一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术

摘要

一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，发明人：季孔庶、王金玲以马尾松成熟胚为外植体建立起了一项包括丛生芽诱导、伸长和生根的植株再生技术。丛生芽诱导以DCR+6-BA1.0毫克/升+NAA 0.1毫克/升效果最佳，诱导率高达90.63％；DCR+AC1.0克/升的培养基能促进丛生芽伸长，且效果最佳；生根培养以DCR+NAA0.5毫克/升的诱导效果最佳，生根率达92.5％；培养基中添加1.0克/升活性炭有利于根的进一步伸长生长。

权利要求

1.一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，其特征在于以下三个部分组成：

(1)不定芽诱导：将马尾松成熟离体胚，接种到诱导培养基上，该培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤0.5-2毫克/升、萘乙酸0.05-0.15毫克/升或吲哚乙酸

0.05-0.15毫克/升、蔗糖30克/升。培养20天左右，待培养物诱导处芽原基后，即开始下一阶段；

(2)芽的分化与伸长：将第1步所得的培养物转移到分化培养基上，分化培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤0.5毫克/升、吲哚乙酸0.05毫克/升、蔗糖30克/升以及琼脂5.6-6.0克/升。培养数天，待分化出小芽后，即可进行芽的伸长，芽伸长培养基的成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸0.01-0.1毫克/升或吲哚乙酸0.01-0.1毫克/升或活性炭0-2.0克/升、蔗糖30克/升。培养30-40天，待小苗长到常规生根程序所需高度时，进入以下第3步；

(3)生根：将第2步所得的小苗齐根取下，转至常规生根培养基中，生根培养基的成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸0.2-2.0毫克/升或吲哚乙酸0.2-2.0毫克/升、蔗糖30克/升，培养28-35天，小苗根部开始出现白色的短根，此时，培养基中添加适量活性炭有利于根的伸长。之后培养30天左右，即可移栽长成正常的马尾松植株。

2.按权利要求1所述的马马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的诱导培养基中6-苄基嘌呤0.5-2.0毫克/升、萘乙酸0.05-0.15毫克/升或吲哚乙酸

0.05-0.15毫克/升、蔗糖30克/升。

3.按权利要求1所述的马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的伸长培养基中萘乙酸0.01-0.1毫克/升或吲哚乙酸0.01-0.1毫克/升或活性炭0-2.0克/升、蔗糖30克/升。

4.按权利要求1所述的马尾松离体胚丛生芽诱导及植株再生，其特征在于所述的生根培养基中萘乙酸0.2-2.0毫克/升或吲哚乙酸0.2-2毫克/升、蔗糖30克/升。

说明书

一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术

一、技术领域

[0001] 本发明涉及木本植物组织培养技术领域二、背景技术

[0002] 马尾松原产我国，是秦岭以南各省重要的荒山绿化、造纸原料林和采脂林、自然风景林的重要树种之一，是我国分布面积最广的树种。其生长迅速，生产力高，适应性强。力学性质好等特点，也广泛被用于建筑、坑木、枕木、桥梁等工程，也可作为纤维板、刨花板、胶合板工业的原料，具有重要的经济价值。目前马尾松良种主要以种子园和母树林的有性繁殖为主。然而，有性繁殖存在着分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而无性繁殖却能克服有性繁殖的上述不足。但马尾松的传统无性繁殖技术(扦插和嫁接)目前仍难满足造林的需求，制约了马尾松良种繁育的进程。

[0003] 采用组织培养技术繁殖植物可以得到很高的繁殖效率，植物组织培养技术是利用植物细胞全能性(即每个细胞具有该植物的全部遗传信息，在一定培养条件下离体细胞具有发育成完整植株的潜在能力)，采取植物体上的细胞团、分生组织或营养器官的微小部分，通过人工配制不同营养成分和激素调控，使这些组织细胞形成成千上万小植株并且保存母体内全部优良遗传性状，此种方法可在短时间内获得大量试管苗，可在车间内进行，实施工厂化生产，获得的幼苗存放在人工控制的培养室内，可一年四季进行生产。而且在极少的面积内进行大规模生产，因而不占用土地。如果利用组织培养技术繁殖马尾松，不仅为扩大繁殖马尾松良种提供了一个新的途径，也可为马尾松分子设计育种创造条件，意义重大。

[0004] 然而马尾松组织培养较难，诱导产生的芽不易分化伸长，且小苗生根率极低。黄健秋、卫志明等对马尾松成熟胚进行体细胞胚胎诱导并获得再生植株，共诱导产生27个子叶胚，最终只产生2株完整小植株，其余均只能稍伸长或停止生长，体细胞胚转换成小植株的频率仅为7.4％；张宇对马尾松进行组织培养，有一定的芽诱导率，但生根率仅为70％，无法满足生产的要求。为此，本发明旨在研制适于马尾松成熟胚作为外植体的高效繁殖技术。三、发明内容

[0005] 本发明提供了一项以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养技术，包括以下几个步骤

[0006] 1、不定芽诱导

[0007] 将马尾松胚从成熟种子中剥离出来，水平接种到芽诱导培养基上，该培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤(6-BA)0.5-2.0毫克/升，最佳浓度为0.5-1.0毫克/升、萘乙酸(NAA)0.05-0.15毫克/升或吲哚乙酸(IBA)0.05-0.15毫克/升，最佳浓度为萘乙酸(NAA)0.05-0.1毫克/升或吲哚乙酸(IBA)0.1-0.2毫克/升、蔗糖30克/升。培养20天左右，待培养物诱导处芽原基后，即开始下一阶段。

