡沫体破坏时的最大力和拉伸的距离示于表19。用解剖刀切割骨形泡沫体，其长3.15厘米，端部宽1.75厘米，中心宽1.25厘米，从距端部1厘米处开始变窄。切割这种形状的泡沫体，保证在泡沫体中部，不在附连与把手的部分发生破裂。
用泡沫体片各端约0.3厘米的部分将其固定于把手。
[0473] 表19：具有不同密度和性质的壳聚糖泡沫体(n＝3，±SEM)(泡沫体湿密度为0.23克/毫升的泡沫体是实施例10的泡沫体)
[0474]
[0475] 该表显示具有最高湿密度的泡沫体因为聚集而发生最大程度的塌陷。还观察到泡沫体通过增大湿密度而增大孔径。抗张强度和弹性模量因空气量增加而下降。在材料破坏之前在拉伸材料长度时材料呈现的弹性通过降低湿密度而下降。三种密度较低的材料具有大致相同的弹性。
[0476] 实施例15
[0477] 此实施例描述加入钙离子的透明质酸(HA)泡沫体的制备。还显示泡沫体贡献这些离子以引发外部添加的藻酸盐溶液胶凝的能力。
[0478] 制备含2.5％HA的溶液并搁置一边。在混合碗中加入49.65克MQ-水、2.35克CaCl2*2H2O和10.5克山梨醇(干)，通过在碗中的温和涡流使干成分溶解。在同一混合碗中加入130克HA溶液、4.5克甘油和3.0克HPMC。然后，用Hobart厨房用混合器(装备有搅打器)以中等速度掺混该分散体2分钟确保均匀。以高速继续混合3分50秒。测定湿密度为0.21克/毫升(按照由填充100毫升容器所需的湿泡沫体的重量确定)。将湿泡沫体浇铸在2毫米和4毫米高的涂覆特氟隆的模具中，然后置于80℃干燥烘箱中干燥50分钟。
[0479] 使用穿孔器，由浇铸在4毫米高模具中的泡沫体冲切泡沫体圆片(直径＝2.1厘米)。通过添加MQ-水，由PRONOVA SLG 20(批号：221105)制备1.0％和0.5％藻酸盐溶液。将干泡沫体圆片放置在在缺口板之间的Bohlin CVO 120高分辨流变仪上(PP25)。然后，用吸液管加入350微升藻酸盐溶液。对1.0％和0.5％溶液，该泡沫体圆片的钙含量足以使加入的藻酸盐的胶凝残余物分别达到124％和248％饱和。1分钟后，吸收藻酸盐溶液，泡沫体接近完全水合。降低上板至500微米间隙，开始测量弹性模量，G’。频率、应变和温度分别设定为1Hz，0.001和20℃。结果示于表20。
[0480] 表20：在结合钙离子的HA泡沫体中
[0481] 加入水和藻酸盐溶液后随时间变化的弹性模量，G’
[0482]
[0483] 在添加藻酸盐溶液后紧接着的数分钟期间G’增大，证实胶凝离子的贡献，以及引发了胶凝反应。三种溶液的G’值之间的差异确定将形成凝胶，由最高浓度藻酸盐溶液形成强度最大的凝胶。
[0484] 此实施例描述具有结合的磷酸根离子的HA泡沫体的制备。还显示泡沫体贡献这些离子以引发外部添加的藻酸盐溶液胶凝的能力。
[0485] 实施例16
[0486] 此实施例描述加入磷酸根离子的HA泡沫体的制备。还显示泡沫体贡献这些离子以引发外部添加的藻酸盐溶液胶凝的能力。
[0487] 按照实施例15所述制备HA泡沫体，除了钙源被2.27克Na2HPO4替代以及水用量为49.7克。高速混合时间为3分钟，湿密度达到0.17克/毫升。浇铸在2毫米和4毫米模具中的泡沫体在80℃干燥烘箱中分别干燥45分钟和75分钟。
[0488] 采用在实施例A中描述的用于流变测定的同样参数。加入过量的水和1.0％壳聚糖溶液。描述弹性模量G’的值以及在该值下变平的相角均列于表21。
[0489] 表21：加入磷酸根离子的再水合HA泡沫体的弹性模量G’和相角
[0490]
[0491] 结果表明加入壳聚糖溶液的泡沫体产生更类似凝胶的性能，硬挺性大于加入MQ-水的泡沫体。
[0492] 实施例17
