一种龙血竭药材的检测方法

摘要

本发明提供了一种龙血竭药材的质量控制方法，该方法可以采用以下四种质量控制方法的任意一种或几种：(1)对总酚进行含量测定；(2)对7，4′-二羟基黄酮进行含量测定；(3)对龙血素B进行含量测定；(4)高效液相色谱指纹图谱检测。本发明提供的质量控制方法，准确，精密，稳定性好，能够有效地控制龙血竭药材的质量。

权利要求

1.一种龙血竭药材的质量检测方法，其特征在于采用以下方法中的任意一种或几种：(1)采用紫外-可见分光光度法检测，龙血竭药材中含总酚以7，4′-二羟基黄酮计不得少于30.0％，检测步骤如下：a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；

b.标准曲线的制备：量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸定容；照紫外-可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用10～30％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液并定容；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇定容，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸定容，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

(2)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材中含7，4′-二羟基黄酮不得少于0.20％，检测步骤如下：a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液为流动相；

b.对照品溶液制备：称取7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

c.供试品溶液制备：取龙血竭药材，研细，称定，置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，吸取该甲醇溶液，在硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿-甲醇溶液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置量瓶中，加入甲醇，称定重量，超声提取，放冷，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

(3)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40％，检测步骤如下：a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液；

b.对照品溶液的制备：称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

(4)采用高效液相色谱指纹图谱检测，其标准指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.40～0.60，2号峰0.45～0.65，3号峰0.55～0.75，4号峰

0.60～0.80，5号峰0.70～0.90，6号峰0.71～0.95，7号峰0.90～1.10，S号峰1.00，

8号峰1.01～1.25，其中S号峰为龙血素B的色谱峰，检测步骤如下：

a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱；

b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

2.如权利要求1所述总酚的含量测定方法，其特征在于：

a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1ml中含20～

40μg的溶液，即得；

b.标准曲线的制备：量取对照品溶液0ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别置

25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750～800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，约取10～30mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺1～3g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用10～30％的乙醇40～60ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80～120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750～800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。

3.如权利要求2所述含量测定方法，其特征在于：

a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液，即得；

b.标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，

0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，取约20mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80～100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5em层析柱，用20％的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液

5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，

0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

d.测定结果：龙血竭药材中含总酚以7，4′-二羟基黄酮计不得少于30.0％。

4.如权利要求1所述7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定：a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为20～30∶75～85为流动相，流速0.5～1.5ml/min，检测波长为310～350nm；

b.对照品溶液制备：称取干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成

1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

c.供试品溶液制备：取龙血竭药材，研细，取约0.10～0.20g，称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿-甲醇的比例为15～25∶0.5～1.5为展开剂展开，展距，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑，按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，加入甲醇10ml，称定重量，超声提取，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.如权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于：

a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相，流速1ml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于3000；

b.对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.15g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

e.测定结果：龙血竭药材中含7，4′-二羟基黄酮不得少于0.20％。

6.如权利要求1所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定：a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为30～50∶50～70为流动相，流速0.5～1.5ml/min，检测波长为250～300nm；

b.对照品溶液的制备：称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.3～0.8g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl注入液相色谱仪，测定，即得。

7.如权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于：

a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；

b.对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60℃水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

e.测定结果：龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40％。

8.如权利要求1所述指纹图谱测定方法，其特征在于高效液相色谱法测定：

a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在

80％；流速为0.4～1.0ml/min，检测波长为250～300nm；

b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.3～0.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5～20μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

9.如权利要求8所述的指纹图谱的应用，其特征为：

参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定：a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在

80％；流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于

6000；

b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含

50μg的溶液，即得参照物溶液；

c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

e.测定结果：供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。

说明书

一种龙血竭药材的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药分析领域，涉及一种中药材的质量控制方法，特别涉及一种龙血竭药材的质量控制方法。技术背景

[0002] 龙血竭为百合科剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂。主产于广西、云南。据《本草纲目》记载，性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效。现代医学研究证实，龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。