[0008] 2、芽的分化与伸长

[0009] 将第1步所得的培养物转移到分化培养基上，分化培养基成份为DCR常规基本培养基、6-苄基嘌呤(6-BA)0.5毫克/升、吲哚乙酸(IBA)0.05毫克/升、蔗糖30克/升以及琼脂5.6-6.0克/升。培养数30天，待分化出小芽后，即可进行芽的伸长，芽伸长培养基成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸(NAA)0.01-0.1毫克/升或吲哚乙酸(IBA)0.01-0.1毫克/升或活性炭0-2.0克/升，最佳萘乙酸(NAA)浓度为0.02毫克/升、最佳吲哚乙酸浓度为0.05毫克/升、最佳活性碳浓度为1.0克/升，蔗糖30克/升。培养30-40天，待小苗长到常规生根程序所需高度时，进入以下第3步。

[0010] 3、生根：

[0011] 将第2步所得的小苗齐根取下，转至常规生根培养基中，生根培养基的成份为DCR常规基本培养基、萘乙酸(NAA)0.2-2.0毫克/升或吲哚乙酸(IBA)0.2-2.0毫克/升，最佳萘乙酸(NAA)浓度为0.5毫克/升、最佳吲哚乙酸(IBA)浓度为1.5毫克/升，蔗糖30克/升，培养28-35天，小苗根部开始出现白色的短根，此时，培养基中添加适量活性炭有利于根的伸长。之后培养30天左右，即可移栽长成正常的马尾松植株。

[0012] 本发明采用了两种不同于其它针叶树种组织培养的培养基，即诱导培养基和分化培养基，诱导培养基中激素含量较高，易诱导培养物启动分化出芽原基，芽原基诱导出后，不宜在高浓度激素水平的培养基上长期培养，否则诱导出的芽宜愈伤化，如及时转入激素浓度降低的培养基中，有利于芽的分化和伸长。生根阶段，本发明也采用了不同于其它针叶树种生根的方法，首先，把伸长到适合常规生根高度的小苗，先转移到仅添加活性炭的DCR基本培养基中培养30天，再转移到生根培养基中进行生根培养，此举可大大提高生根率。待根长出后，添加1g/L活性炭，有利于根的伸长生长。因活性炭的添加可制造黑暗环境，使根的生长环境更接近于自然，所以有利于根的伸长生长。

[0013] 因此采用此发明的培养基有如下优点：芽原基启动快、芽分化系数高、苗伸长快、生长一致且健壮、生根率高、根长且壮、生长周期短、基本无畸形苗。四、附图说明
图1DCR+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+吲哚乙酸0.05毫克/升+蔗糖30克/升培养基中诱导产生的大量丛生芽。
图2DCR+活性炭1.0克/升培养基中伸长的芽
图3DCR+NAA0.5毫克/升培养基中诱导产生的根
图4DCR+活性炭1.0克/升培养基中伸长生长的根
五、具体实施方式

[0014] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

[0015] 实施例

[0016] 1、取材：取马尾松成熟种子，浸泡过夜，并于流水下冲洗干净，用镊子剥去外种壳。

[0017] 2、材料消毒方法：去壳后在超净工作台内用75％乙醇消毒30s，0.1％升汞灭菌10-15min，无菌水冲洗3-5次。

[0018] 3、接种：在超净工作台内，用常规无菌操作的方法，用解剖刀和镊子把种胚剥离出来，水平接种到培养基上，剥离种胚时要细致小心，尽量避免对种胚造成伤害。诱导培养基组成为：DCR+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+萘乙酸0.05毫克/升+蔗糖30克/升

[0019] 4、芽分化与伸长：将离体胚接种到诱导培养基上，15天后就可看到膨大的子叶上产生的大量芽(图1)，然后将其转移到芽分化培养基上。分化培养基组成为：DCR+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+吲哚乙酸0.05毫克/升+蔗糖30克/升。

[0020] 为使马尾松胚培养诱导产生的丛生芽进一步生长与伸长，在培养基中添加适量活性炭。活性炭能吸附对芽伸长生长不利的次级代谢产物。但过量的活性炭对芽伸长生长受到抑制，这可能是由于活性炭在吸附有害物质的同时也吸附了矿质元素。芽伸长生长的培养基成分为：DCR+活性炭1.0克/升，此培养基促进了芽伸长生长(图2)。

[0021] 5、生根：当分化出的丛生芽长到常规生根所需高度时，用剪刀单个剪下，接种到生根培养基中。生根培养基的为：DCR+NAA0.5毫克/升，此培养基有利于诱导生根(图3)。

[0022] 为使诱导出的根能更好地伸长生长，将生根小苗转移到根伸长培养基中，根伸长培养基的成份为：DCR+活性炭1.0克/升，在此培养基中根伸长生长明显(图4)。

[0023] 培养温度及光照条件：温度为25±1℃；光照为2000勒克斯，16小时/天。

[0024] 6、移栽：生根小苗生长35天左右后，根系比较发达，一般会长出4-5条主根，主根上会有须根的产生，此时可进行移栽。

[0025] 移栽的方法是：先把封口膜打开，在培养室内炼苗1周左右，取出小苗，洗净小苗根部的琼脂，移栽到蛭石和砻糠灰混合的基质里(基质使用前已高压灭菌)，浇足水后放到培养室，覆盖塑料薄膜，24小时后打开薄膜，换气两次，以后每天延长打开时间，直到完全不覆盖为止。选择生长旺盛，茎干较粗，外形好的小苗移栽，成活率可大大提高。