[0493] 此实施例描述含钙离子的壳聚糖泡沫体的制备。当藻酸盐溶液被干壳聚糖泡沫体吸收时，固定在壳聚糖泡沫体中的钙原位引发藻酸盐溶液的胶凝。这种结构可用于细胞固定的生物医学应用，或者提供固定药物、酶、激素等的受控释放。
[0494] 制备壳聚糖泡沫体，该泡沫体包含与实施例11相同组分和量，不同之处在于2.35克MQ-水被2.35克CaCl2*2H2O(80mM)替代。分别以中等速度和高速混合1.5分钟和6分钟制备湿密度为0.20克/毫升的湿泡沫体。按照前面所述将湿泡沫体浇铸在2毫米和4毫米高的模具中。然后，放置在80℃干燥烘箱中保持1.5小时。干泡沫体为软和柔韧的，具有3
开孔网络，干密度为0.039±0.001克/厘米 。该泡沫体立刻吸收水，具有和实施例10的同样厚度泡沫体的整体性。这种泡沫体与实施例10的泡沫体相比，在泡沫体中加入Hanks溶液时膨胀程度较小。测定泡沫体对Hanks溶液的吸收容量为16.8±1.9克/克泡沫体(三个样品的平均值±SD)。该泡沫体的孔略大于实施例10的4毫米厚度的泡沫体，这可由溶液的离子强度使壳聚糖粘度减小而导致更多聚集来说明。
开孔网络，干密度为0.039±0.001克/厘米 。该泡沫体立刻吸收水，具有和实施例10的同样厚度泡沫体的整体性。这种泡沫体与实施例10的泡沫体相比，在泡沫体中加入Hanks溶液时膨胀程度较小。测定泡沫体对Hanks溶液的吸收容量为16.8±1.9克/克泡沫体(三个样品的平均值±SD)。该泡沫体的孔略大于实施例10的4毫米厚度的泡沫体，这可由溶液的离子强度使壳聚糖粘度减小而导致更多聚集来说明。
[0495] 使用直径2.1厘米的穿孔器，从在4毫米高的盘中成形的泡沫体冲切泡沫体圆片。将干泡沫体圆片置于在缺口板之间的Bohlin CVO 120高分辨流变仪(PP25)上。然后用吸液管加入500微升1％藻酸盐(PRONOVA UP LVG)溶液。泡沫体圆片的钙含量足以使添加的藻酸盐的胶凝残余物达到96％饱和。1分钟后，吸收藻酸盐溶液，泡沫体接近完全水解。上板降低至1.000毫米间隙，开始测量弹性模量，G’。频率、应变和温度分别设定为1Hz，0.001和20℃。结果示于表22。
[0496] 表22：对添加藻酸盐溶液和水的壳聚糖泡沫体随时间变化的弹性模量G’(n＝3)[0497]
[0498] 加入藻酸盐溶液的泡沫体圆片的较高G’值以及在加入后的数分钟期间G’的增大都证实来自壳聚糖泡沫体的形成凝胶的离子对加入的藻酸盐溶液的作用。
[0499] 实施例18
[0500] (预示例)
[0501] 按照实施例2-9，13和16的过程，制备不含涂层的复合物。在该泡沫复合物的表面施加1毫升(每平方厘米泡沫体)5％w/v溶液-Pronova SLM20，施加的溶液与100mM溶液CaCl2在MOPS 1X洗涤缓冲溶液(Inotech EncapsulationAG，Dottikon，Switzerland)中接触5分钟。然后，在4分钟内该复合物用不含钙MOPS 1X缓冲剂洗涤两次。通过在该泡沫体的相反表面施加1毫升(每平方厘米泡沫体)5％w/v Pronova SLM20溶液。然后使施加的溶液与100mM溶液CaCl2在MOPS 1X洗涤缓冲溶液中接触5分钟。然后在4分钟内用不含钙的MOPS1X缓冲剂洗涤复合物两次。
[0502] 实施例19
[0503] (预示例)