[0003] 《国家药品监督管理局国家标准》【WS3-082(Z-016)-99(Z)】项下收载了对龙血竭药材的性状、薄层鉴别、龙血素B的含量测定等检测方法，国家标准中未收载对总酚和7，4′-二羟基黄酮的含量测定项；此外，经检索，200510010851.1号专利提供了一种检测龙血竭药材中龙血素A和龙血素B含量的质量控制方法，但是该方法也没有对龙血竭药材中的总酚的含量、7，4′-二羟基黄酮的含量进行检测，本发明不仅提供了对龙血竭药材中的总酚与7，4′-二羟基黄酮含量的测定方法，而且还提供了不同于以往方法的另外一种测定龙血素B的方法，不仅如此，本发明还提供了龙血竭药材的标准指纹图谱与该图谱的应用方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的提供了一种对龙血竭药材中总酚、7，4′-二羟基黄酮、龙血素B三种指标成分进行含量测定的方法，以及龙血竭药材的指纹图谱的检测方法。 [0005] 本发明的目的是通过下列方式实现的：

[0006] 龙血竭药材的质量控制方法，可以采用以下方法中的任意一种或几种： [0007] (1)采用紫外-可见分光光度法检测，龙血竭药材中含总酚以7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计不得少于30.0％；

[0008] (2)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材中含7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)不得少于0.20％；

[0009] (3)采用高效液相色谱法检测，龙血竭药材中含龙血素B(C18H20O5)不得少于0.40％；

[0010] (4)采用高效液相色谱指纹图谱测定，其标准指纹图谱有9个共有峰，相对保留时间分别为1号峰0.40～0.60，2 号峰0.45～0.65，3号峰0.55～0.75，4号峰0.60～0.80，5号峰0.70～0.90，6号峰0.71～0.95，7号峰0.90～1.10，S号峰1.00，8号峰
1.01～1.25，其中S号峰为龙血素B的色谱峰。

[0011] 所述龙血竭药材中总酚的含量测定方法为：

[0012] a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液； [0013] b.标准曲线的制备：量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸；照紫外-可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

[0014] c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用10～30％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液并定容；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸定容，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。 [0015] 上述总酚的含量测定方法的优选为：

[0016] a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1ml中含20～40μg的溶液，即得；

[0017] b.标准曲线的制备：量取对照品溶液0ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750～800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

[0018] c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，约取10～30mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺1～3g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用10～30％的乙醇40～60ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80～120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加
0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照 紫外-可见分光光度法，在750～800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。

[0019] 上述总酚含量测定方法的优选为：

[0020] a.对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液，即得；

[0021] b.标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； [0022] c.供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，取约20mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释，摇匀；取80～100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20％的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液
5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，
0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

[0023] 本发明中0.3％的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为：取0.3g十二烷基磺酸钠，置100ml容量瓶中，加50％乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50％乙醇溶液定容至刻度，即得。 [0024] d.测定结果：龙血竭药材中含总酚以7，4′-二羟基黄酮计不得少于30.0％。 [0025] 所述龙血竭药材中7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法为：

[0026] 采用高效液相色谱法测定：

[0027] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液为流动相；

[0028] b.对照品溶液制备：称取7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

[0029] c.供试品溶液制备：取龙血竭药材，研细，称定，置量瓶中，加甲醇稀释至刻度，吸取该甲醇溶液，在硅胶G薄层板上，点供试样 品溶液和对照品溶液，以氯仿-甲醇溶液为展开剂展开，展距，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置量瓶中，加入甲醇，称定重量，超声提取，放冷，加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液； [0030] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0031] 上述7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法优选为：

[0032] 采用高效液相色谱法测定：

[0033] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为20～30∶75～85为流动相，流速0.5～1.5ml/min，检测波长为310～350nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于2000；

[0034] b.对照品溶液制备：称取干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0035] c.供试品溶液制备：取龙血竭药材，研细，取约0.10～0.20g，称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，点供试样品溶液和对照品溶液，以氯仿-甲醇的比例为15～25∶0.5～1.5为展开剂展开，展距，取出，晾干，置紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑，按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，加入甲醇10ml，称定重量，超声提取，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

[0036] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0037] 上述7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法优选为：

[0038] 采用高效液相色谱法测定：

[0039] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相，流速1ml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于3000；

[0040] b.对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0041] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.15g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品 溶液，以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

[0042] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0043] e.测定结果：龙血竭药材中含7，4′-二羟基黄酮不得少于0.20％。 [0044] 所述龙血素B的含量测定方法为：

[0045] 采用高效液相色谱法测定：

[0046] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液；

[0047] b.对照品溶液的制备：称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液； [0048] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液；

[0049] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0050] 上述龙血素B的含量测定方法的优选为：

[0051] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为30～50∶50～70为流动相，流速0.5～1.5ml/min，检测波长为250～300nm；

