中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用

摘要

本发明提供了左金方提取物在制备治疗胃癌药物中的新应用，其中所述提取物为质量比6∶1的黄连与吴茱萸的水提取物。

权利要求

1.中药黄连与吴茱萸的提取物在制备治疗胃癌药物中的应用，其中所述提取物为质量比为6∶1的中药黄连与吴茱萸的提取物。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述提取物为水提物。

3.包含权利要求1～2任一所述的提取物的药物组合物在制备治疗胃癌药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述药物组合物进一步含有药学上可接受的辅料。

5.中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用。

说明书

中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药复方的新用途，尤其涉及以中药黄连和吴茱萸为原料的中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的用途。

背景技术

[0002] 左金方(Zoujin Perscription)出自《丹溪 心法》，由君药黄 连(Coptis chinensisFr)和佐使药吴茱萸(Evodia rutaecarp(Juss.)benth.)按6∶1重量比例组成，被各药典收载，其药性偏寒，主治肝郁化火，胃失和降，胁痛脘痞、呕吐吞酸、嘈杂似饥、脉弦数而口苦舌赤等偏于胃火较甚者。现代医理研究表明左金方有抗溃疡、保护胃粘膜、抑制胃酸分泌、影响胃肠运动的作用。左金方水提液能明显抑制幽门结扎术大鼠为溃疡模型的胃液和胃酸分泌量(陈蔚文，等.广州中医学院院报，1991，8(3)：224)。目前临床常用于急慢性胃炎和消化性溃疡。而反左金方，由黄连、吴茱萸按照1∶6重量比例组成的药方，药性偏温热，临床用于脘痞嘈杂泛酸，又呕吐清水，畏寒，舌苔白滑，偏于胃寒甚者。左金方和反左金方虽然都能用治呕吐吞酸、嘈杂、胃脘痛等脾胃病症，但由于配伍比例引起的寒热偏性不同，其临床相对应的征候也不相同。由于黄连味苦性寒，吴茱萸性热，味辛、苦，即认为左金方性偏寒，反左金方性偏热。左金方能明显防治大鼠的热型(包括胃热Ⅰ°和胃热Ⅱ°模型)急性胃黏膜损伤(P均＜0.001)，符合左金方的临床诊治，而在胃寒模型中由于诊治不符，药效越来越差；反左金方对胃热模型无效，但在寒模型中(包括胃寒Ⅰ°和胃寒Ⅱ°模型)则体现出显著的有黏膜保护作用，且模型寒性程度越强，其防治胃黏膜损伤的作用也越好(陈艳芬等，广东药学院学报，2005；23(3)：290、291、294)。

[0003] 黄连主要含生物碱，包括黄连碱、甲基黄连碱，巴马亭、药根碱、小檗碱和表小檗碱等，具有抗菌、抗病毒、止泻、抗溃疡、抗炎、抗心律失常、抗癌和抗HIV等活性。

[0004] 吴茱萸含有生物碱、黄酮类、挥发油和有机酸类，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗溃疡、止泻、升压、抗血栓和抗缺氧等药理作用。

发明内容

[0005] 本发明一个目的在于提供黄连与吴茱萸的提取物在制备治疗胃癌药物中的应用，其中所述的提取物是质量比为6∶1的黄连与吴茱萸的提取物。

[0006] 上述的提取物优选是水提物。

[0007] 本发明另一目的在于提供了包含上述提取物的药物组合物在制备治疗胃癌药物中的应用。

[0008] 本发明的再一目的在于提供中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用。

[0009] 根据本发明的一方面，本发明的实验证明中药黄连与吴茱萸以6∶1重量混合的提取物对体外培养的胃癌细胞具有明显的抑制作用和诱导细胞凋亡的作用，可通过诱导细胞凋亡而抑制癌细胞的生长，从而具有抗癌效果，并且其抗癌作用效果明显优于黄连提取物、吴茱萸提取物、各单独药物成分或黄连和吴茱萸以其他重量配比混合的提取物的抗癌作用效果，因此黄连与吴茱萸以6∶1重量比混合的提取物可以作为治疗胃癌的药物有效成分，用于制备治疗胃癌的药物。优选的黄连和吴茱萸的提取物为其水提取物。