[0504] 采用在“对来自销售体重猪的胰岛的分离和功能(The isolation andfunction of porcine islets from market weight pigs)，”Cell Transplant.2001，10：235-246(该文献全文参考结合于本文)描述的改进的静态消化方法，消化来自成熟猪的胰腺尾部供体。在胰腺灌注2-3倍体积(毫升/克)溶解于改性UW-M溶液的Liberase PI(Roche/Boerhinger Mannheim，0.5毫克/毫升)。对使胰腺进行注射，以达到充分膨胀，放置在1升无菌Nalgene瓶中，通过于37℃静态培养50分钟进行消化。根据肉眼检查腺头，通过添加Ham-F10+20％NCS终止消化。该细胞悬浮液通过不锈钢丝网(孔径1000pm)过滤，在Ham-F10+20％NCS中稀释。按照前面人胰岛分离获得的数据，消化的组织从6-毫米的玻璃珠床层通过，并通过500不锈钢丝网。组织流出物与3-4L冷Ham-F10+10％NCS收集在250毫升圆锥管中，于4℃以700转/分钟的转速进行离心，然后在预纯化柱(平均8管)后收集的细胞和碎片于4℃进行离心(630克，离心3分钟)。将所有细胞小球汇集在一个管内并悬浮在200毫升Ham-F10介质中。从该悬浮液中取出100p1上清液，以评价双硫腙污染后的消化结果(参见分离结果)。然后，细胞于4℃进行离心(280克，5分钟)，除去上清液，将细胞悬浮于75毫升Ficoll Eurocollins(Mediatech，Hemdon，USA)溶液，在梯度管中进行离心(ref：nalg3122-0250；VWR International，Leuven，Belgium)。
[0505] 静态法分离的胰岛于4℃以不连续Ficoll Euro-Collins梯度纯化。后消化的细3
胞小球悬浮于75毫升Ficoll Euro-Collins溶液(密度＝1.1克/厘米 )，将该悬浮液置
3
于平底试管中。然后顺序加入较低梯度菲科尔(Ficoll)(50毫升1,096克/厘米 ；50毫升
3
1,060克/厘米 和20毫升Ham-F10介质)。梯度试管以856克离心17分钟后，从1.1/1.096和1.096/1.060界面收集胰岛。将自各界面的胰岛悬浮于含50毫升Ham-F10+10％NCS血清的2个试管中。试管以280克离心3分钟，除去上清液，细胞用150ml Ham-F10介质洗涤。
该过程重复三次，最后，将胰岛悬浮在200 1n1 Ham-F10介质中用于分离结果研究。
胞小球悬浮于75毫升Ficoll Euro-Collins溶液(密度＝1.1克/厘米 )，将该悬浮液置
3
于平底试管中。然后顺序加入较低梯度菲科尔(Ficoll)(50毫升1,096克/厘米 ；50毫升
3
1,060克/厘米 和20毫升Ham-F10介质)。梯度试管以856克离心17分钟后，从1.1/1.096和1.096/1.060界面收集胰岛。将自各界面的胰岛悬浮于含50毫升Ham-F10+10％NCS血清的2个试管中。试管以280克离心3分钟，除去上清液，细胞用150ml Ham-F10介质洗涤。
该过程重复三次，最后，将胰岛悬浮在200 1n1 Ham-F10介质中用于分离结果研究。
[0506] 按照实施例6的过程，制备泡沫体圆片(直径＝2.1厘米)。将泡沫体圆片转移到12孔板的孔( Nalgene Nunc International)中，圆片与孔尺寸紧密配合。用吸液管将300微升含30,000成熟猪胰脏细胞的0.5％w/vNOVATACH RGD溶液逐滴分布在泡沫体上。然后，将泡沫体在37℃培养20分钟。
[0507] 然后，使用1毫升注射器将5％w/v PRONOVA SLM20溶液或3％PRONOVA SLM100藻酸盐基质溶液施加在泡沫复合物的一个表面上，施用的溶液与100mM CaCl2在MOPS 1X洗涤缓冲溶液(Inotech Encapsulation AG，Dottikon，Switzerland)中的溶液接触5分钟。然后，在4分钟内该复合物用无钙-MOPS 1X缓冲剂洗涤两次。培养后，用1毫升注射器在相反侧施加1％w/v PRONOVA SLM20或PRONOVASLM100溶液来涂覆泡沫体的另一侧，然后，施用的溶液与100mM CaCl2在MOPS 1X洗涤缓冲溶液的溶液接触5分钟。然后在4分钟内，复合物用无钙-MOPS 1X缓冲剂洗涤两次。
