山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基及组培方法

摘要

一种山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基，包括不同诱导时期的四种培养基：(1)初代培养基，(2)胚根不定芽诱导培养基，(3)不定芽增殖培养基，(4)不定芽生根培养基，这四种培养基均以MS为基本培养基，附加蔗糖、琼脂A等物质，pH5.7。用上述四种培养基进行山核桃胚根不定芽及生根的组培方法经过如下五个步骤：一是外植体的采集与消毒，二是初代培养，三是胚根不定芽诱导，四是不定芽增殖培养，五是生根诱导。经过上述五步骤的培育为快速而优质地培养出山核桃幼苗打好坚实的基础。应用本培养基组培，再生植株能保持母本优良性状，提高幼苗繁殖速度，扩大繁殖数量，并能有效利用种子、缩短育苗周期，利于满足社会需求。

权利要求

1.一种山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基，其特征是包括不同诱导时期的四种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：(1)初代培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖20～30g/L、Agar type A即琼脂A 6.5～8.5g/L，培养基的pH值为5.7；

(2)胚根不定芽诱导培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A 6.5～8.5g/L、Picloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L，pH值5.7；

(3)不定芽增殖培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A6.5～8.5g/L、Picloram0.01～0.02mg/L、6-BA1～2mg/L，pH值为5.7；

(4)不定芽生根培养基：MS附加蔗糖20～30g/L，琼脂A6.5～8.5g/L、IAA即吲哚乙酸0.3～0.8mg/L，pH值5.7。

2.一种用权利要求1所述的培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根的组培方法，其特征是经过下列步骤：(1)外植体采集与消毒：选取健壮的山核桃开花后100～120天所结的幼果，依次进行自来水冲洗2h，超净工作台上用75％乙醇灭菌3min，无菌水冲洗3～4次，浓度为0.525％的NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，并剥去革质果皮，取出幼胚待用；

(2)初代培养：将步骤(1)无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中，每天转接1次；3天后改为每3天转接一次，每次均转接至相同的新鲜培养基中，共转接三次，其中前7天置于暗柜中培养，后5天置于光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养。培养温度为25±2℃；

(3)胚根不定芽诱导：将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽诱导培养基中，经过30d的诱导，获得不定芽。微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；

(4)不定芽增殖培养：将获得的不定芽在前述的不定芽增殖培养基上进行增殖培养，30天继代1次，共继代3次，增殖系数为5～8。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；

(5)生根诱导：前述的不定芽在生根培养基中诱导生根，培养30天，生根率达50％。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±1℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以山核桃幼胚为外植体，发育形成胚根，继而形成不定芽、诱导生根的培养基及组培方法。

背景技术

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是胡桃科山核桃属的果、木兼用的优良经济树种，在自然环境下，山核桃靠种子繁殖。山核桃干果可加工成各种特色风味食品、保健品，山核桃含油率高达70％～74％，富含不饱和脂肪酸，含粗蛋白7.8％～9.6％和含K、Ca、Mg、Na等人体所必须的矿质元素。山核桃木质坚硬、纹理美、抗腐蚀，在军工、船舶和建筑业用途广泛，是我国一种十分优良的经济树种。但山核桃树的分布区域狭窄，为我国的特有树种，且只有浙江西北山地和交界的皖南山地有所分布。需求旺、产品少的矛盾突出。长期以来，山核桃的繁殖主要是实生和嫁接繁殖，实生繁殖难以保持品种的优良特性。山核桃又因富含单宁，切口极易氧化褐变，对嫁接的技术要求较高，而且嫁接又要受季节和气候的限制，繁殖速度难以满足生产发展的需求。
林学界，众多学者对山核桃的繁殖作了许多新的探索和尝试，如黄有军先生的幼树的根插繁殖技术、裴东等先生对核桃的试管嫩茎生根技术及幼树的根插繁殖技术等，各对社会作出了有益的贡献。经检索，至今未发现通过山核桃幼胚经试管培育不定芽并繁殖生根育成植株的相关报道。