[0010] 以黄连与吴茱萸以6∶1重量混合的提取物为药物有效成分，添加其他药学上可接受的辅料，制备成药物组合物，可以用于治疗胃癌。根据需要可以将所述药物组合物制备成各种剂型，例如：口服给药的剂型如片剂、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊和微囊)、粉剂、丸剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型如注射剂、栓剂、凝胶剂和贴剂。除这些常规剂型外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明，通过常规方法也可以制备这些制剂。本发明中的制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。本发明特别优选的是将该药物组合物用于口服给药的剂型。作为药学上可接受的辅料，包括用于固体制剂的各种赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、发泡剂、包衣剂等，或用于半固体制剂、液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、润肤剂、乳化剂等，此外，也可以根据需要使用其它药用添加剂诸如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和调味剂等。

[0011] 根据本发明的另一方面，本发明提供以黄连和吴茱萸为原料的中药复方左金方的第二医药用途，即在抗胃癌上的新用途。中药复方左金方以及依据该复方制备的左金丸均包含在本发明范围内，此外，本领域技术人员可以理解的是，以左金方为基础药方，添加其他辅助药材制备的复方药物也包含在本发明中。

附图说明

[0012] 图1是本发明左金方提取物对胃癌细胞MTT试验结果，显示提取物浓度、作用时间与SGC-7901存活率的关系；

[0013] 图2是本发明中左金方提取物作用SGC-790124小时的细胞荧光显微镜图；

[0014] 图3是本发明中不同浓度的左金方水提物对SGC-7901细胞凋亡的流式细胞术分析(n＝6)

[0015] A：对照组；B：0.05mg/mL；C：0.1mg/mL；D：0.5mg/mL；F：：1.5mg/Ml。G：SGC-7901细胞凋亡的FCM分析结果统计(与对照组比较，**：p＜0.01)；

[0016] 图4是本发明左金方提取物诱导SGC-7901细胞DNA片断化的凝胶电泳图[0017] 泳道1：分子量标记，泳道2：对照，泳道3：左金方提取物1mg/mL，泳道4：5-FU50μg/mL；

[0018] 图5是本发明左金方(黄连∶吴茱萸6∶1重量比提取物)与反左金方(黄连∶吴茱萸1∶6提取物)对SGC-7901细胞凋亡的流式细胞术分析(n＝6)

[0019] *：在相同浓度下与反左金方比较，P＜0.01(n＝6)；

[0020] 图6是0.5mg/mL左金方提取物或反左金方提取物对SGC-7901细胞形态学显微镜观察图(×200)

[0021] 相差显微镜(a、b、c)和荧光显微镜(×200)进行观察分析，(A、a)对照；(B、b)0.5mg/mL反左金方提取物，显示核浓缩凋亡；(C、c)0.5mg/mL左金方提取物，凋亡特征更加明显；箭头指示细胞正在凋亡的细胞；

[0022] 图7是显示不同配伍的黄连与吴茱萸水提物与作用时间对SGC-7901生长抑制率的影响

[0023] 将对照细胞的存活率设定为0％，*：与多照组比较p＜0.01；#：与对照组比较p＜0.05；

[0024] 图8是显示不同配伍的黄连与吴茱萸的水提物流式细胞术的检测结果[0025] (A)对照；(B)1∶6；(C)2∶5(D)3∶4(E)4∶3(F)5∶2(G)6∶1，*：与对照组比较p＜001，(n＝6)；

[0026] 图9是显示不同配伍的黄连与吴茱萸水提物对SGC-7901细胞的流式细胞术的检测结果；

[0027] 图10是显示不同配伍的黄连与吴茱萸水提物对SGC-7901细胞线粒体膜电位的影响

[0028] *：与对照组比较p＜001；#：与对照组比较p＜005。

具体实施方式

[0029] 材料来源：

[0030] 细胞株：SGC-7901细胞(人胃癌细胞)购自中山大学动物实验部细胞中心。用含有体积分数为10％的FBS的DMEM完全培养基，于37℃，5％的CO2孵箱中培养。2天进行一次传代，传代按1∶2进行。取生长期细胞进行实验。

[0031] 实验用药及其制备方法：

[0032] 黄连和吴茱萸提取物(左金方)：中药黄连(Coptis chinensis Fr)与吴茱萸(Evodiarutaecarp(Juss.)benth.)为市售购买，按6∶1重量混合并提取，提取物也称左金方提取物。