[0052] b.对照品溶液的制备：称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0053] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.3～0.8g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0054] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0055] 上述龙血素B的含量测定方法的优选为：

[0056] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相，流速1.0ml/min，检测 波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；

[0057] b.对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0058] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.5g，精密称 定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60℃水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； [0059] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0060] e.测定结果：龙血竭药材中含龙血素B不得少于0.40％。

[0061] 所述龙血竭药材指纹图谱测定方法为：

[0062] 高效液相色谱法测定：

[0063] a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱；

[0064] b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液； [0065] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；

[0066] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0067] 上述龙血竭药材指纹图谱测定方法的优选为：

[0068] 采用高效液相色谱法测定：

[0069] a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50 min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在80％；流速为0.4～1.0ml/min，检测波长为250～300nm；

[0070] b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；

[0071] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.3～0.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0072] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5～20μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0073] 上述龙血竭药材指纹图谱测定方法的优选为：

[0074] 参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定：

[0075] a.色谱条件与系统适应性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A：0.1％的磷酸与B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50 min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在80％；流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000；

[0076] b.参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；

[0077] c.供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0078] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0079] e.测定结果：供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。

[0080] 对本发明提供的质量控制方法的研究与说明：

[0081] 一、对总酚含量测定方法的研究与说明

[0082] 1、测定条件的考察：

[0083] (1)仪器与试药：紫外分光光度计，7，4′-二羟基黄酮(纯度为98.23％)；水(超纯水)，其余试剂均为分析纯；

[0084] (2)供试品制备与含量测定：取龙血竭药材，研细，取约20mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80～100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20％的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。

[0085] 2、7，4 ′-二羟基黄酮线性关系和回归方程：

[0086] (1)对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32.5μg的溶液，即得；

[0087] (2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在780nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线；测定结果见表1，标准曲线见附图1，结果表明线性关系良好；

[0088] 回归方程：y＝0.1065x-0.0131

[0089] 其中x为浓度(μg/ml)，A为吸收度；相关系数：r＝0.9996

[0090] 表1 7，4′-二羟基黄酮标准曲线

[0091]

[0092] 3、精密度试验

[0093] 取龙血竭药材，按本发明提供的方法制备成供试品溶液，在6分钟内，连续测定6次，结果表明精密度良好，结果见表2；

[0094] 表2精密度试验结果

[0095]

[0096] 4、稳定性试验

[0097] 取龙血竭药材，按本发明提供的方法制成供试品溶液，分别在不同时间测定其吸收度，结果表明，供试品溶液在0～6分钟吸收度保持相对稳定，所以样品测定应在6分钟之内完成，试验结果见表3；

[0098] 表3样品稳定性考察数据

[0099]

[0100] 5、重复性试验

[0101] 取龙血竭药材样品6份，按本发明提供的方法测定，结果表明样品测定重现性好，试验结果见表4；

[0102] 表4重复性试验结果

[0103]

[0104] 6、加样回收试验

[0105] 取同一批号已知含量的龙血竭药材6份，每份约10mg，精密称 定，置25ml棕色容量瓶中，分别加入7，4′-二羟基黄酮对照品4mg，按本发明提供的方法测定，计算总酚的含量和加样回收率，结果见表5：

[0106] 表5加样回收试验结果

[0107]

[0108] 7、十批药材含量测定

[0109] 取十批龙血竭药材，按本发明提供的方法测定，结果见表6；

[0110] 表6十批龙血竭药材

[0111]

[0112] 根据样品测定结果，规定本品按干燥品计算，含总酚以7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计，不得少于30.0％。

[0113] 二、7，4′-二羟基黄酮含量测定方法的研究与说明

[0114] 1、系统适应性研究与检测方法

[0115] (1)测定成分和测定方法的选择：龙血竭有效成分为黄酮类化合物，其中7，4′-二羟基黄酮为主要有效成分，为了更好地控制有效成分的含量，因此选择7，4′-二羟基黄酮作为含量测定的成分。

[0116] 龙血竭所含的有效成分黄酮类化合物种类较多，分离较困难。根据发明人多年对龙血竭化学成分研究的经验，采用高效液相色谱法可将其有效成分进行较好分离，易于测定，所以选择高效液相色谱法进行测定；