[0508] 实施例20
[0509] (预示例)
[0510] 通过机械搅拌藻酸盐、增塑剂、发泡剂和缓慢水解酸的水溶液的胶凝剂分散体(如CaCO3)制备藻酸盐泡沫体。因pH逐步下降，钙离子从颗粒释放，因此引发藻酸盐泡沫体结构的受控交联。搅拌后将湿藻酸盐泡沫体浇铸在含聚酯网状物的平模中。完成胶凝后，含该网状物的泡沫体在35-80℃干燥烘箱中空气干燥。然后将泡沫体切割成面积约为1平方厘米的圆形或正方形，置于密封包装中，然后进行高压灭菌或辐照灭菌。
[0511] 进行移植的前一天将来自供体动物或人的胰岛进行纯化，使用吸液管将含0.8％NOVATACH RGD悬浮液的胰岛小心施用于皮氏培养皿中的泡沫体上。这样使得胰岛被截留在形成的泡沫体-凝胶结构中。几分钟后，在皮氏培养皿小心施用几滴5％浓度的选择的高甘露糖醛酸(PRONOVA SLM20)含量的藻酸盐。将含胰岛的泡沫体放置在粘性藻酸盐溶液顶部，之后在该泡沫体上侧再滴加几滴直到完全涂覆泡沫体结构。然后在皮氏培养皿中小心加入100mM CaCl2在MOPS缓冲剂的溶液，直到泡沫体-凝胶被该溶液完全覆盖，因此该凝胶结构被胶凝离子完全饱和。约5分钟后，CaCl2溶液被适合于胰岛的含5mM CaCl2和5mMSrCl2的培养介质替代。这使得该泡沫体-凝胶结构进一步重排和稳定。约2小时后，该介质再次变换为未添加钙或锶的细胞介质。将器件储存在CO2保温箱，直到以后在患糖尿病灵长类动物中进行皮下植入。该器件设计成维持几个月调控体胰岛素，并随后用类似器件替换。
[0512] 除了在此描述的内容，本发明的各种变动对本领域技术人员在了解了前面所述内容后是显而易见的。这些变动也在权利要求书的范围之内。在本申请中列出的所有参考文献，包括所有专利、专利申请和公开都全部结合于本文。
[0513] 实施例21
[0514] 在此实施例中使用的藻酸盐是添加钙量足以使75％藻酸盐饱和。湿泡沫体配方列于表23。
[0515] 表23：湿泡沫体配方.
[0516]
[0517] 按照实施例1所述制备泡沫体，不同之处在于高速混合时间为6分钟，然后添加GDL溶液，再混合1.5分钟。形成的泡沫体的湿密度为0.22克/毫升。然后，将泡沫体浇铸在2毫米高度的涂覆特氟隆的模具中。然后，在泡沫体顶部设置圆形大孔过滤器(Spectra/Mesh大孔过滤器，直径：55毫米，网开孔：300微米，开孔面积：44％，厚度：258微米，art.：148300，来自SpectrumLaboratories Inc.，Rancho Dominguez，CA，USA)。胶凝期间该层状材料在环境温度保持未覆盖状态1小时，然后于80℃干燥1小时。或者，将湿泡沫体浇铸在涂覆特氟隆的模具(2毫米高)的顶部，所述模具在特氟隆和泡沫体之间设置有过滤器或者未设置。然后泡沫体胶凝1小时，之后层化，产生中部具有过滤器的泡沫体。然后，该泡沫体在80℃干燥1小时。两个干燥的泡沫体外观相似，优选描述的第一方法，因为该方法最容易实施。
[0518] 然后，将SiLi (类型：ZY Premium(烧结氧化锆珠粒，钇稳定的)，0.1-0.2毫米，art.：97015，Sigmund Lindner GmbH，Warmensteinach，Germany)悬浮于0.6％藻酸盐溶液(PRONOVA UP LVG，FP-502-04)，使用吸液管滴加在泡沫体上。10分钟后，用显微镜观察该泡沫体，观察在整个泡沫体的不同水平面的珠粒分布。选择SiLi珠粒来确定与一些细胞尺寸类似的颗粒以在藻酸盐溶液中的悬浮液形式滴加在泡沫体上时是否分布在泡沫体内。