[0033] 制备方法：黄连、吴茱萸均经水煎、浓缩和冷冻干燥制成水提物，以水提物(mg)/生药(g)定量表示实验中的用药含量。左金方经水提后，得到水提物260(mg)/生药(g)。HPLC法测定，含小檗碱39.85％，巴马汀9.19％，药根碱4.86％，吴茱萸碱0.17％，吴茱萸次碱0.19％)；

[0034] 黄连提取物：以中药黄连为原料，经水提后，得到水提物190(mg)/生药(g)；

[0035] 吴茱萸提取物：以中药吴茱萸为原料，经水提后，得到水提物320(mg)/生药(g)。

[0036] 反左金方：黄连与吴茱萸按1∶6重量混合并提取，方法同上，HPLC法测定，含小檗碱2.83％，巴马汀0.48％，药根碱0.35％，吴茱萸碱0.06％，也称反左金方提取物。

[0037] 小檗碱、巴马汀、药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱购自中国药品生物制品检定所。

[0038] 【实施例1】黄连与吴茱萸按6∶1重量混合提取物(左金方)的抗癌作用研究[0039] 1、MTT检测细胞存活率

[0040] 以不同浓度的按照上述方法制备的黄连和吴茱萸6∶1重量提取物作用于培养的SGC-7901细胞，采用MTT法在规定时间内观察黄连和吴茱萸提取物对培养细胞存活率的影响，结果如图1所示，实验结果显示：对照组细胞生长良好，经左金方提取物作用后的细胞，随着浓度逐渐增高，作用时间的不断延长，SGC7901细胞的存活率下降，其中将未经处理的对照组细胞的存活率设定为100％。

[0041] 2、细胞形态学观察

[0042] 将SGC-7901细胞(2×105/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4％多聚甲醛(pH为7.4)于37℃固定细胞30min，PBS液洗两次，加5mg/L Hochest 33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液(20mmol/L柠檬酸，50mmol/L磷酸氢二钠，50％甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。结果如图2，结果显示，空白对照组细胞生长良好，细胞大小均匀、完整、饱满，密度一致，(图2A，2C)，而提取物作用组24小时后，凋亡细胞逐渐增多，即核质浓聚成大小不等的多边形，细胞多出现固缩形成新月体(图2B，2D)。

[0043] 3、流式细胞仪检测

[0044] 调整细胞密度为2×105cells/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔。药物作用72h后，细胞刮刮取细胞，1000rpm离心10min，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中缓慢依次加入70％的冰乙醇固定。-20℃固定24h。固定后，1000rpm离心10min，去上清，PBS6
漂洗两次，调整细胞浓度为1×10/mL。加RNase至终浓度100μg/mL，37℃水浴30min。
加PI至终浓度50μg/mL，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4℃避光染色30min后，上流式细胞仪检测(激发波长：488nm；发射波长：610nm)各期细胞DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。结果见图3，FCM定量分析为随左金方提取物浓度增加细胞凋亡率增高。浓度为0.05，0.1，0.5，1.0，1.5mg/mL提取物作用SGC-7901细胞24h后细胞凋亡率为(2.72±1.18)％，(4.21±1.75)％，(19.89±3.56)％、(25.32±2.58)％和(26.95±2.42)％，与对照组(1.69±1.91)％比较差异均有显著性(P＜0.01)。

[0045] 4、DNA片段化检测

[0046] 细胞凋亡的一个主要特征就是DNA的片断化。细胞凋亡时染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成50～300kbp长的DNA大片段，或180bp～200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶(EB)染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA-ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA-ladder的形成。这是细胞凋亡的基本特征之一，是基因水平上特征反映。但也经常有因为打断的DNA片段大小相差较大，普通的琼脂糖凝胶电泳对其进行分离时不能形成DNA-ladder，而只出现片段DNA。为了验证左金方提取物是否诱导SGC-7901细胞凋亡，用含1mg/mL提取物培养液培养细胞48h，并设空白对照组和5F-U对照组，然后用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断。(如图4)所示，在提取物组得到了DNA-Ladder，而空白对照组没有DNA-Ladder形成，5F-U对照组所形成的DNA-Ladder不明显。