[0117] (2)仪器与试药：高效液相色谱仪；紫外检测器；乙腈(色谱纯)，水(超纯水)，7，4′-二羟基黄酮对照品，纯度为98.23％；

[0118] (3)色谱条件：色谱柱：C18柱；流动相：乙腈-1％冰醋酸溶液比例为24∶76；流速：1ml/min；检测波长：330nm；

[0119] (4)系统适应性试验：经紫外扫描，7，4′-二羟基黄酮的紫外最大吸收波长为330nm；柱温：30℃；

[0120] (5)理论塔板数(n)：按上述条件测得理论塔板数以7，4′-二羟基黄酮计为3750符合药典规定；

[0121] (6)7，4′-二羟基黄酮对照品的标定：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮10mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度；精密吸取该溶液20μl，注入液相色谱仪中，测定峰面积，按面积归一化法计算含量；测得对照品含量为98.23％； [0122] (7)含量测定：对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0123] 供试品溶液的制备：取本品110mg，加甲醇溶解于25ml量瓶中，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，加甲醇8ml，超声5分钟，冷却至室温，加甲醇至刻度，用0.5μm滤膜滤过，作为供试品溶液； [0124] 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0125] 2、7，4′-二羟基黄酮标准曲线的制作

[0126] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮11.5mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取该溶液1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液；精密吸取对照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10μl，测定峰面积，见表7，以峰面积为纵坐标(Y)，进样浓度为横坐标(X)，作图，得标准曲线，见表7与附图2；

[0127] 线性关系和回归方程：

[0128] 回归方程为Y＝60.024X-6.7217；

[0129] r＝1；线性范围为：2.3～23μg/ml；

[0130] 结果表明，线性关系良好；

[0131] 表7 7，4′-二羟基黄酮标准曲线

[0132]

[0133] 3、精密度试验

[0134] 精密吸取对照品(4.6μg/ml)溶液10μl，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD＝0.28％，结果见表8，表明精密度良好：

[0135] 表8精密度试验结果

[0136]

[0137] 4、稳定性试验

[0138] 取样品，按供试品溶液的制备方法制备，分别在配置后不同时间测定，结果见表9，结果表明供试品在15小时内稳定；

[0139] 表9样品稳定性考察数据

[0140]

[0141] 5、重复性试验

[0142] 精密称取同一批号样品5份，按本发明提供的方法测定，结果见表10，结果表明方法重复性较好；

[0143] 表10重复性试验结果

[0144]

[0145] 6、加样回收试验

[0146] 精密称取同一批号已知含量的样品(含7，4′-二羟基黄酮为3.38mg/g)约55mg五份，分别精密加入浓度为820.4μg/ml的7，4′-二羟基黄酮对照品溶液1.0ml，按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备，测定，结果平均加样回收率为98.94％，RSD＝1.55％，结果见表11：

[0147] 表11加样回收试验结果

[0148]

[0149] 7、十批样品含量测定

[0150] 取十批龙血竭药材，按本发明提供的方法测定，结果见表12；

[0151] 表12十批样品含量

[0152]

[0153] 限度确定：根据龙血竭药材10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)含量不得少于0.20％。

[0154] 三、龙血素B含量测定方法的研究与说明

[0155] 1、系统适应性研究与检测方法

[0156] (1)仪器与试药：高效液相色谱仪，紫外检测器，龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所)，乙腈(色谱纯)，水(超纯水)；

[0157] (2)色谱条件：流动相的选择：通过对多个流动相系统进行了考察，结果表明乙腈-1％冰醋酸(HAC)比例为40∶60系统作为流动相，供试品色谱图中龙血素B与其它峰能够达到很好的分离；所以，选择乙腈-1％HAC比例为40∶60系统作为流动相； [0158] (3)测定波长的选择：通过实验验证，在278nm处，供试品色谱中龙血素B与其它峰能够达到很好的分离，阴性样品无干扰；将测定波长定为278nm；

[0159] (4)柱温：30℃；

[0160] (5)理论塔板数：经研究确定，在系统实验中龙血素B的理论塔板数不得低于4000；

[0161] (6)含量测定：供试品溶液制备：发明人考察了龙血竭提取溶剂、提取方式、提取时间、对龙血竭药材中龙血素B含量测定结果的影响，确定供试品制备方法为：精密称取龙血竭药材粉末0.5g，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60℃水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中并用甲醇定容到刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液；

[0162] (7)对照品溶液制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0163] 2、线性关系考察

[0164] 精密称取龙血素B对照品10.05mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀；得浓度为100.5μg/ml的标准品储备液，分别精密吸取上述溶液0.4ml，1.0ml，2.0ml，4.0ml，6.0ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10μl，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线；结果表明龙血素B在4.02μg/ml～
100.5μg/ml范围内呈良好线性关系，回归方 程为Y＝35.206X-17.105，r＝0.9999；结果见表13与附图3：