发明内容

针对山核桃树种的经济价值越来越被人们认识，发展山核桃生产的热情自发涌动，依靠传统的实生繁殖和嫁接繁殖，从质量和数量上均无法满足现实的需求，为此，本发明要解决的技术问题是提供一种以山核桃幼胚为外植体，诱导胚根发育、不定芽形成和不定芽生根的培养基及组培方法。
本发明的技术问题通过如下技术方案解决：
1.本山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基，包括不同诱导时期的四种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：
(1)初代培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖20～30g/L、Agar type A即琼脂A 6.5～8.5g/L，培养基的pH值为5.7；
(2)胚根不定芽诱导培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A 6.5～8.5g/L、Picloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L，pH值5.7；
(3)不定芽增殖培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A6.5～8.5g/L、Picloram0.01～0.02mg/L、6-BA1～2mg/L，pH值为5.7；
(4)不定芽生根培养基：MS附加蔗糖20～30g/L，琼脂A6.5～8.5g/L、IAA即吲哚乙酸0.3～0.8mg/L，pH值5.7。
用上述的培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根的组培方法经过下列步骤：
(1)外植体采集与消毒：选取健壮的山核桃开花后100～120天所结的幼果，依次进行自来水冲洗2h，超净工作台上用75％乙醇灭菌3min，无菌水冲洗3～4次，浓度为0.525％的NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，并剥去革质果皮，取出幼胚待用；
(2)初代培养：将步骤(1)无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中，每天转接1次；3天后改为每3天转接一次，每次均转接至相同的新鲜培养基中，共转接三次，其中前7天置于暗柜中培养，后5天置于光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养。培养温度为25±2℃；
(3)胚根不定芽诱导：将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入前述的胚根不定芽诱导培养基中，经过30d的诱导，获得不定芽。微电脑时控开关控制培养室每日光照时间，每日光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；
(4)不定芽增殖培养：将获得的不定芽在前述的不定芽增殖培养基上进行增殖培养，30天继代1次，共继代3次，增殖系数为5～8。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±2℃；
(5)生根诱导：前述的不定芽在生根培养基中诱导生根，培养30天，生根率达50％。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度为25±1℃。
本发明的有益效果是：
应用山核桃胚根不定芽诱导并进行生根培养，能使再生植株较好地保持母本的优良性状，有效地提高山核桃的繁殖系数，为山核桃良种快繁打下良好的基础。与播种繁殖相比，组织培养法能有效利用种子，其萌发率高，育苗周期短，无菌条件下种子只需2周即可萌发。与扦插繁殖相比，在一个为期6个月的生长周期内组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50～60倍。

具体实施方式

本发明下面结合实施例作进一步详述：本山核桃胚根不定芽诱导及生根的培养基中，选用基本培养基是MS培养基，这是经过用MS、1/2MS、WPM、DKW四种基本培养基各自均附加蔗糖20～30g/L、琼脂A 6.5～8.5g/L、Picloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L，pH值5.7，进行试验，每组重复3次，每种基本培养基有20个外植体的对比试验得出的。因MS培养基中处理30天后，胚根发育最好，诱导的不定芽数最多，质量最好。
总之，本发明所公开的培养基及其配比值，温度、凝固剂等也可用诸如葡萄糖、水晶洋菜等替代，培养基各原料的配比值也可分别采用本发明最佳方案定值的接近值取代。
下面给出的是本发明的最佳实施例。
1.本山核桃胚根不定芽诱导和生根培养基，包括不同诱导时期的四种培养基，各种培养基的原料及其附加量分别是：
(1)初代培养基：以MS为基本培养基，附加蔗糖20～30g/L、Agar type A即琼脂A 6.5～8.5g/L，培养基的pH值为5.7；
(2)胚根不定芽诱导培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A 6.5～8.5g/L、Picloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸0.01mg/L、6-BA即6-氨基腺嘌呤1.0～3.0mg/L，pH值5.7；
(3)不定芽增殖培养基：MS附加蔗糖20～30g/L、琼脂A6.5～8.5g/L、Picloram0.01～0.02mg/L、6-BA1～2mg/L，pH值为5.7；
(4)不定芽生根培养基：MS附加蔗糖20～30g/L，琼脂A6.5～8.5g/L、IAA即吲哚乙酸0.3～0.8mg/L，pH值5.7。
用上述培养基进行山核桃胚根不定芽诱导及生根方法经过下列步骤：
(1)外植体采集与消毒：选取健壮的山核桃开花后100～120天所结的幼果，依次进行自来水冲洗2h，超净工作台上用75％乙醇灭菌3min，无菌水冲洗3～4次，浓度为0.525％的NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，并剥去革质果皮，取出幼胚待用；
(2)初代培养：将步骤(1)无菌条件下取出的幼胚接入前述的初代培养基中，每天转接1次；3天后改为每3天转接一次，每次均转接至相同的新鲜培养基中，共转接三次，其中前7天置于暗柜中培养，后5天置于光暗周期为光16h/暗8h的条件下培养，光照强度：40～50μmol m-2s-1。培养温度为25±2℃，接种于初代培养基中，该培养基包括磷酸二氢钠85g/L、White’s维生素和MS盐类，还有30g/L蔗糖、500mg/L水解酪蛋白、6.5～8.5g/L琼脂A，加入1.0～3.0mg/L BA即苄氨基腺嘌呤、0.01mg/LPicloram即4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸配制而成。培养12天，胚根发育良好；
(3)胚根不定芽诱导：将初代培养后胚根发育良好的幼胚接入附加0.01～0.02mg/L Picloram、1.0～3.0mg/L 6-BA、蔗糖20～30g/L、琼脂A 6.5～8.5g/L的MS培养基中，pH值5.7，光照强度：40～50μmol m-2s-1。培养温度25±2℃，光照时间16h/天，培养30天，得发育良好的不定芽；
(4)不定芽增殖培养：将获得的不定芽长至0.5cm左右高时，从胚根切下并接种到前述的不定芽增殖培养基中培养，30天继代1次，共继代3次，每次增殖系数为5～8。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmol m-2s-1，培养温度25±2℃；
(5)生根诱导：当前述的不定芽长至0.5～1.0cm高时，切成单芽并接种到前述的生根培养基中，培养30天，生根率达50％。光照培养，光暗周期为光16h/暗8h，光照强度为40～50μmolm-2s-1，培养温度为25±2℃。
上述培养基中MS盐类和White’s维生素及其它相关化学品可市售获得，按商品说明书配用，为同行所公知。