[0047] 5、统计学处理

[0048] 以上全部数据均采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验。

[0049] 上述实验结果显示，左金方提取物作用于SGC-7901细胞后，对该细胞有明显的抑制作用，MTT结果显示，不同浓度(0.05，0.1，0.5，1.0，1.5mg/mL)的左金方提取物对SGC-7901作用24h后细胞生长的抑制率分别为(90.12±2.47)％、(85.48±3.60)％、(71.26±2.04)％，(42.20±3.89)％和(35.92±2.94)％。且左金方提取物抑制SGC-7901细胞生长的作用与时间正相关(如图1)。流式细胞术检测不同浓度左金方提取物(0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL)作用SGC-7901细胞24h后，细胞凋亡率分别为(2.72±1.18)％，(4.21±1.75)％，(19.89±3.56)％、(25.32±2.58)％和(26.95±2.42)％，与对照组(1.69±1.91)％比较差异均有显著性(P＜0.01)(如图3)。结果也表明，随着左金方提取物浓度的升高，诱导凋亡的趋势增大。显微镜下观察，对照组细胞生长良好，细胞大小均匀、完整、饱满，密度一致，加药组培养液中悬浮聚集成团的细胞增多，而贴壁细胞数量减少，出现胞膜破裂，胞内容物释放，细胞聚集成团呈现网状。Hochest染色结果中，对照组细胞生长良好，细胞器密度一致，亮度均匀，加药组细胞失去其正常生长状态，变成杆形、哑铃形、有的呈新月状，即核质浓聚成大小不等的多边形，有凋亡小体出现(如图2)。进一步从形态学的角度证明左金方提取物可诱导SGC-7901细胞凋亡。

[0050] 综上所述，左金方提取物可抑制人胃癌细胞生长，并有诱导人胃腺癌细胞凋亡的作用。

[0051] 【实施例2】左金方提取物与反左金方提取物对SGC-7901凋亡的作用的比较实验[0052] 《丹溪心法·火篇》中左金方由黄连六两(姜汁炒)和吴茱萸一两(盐水泡)组成，黄连味苦性寒，吴茱萸性热，味辛、苦。现代医家根据病症不同，反其比例组方，按照1∶6质量比为黄连与吴茱萸，称“反左金方”。由于黄连、吴茱萸性味偏差，即认为左金方性偏寒，反左金方性偏热。现考察两个来源、成分功效背景差异小的方剂对胃癌细胞SGC-7901的凋亡作用，比较不同药性方剂抗肿瘤的差异。

[0053] 实验材料为左金方提取物和反左金方提取物，制备方法如前，实验方法与实施例1相同。

[0054] 结果：

[0055] 1、左金方提取物与反左金方提取物对SGC-7901抑制率的影响

[0056] 实验结果显示：对照组细胞生长良好，经0.5mg/mL的左金方提取物与反左金方提取物作用后，随着作用时间(24，48，72h)的不断延长，反左金方组细胞抑制率分别为(1.5±2.1)％，(50.3±3.4)％，(75.5±4.9)％，呈现降低趋势。左金方组细胞的抑制率分别为(14.5±3.4)％，(75.6±0.9)％，(91.9±2.1)％，并与相应的反左金方组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

[0057] 表10.5mg/ml左金方与反左金方不同作用时间对SGC-7901生长抑制率的影响[0058]

[0059] *：在同一时间与反左金方比较P＜0.01(n＝6)

[0060] 2流式细胞仪检测凋亡率

[0061] 凋亡细胞在流式细胞仪直方图上可以出现特征性的业二倍体峰(sub-G1peak)，对照组的自然凋亡率为(1.69±1.91)％，0.1、0.5和1.0mg/ml反左金方作用SGC-7901细胞48h，细胞凋亡率为(5.52±0.54)％、(6.91±2.31)％、(8.50±1.02)％，对应浓度的左金方组分别为(11.60±1.24)％、(21.80±0.28)％、(36.40±1.59)％，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图5。

[0062] 3细胞形态学观察

[0063] 倒置显微镜下观察结果显示：SGC-7901细胞在正常状态下贴壁生长，呈椭圆形，少数呈圆形，长至紧密时呈多角形。折光率高，胞体大，见图6a。经0.5mg/mL反左金方提取物作用48h后，细胞多皱缩变圆，折光率减弱，间距变大，有细胞脱落漂浮于培养液中，见图6b。经0.5mg/mL左金方提取物作用48h后，上述表现越明显，见图6c。