[0165] 表13标准曲线的测定

[0166]

[0167] 3、精密度试验

[0168] 精密吸取对照品(20.1μg/ml)溶液10μl，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD＝0.16％，结果见表14，表明精密度良好：

[0169] 表14精密度试验

[0170]

[0171] 4、稳定性试验

[0172] 密称取龙血竭药材粉末0.5g，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60℃水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中并用甲醇定容到刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液；精密吸取供试品溶液10μl，分别于不同时间进样，共进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD＝1.06％，结果表明龙血素B峰面积在15小时内基本稳定，结果见表15：

[0173] 表15稳定性试验

[0174]

[0175] 5、重复性试验

[0176] 取龙血竭药材粗粉，按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备，平行试验5份，测定，结果龙血素B平均含量为4.59mg/g，RSD＝1.36％，结果见表16：

[0177] 表16重复性试验

[0178]

[0179] 6、加样回收率试验

[0180] 取同一批号已知含量的龙血竭药材(含量：4.59mg/g)约0.25g五份，分别精密加入浓度为210.0μg/ml的龙血素B对照品溶液10.0ml，按龙血竭药材供试品溶液制备方法制备，测定，结果平均加样回收率为99.81％，RSD＝1.29％；结果见表17： [0181] 表17加样回收率试验

[0182]

[0183] 7、样品测定

[0184] 依本发明提供的方法对十批龙血竭药材进行测定，结果见表18：

[0185] 表18 10批龙血竭中龙血素B含量测定

[0186]

[0187] 限度确定：根据龙血竭药材10批20个数据的含测结果，规定本品含龙血素B(C18H20O5)不得少于0.40％。

[0188] 四、指纹图谱测定方法的研究与说明：

[0189] (一)概述

[0190] 为了更全面、有效的控制龙血竭药材质量，提高质量控制水平，发明人参照中药注射剂指纹图谱的要求，对龙血竭药材指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批龙血竭药材指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，制定了龙血竭药材的标准指纹图谱，从而达到能够更全面、有效地控制药材质量的目的。

[0191] 通过对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对药材指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。所以，采用该软件做为龙血竭药材指纹图谱相似度计算软件。

[0192] (二)标准指纹图谱的研究说明

[0193] 1、参照物：

[0194] 根据对龙血竭的成分的分析，所以选择龙血素B作为参照物；

[0195] 2、供试品溶液制备：

[0196] 经过试验考察，50％甲醇提取所得供试品溶液能够较全面的反映成品中的主要成分，且重复性较好，所以确定50％甲醇做为提取溶剂，又对提取方法进行了考察，发现回流提取与超声提取对供试品的指纹图谱影响不大，最终确定龙血竭药材指纹图谱测定供试品制备方法为：取龙血竭药材粉末，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中， 精密加50％甲醇25ml，超声处理(250W、40KHz)30min，滤过，取续滤液做为供试品溶液； [0197] 3、检测方法

[0198] (1)仪器和试剂：

[0199] 仪器：高效液相色谱仪；多波长紫外-可见检测器，全自动进样器，流动相为A：0.1％磷酸与B：甲醇，梯度洗脱，洗脱顺序为：

[0200] 时间(min) A％(0.1％磷酸) B％(乙腈)

[0201] 0 70 30

[0202] 50 20 80

[0203] 60 20 80

[0204] 流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物(龙血素B)峰计算，应不低于6000；

[0205] 试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；

[0206] (2)色谱柱：

[0207] 经试验考察，发现Waters Xterra C18色谱柱对制剂中各成分分离效果最好，因此选择用该类型色谱柱作为龙血竭药材指纹图谱测定色谱柱；

[0208] (3)测定波长：发明人检测了五个波长下的指纹图谱，经比较分析，确定280nm为龙血竭药材指纹图谱的检测波长，在该波长下的指纹图谱中，除已知成分龙血素B能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好；

[0209] 4、稳定性试验

[0210] 取龙血竭药材，按本发明提供的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每隔3小时测定一次其指纹图谱，共测6次，结果见表19，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求；

[0211] 表19稳定性分析结果

[0212]时间 数据文件 相似度(参照) 相似度(对照)
对照图谱 龙血竭药材对照图谱.Scp 1.000 0.942
0小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
3小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
6小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
9小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
12小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
15小时 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998

[0213] 5、精密度试验

[0214] 取龙血竭药材，按本发明供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定；测定结果见表20、21、22；结果表明， 供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD＜3％)，又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求，表明该方法精密度良好；

[0215] 表20精密度考察结果

[0216] (占总峰面积5％以上主要峰的保留时间)

[0217]

[0218] 表21精密度考察结果

[0219] (占总峰面积5％以上的主要峰的峰面积)

[0220]

[0221] 表22精密度分析结果

[0222] (参照文件名为：龙血竭药材对照图谱.Scp)

[0223]次数 数据文件 相似度(参照) 相似度(对照)
对照图谱 龙血竭药材对照图谱.Scp 1.000 0.942
1 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
2 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
3 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
4 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
5 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998
6 SIGNAL01.cdf 0.918 0.998

[0224] 6、重复性试验

[0225] 取龙血竭药材，按本发明提供的供试品溶液的制备方法制备供试 品溶液，同法制备供试品溶液5份，依法测定，结果见表23，计算相似度，相似度结果均不小于0.95，符合指纹图谱的技术要求；

[0226] 表23重复性分析结果

[0227] (参照文件名为：龙血竭药材对照图谱.Scp)

[0228]次数 数据文件 相似度(参照) 相似度(对照)
对照图谱 龙血竭药材对照图谱.Scp 1.000 0.951
1 SIGNAL01.cdf 0.918 0.995
2 SIGNAL01.cdf 0.918 0.995
3 SIGNAL01.cdf 0.918 0.995
4 SIGNAL01.cdf 0.918 0.995
5 SIGNAL01.cdf 0.916 0.961

[0229] 根据方法学考察结果，表明该方法测定龙血竭药材的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱；

[0230] 7、十批药材的测定及标准指纹图谱的获得

[0231] 十批成品按本发明提供的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表24，结果计算相似度，在相似度软件中以这十批供试品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为标准指纹图谱，见附图4，并规定龙血竭药材指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于0.80。

[0232] 表24龙血竭药材指纹图谱-十批分析结果

[0233] (参照文件名为：龙血竭药材对照图谱.Scp)

[0234]批号 数据文件 相似度(参照) 相似度(对照)
030512 SIGNAL01.cdf 0.967 0.959
030517 SIGNAL01.cdf 0.951 0.951
030526 SIGNAL01.cdf 0.964 0.958
030603 SIGNAL01.cdf 0.975 0.971
030610 SIGNAL01.cdf 0.909 0.921
030625 SIGNAL01.cdf 0.929 0.936
030719 SIGNAL01.cdf 0.883 0.896
030706 SIGNAL01.cdf 0.909 0.921
030723 SIGNAL01.cdf 0.903 0.912
对照图谱 龙血竭药材对照图谱.Scp 1.000 0.999
030801 SIGNAL01.cdf 0.906 0.921

[0235] 本发明的有益效果：

[0236] 1、本发明提供了对龙血竭药材中总酚、7，4′-二羟基黄酮和龙血素B三种成分含量测定的方法，这些方法在原有的质量标准中都没有，对这三种成分的含量进行检测，可以更加真实地反应龙血竭药材的质量；

[0237] 2、本发明还提供了一种龙血竭药材的指纹图谱检测方法，这种指纹图谱的检测方法可以全面地反应龙血竭药材的质量，对控制龙血竭药材的质量大有帮助； [0238] 3、本发明的提供的方法具有良好准确性、稳定性和重复性，可 以应用于大工业生产中，是非常好的质量控制方法。

附图说明

[0239] 附图1：总酚含量测定中的7，4′-二羟基黄酮标准曲线

[0240] 附图2：7，4′-二羟基黄酮含量测定中的7，4′-二羟基黄酮标准曲线 [0241] 附图3：龙血竭药材龙血素B含测标准曲线

[0242] 附图4：龙血竭药材标准指纹图谱

具体实施方式

[0243] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

[0244] 实施例1：总酚的含量测定方法

[0245] a.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23％ [0246] 对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含28μg的溶液，即得；

[0247] b.标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.2％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.5％的铁氰化钾溶液1ml，0.8％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置4min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置30分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在750nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； [0248] 其中0.2％的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为：取0.2g十二烷基磺酸钠，置
100ml量瓶中，加50％乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50％乙醇溶液定容至刻度，即得； [0249] c.供试品来源：龙血竭药材，西双版纳药业有限责任公司，批号：070618 [0250] 供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，取19.95mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80目的聚酰胺1g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置65℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用15％的乙醇
40ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液5ml，置
25ml棕色量瓶中，加0.2％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.5％的铁氰化钾溶液1ml，0.8％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置4min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置40分钟，即得供试品溶液； 照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

[0251] d.测定结果：龙血竭药材按干燥品计算，含总酚以7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计，为6.98mg，不少于30.0％，符合要求。

[0252] 实施例2：总酚的含量测定方法

[0253] a.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23％ [0254] 对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32μg的溶液，即得；

[0255] b.标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线； [0256] 其中0.3％的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为：取0.3g十二烷基磺酸钠，置
100ml量瓶中，加50％乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50％乙醇溶液定容至刻度，即得； [0257] c.供试品来源：广西中医学院制药厂，批号：070702

[0258] 供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，取20.05mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取90目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20％的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6％的铁氰化钾溶液1ml，0.9％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

[0259] d.测定结果：龙血竭药材按干燥品计算，含总酚以7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计，为7.62mg，不少于30.0％，符合要求。

[0260] 实施例3：总酚的含量测定方法

[0261] a.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23 ％ [0262] 对照品溶液的制备：取7，4′-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含35μg的溶液，即得；

[0263] b.标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.4％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.7％的铁氰化钾溶液1ml，1.0％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置10min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置40分钟，以第一份为空白；照中国药典2005年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

[0264] 其中0.4％的十二烷基磺酸钠溶液的制备方法为：取0.4g十二烷基磺酸钠，置100ml量瓶中，加50％乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50％乙醇溶液定容至刻度，即得； [0265] c.供试品来源：云南云河药业有限责任公司，批号：070407

[0266] 供试品溶液制备与测定法：取龙血竭药材，研细，取20.10mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置75℃水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用25％的乙醇60ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇110ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.4％的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.7％的铁氰化钾溶液1ml，1.0％三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置10min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置40分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；

[0267] 供试品来源：

[0268] d.测定结果：龙血竭药材按干燥品计算，含总酚以7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)计，为7.64mg，不少于30.0％，符合要求。

[0269] 实施例4：7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法：

[0270] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0271] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为20∶75为流动相，流0.8ml/min，检测波长为320nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于2500；

[0272] b.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23％； [0273] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟 基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0274] c.供试品来源：西双版纳药业有限责任公司，批号：070618

[0275] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.12g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为18∶0.8为展开剂展开，展距15cm，取出，晾干，置360nm紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取4分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

[0276] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0277] e.测定结果：龙血竭药材含7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.30mg，不低于0.2％，符合要求。

[0278] 实施例5：7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法：

[0279] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0280] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为24∶76为流动相，流速1ml/min，检测波长为330nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于3000；

[0281] b.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23％； [0282] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0283] c.供试品来源：广西中医学院制药厂，批号：070702

[0284] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.15g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为20∶1为展开剂展开，展距16cm，取出，晾干，置365nm紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取5分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤 膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

[0285] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0286] e.测定结果：龙血竭药材含7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.42mg，不低于0.2％，符合要求。

[0287] 实施例6：7，4′-二羟基黄酮的含量测定方法：

[0288] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0289] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸溶液的比例为28∶86为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为335nm，理论塔板数按7，4′-二羟基黄酮峰计，应不低于3000；

[0290] b.对照品来源：7，4′-二羟基黄酮，供含量测定用，纯度为98.23％； [0291] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的7，4′-二羟基黄酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液；

[0292] c.供试品来源：云南云河药业有限责任公司，批号：070407

[0293] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.18g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取该甲醇溶液2ml，在以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(20×20cm)上，于左边距1cm，底边距、右边距2cm处呈条状点样，于右边距1cm处点5μl对照品溶液，以氯仿-甲醇比例为22∶1.2为展开剂展开，展距18cm，取出，晾干，置370nm紫外灯下观察荧光，并与对照品荧光斑点对照，标记供试品与对照品相应位置的色斑；按标记刮取色斑，置10ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，250w，40KHz超声提取8分钟，放冷至室温，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液；

[0294] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0295] e.测定结果：龙血竭药材含7，4′-二羟基黄酮(C15H10O4)为0.54mg，不低于0.2％，符合要求。

[0296] 实施例7：龙血素B的含量测定方法：

[0297] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0298] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为35∶55为流动相，流速0.8ml/min，检测波长为270nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；

[0299] b.对照品来源：龙血素B对照品，中国药品生物制品检定所， 供含量测定用； [0300] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加45％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0301] c.供试品来源：西双版纳药业有限责任公司，批号：070618

[0302] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.45g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加25ml乙醚，置55℃水浴锅表面，加热回流50分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； [0303] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0304] e.测定结果：龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为1.94mg，不低于0.4％，符合要求。 [0305] 实施例8：龙血素B的含量测定方法：

[0306] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0307] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为40∶60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；

[0308] b.对照品来源：龙血素B对照品，中国药品生物制品检定所，供含量测定用； [0309] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0310] c.供试品来源：广西中医学院制药厂，批号：070702

[0311] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.50g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60℃水浴锅表面，加热回流60分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； [0312] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0313] e.测定结果：龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为2.40mg，不低于0.4％，符合要求。 [0314] 实施例9：龙血素B的含量测定方法：

[0315] 照中国药典2005年版一部附录VID的高效液相色谱法测定：

[0316] a.色谱条件和系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1％冰醋酸水溶液比例为45∶65为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为280nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；

[0317] b.对照品来源：龙血素B对照品，中国药品生物制品检定所，供含量测定用； [0318] 对照品溶液的制备：精密称取60℃减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加55％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，作为对照品溶液；

[0319] c.供试品来源：云南云河药业有限责任公司，批号：070407；

[0320] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.55g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置65℃水浴锅表面，加热回流65分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至25ml，摇匀，再精密吸取1ml至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液； [0321] d.测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

[0322] e.测定结果：龙血竭药材含龙血素B(C18H20O5)为2.75mg，不低于0.4％，符合要求。 [0323] 实施例10：指纹图谱测定

[0324] 参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定：

[0325] a.色谱条件与系统适应性：Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Waters Xterra C184.6×250mm，5μm，流动相为A：0.1％的磷酸与流动相B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在80％；流速为0.5ml/min，检测波长为275nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000； [0326] b.参照物来源：龙血素B，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用； [0327] 参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；

[0328] c.供试品来源：广西中医学院制药厂，批号：070702

[0329] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.45g，置锥形瓶 中，精密加入45％甲醇25ml，250W、40KHz超声处理25min，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0330] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0331] e.测定结果：供试品指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.42，2号峰0.49，3号峰0.60，4号峰0.65，5号峰0.72，6号峰0.77，7号峰0.95，S号峰1.00，8号峰1.08，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.83，大于0.80，符合要求。

[0332] 实施例11：指纹图谱测定

[0333] 参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定：

[0334] a.色谱条件与系统适应性：Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Waters Xterra C18 4.6×250mm，5μm，流动相为A：0.1％的磷酸与流动相B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在80％；流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000； [0335] b.参照物来源：龙血素B，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用； [0336] 参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含
50μg的溶液，即得参照物溶液；

[0337] c.供试品来源：广西中医学院制药厂，批号：070606

[0338] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.50g，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0339] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0340] e.测定结果：供试品指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.50，2号峰0.55，3号峰0.65，4号峰0.70，5号峰0.80，6号峰0.83，7号峰0.97，S号峰1.00，8号峰1.13，其中S号峰为龙血素B的色谱峰。

[0341] 指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.85，大于0.80，符合要求。 [0342] 实施例12：指纹图谱测定

[0343] 参照中国药典2005版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定：

[0344] a.色谱条件与系统适应性：Agilent 1100液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Waters Xterra C184.6×250mm，5μm，流动相为A：0.1％的磷酸与流动相B：乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为：0～50min时，流动相A从70％线性下降至20％，流动相B从30％线性上升至80％，50～60min时，流动相A保持在20％，流动相B保持在80％；流速为0.8ml/min，检测波长为285nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000； [0345] b.参照物来源：龙血素B，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用； [0346] 参照物溶液的制备：取龙血素B对照品适量，精密称定，加55％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得参照物溶液；

[0347] c.供试品来源：云南云河药业有限责任公司，批号：070407

[0348] 供试品溶液的制备：取龙血竭药材，研细，取0.55g，置锥形瓶中，精密加入55％甲醇25ml，250W、40KHz超声处理35min，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

[0349] d.测定法：精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，即得；

[0350] e.测定结果：供试品指纹图谱有9个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.55，2号峰0.60，3号峰0.65，4号峰0.75，5号峰0.85，6号峰0.92，7号峰0.98，S号峰1.00，8号峰1.11，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度为0.88，大于0.80，符合要求。