[0064] 荧光显微镜观察结果显示：经Hoehest33258荧光染色后，荧光显微镜下见空白组SGC7901细胞膜均完整，核形态饱满，核质着色浅，密度均匀一致，见图6A；0.5mg/mL反左金方提取物作用48h细胞出现典型凋亡形态特征：细胞膜皱缩，细胞核相对变小荧光明显增强，成高度块状，见图6B。0.5mg/mL左金方提取物作用48h细胞除上述特征外，可见凋亡小体数目高于反左金方组，见图6C。

[0065] 本研究的目的在于比较左金方提取物和反左金方提取物抑制SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡的能力。左金方与反左金方是配伍比例相反的两个对药方，对于不同胃粘膜损伤模型的保护作用有选择性，反左金能有效防治胃寒型急性胃粘膜损伤，而左金方在胃热模型上药效更好。说明两方适用症不同。本实验也能说明左金方提取物与反左金方提取物存在药效差别。经0.1mg/ml药物作用后，随着作用时间(24，48，72h)的不断延长，左金方组细胞的抑制率分别为(14.5±3.4)％，(75.6±0.9)％，(91.9±2.1)％，呈现增高趋势。反左金方组细胞抑制率分别为(1.5±2.1)％，(50.3±3.4)％，(75.5±4.9)％，左金方提取物与反左金方提取物在相同浓度及作用相同时间对SGC-7901细胞的抑制率比较有显著差异(P＜0.01)。相同浓度的左金方提取物对SGC-7901抑制作用较强，诱导凋亡率较高，凋亡特征更明显。

[0066] 故药性偏寒的左金方提取物对肿瘤的抑制作用较明显，药性偏温的反左金方提取物虽能抑制肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡，但作用很弱，远远小于左金方提取物。

[0067] 【实施例3】黄连与吴茱萸不同配比促SGC-7901凋亡的作用的研究

[0068] 1黄连吴茱萸不同配伍对细胞活性的抑制作用

[0069] 将SGC-7901细胞置于96孔板中进行培养，加入1mg/ml的黄连和吴茱萸混合物的水提取物，原料的重量配比分别为1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1作用于SGC-7901细胞24h、48h后，用MTT法检测存活细胞百分比。结果显示，药物作用24h后便可降低细胞活性，但抑制率不高。药物作用48h后便可显著降低细胞活性，并与黄连比例成正相关，随着黄连比例的增大细胞的成活率降低。以黄连和吴茱萸2∶5配伍后作用于SGC-7901细胞48h，抑制率可达到60.00±1.3％(如图7)，6∶1配伍后作用于SGC-7901细胞48h可达到72.0±2.0％。而且药物作用48h后各组抑制率有明显的统计学差异，所以实验中药物作用时间确定为48h。

[0070] 2黄连吴茱萸不同配伍对细胞周期的影响

[0071] 在细胞凋亡晚期，核酸内切酶(某些Caspase的底物)在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180～200bp的DNA片段。并存在明显的DNA丢失，其核对DNA染色呈低染性。因此，FCM检测凋亡细胞的DNA含量，低于G0/G1的细胞的DNA含量，表现为较低的亚二倍体峰，称为sub-G1”峰，是凋亡的直接佐证。

[0072] 从图8中可以看到，药物作用于SGC-7901细胞48h，出现了明显的凋亡峰。从图8B-G中可见，随着黄连在配伍中比例的升高，处于sub-G1期的细胞百分比明显增加，由8.50％逐步增加到36.40％，凋亡细胞的数量明显增多，说明在配方中黄连对诱导细胞凋亡起主导作用。

[0073] 3黄连吴茱萸不同配伍对线粒体膜电位的影响

[0074] 线粒体膜电位的检测方法

[0075] 调整细胞密度为2×105cells/ml，以1.5ml/well种入6孔板。每组6个复孔。种板24h后给药，药物作用6h后，用胰酶消化收取细胞，1200rpm离心3min，去上清，PBS洗两次后，加入0.5ml细胞培养液重悬细胞，随后向细胞悬液中加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀，放入细胞培养箱中37℃孵育20min。孵育结束后，600g、4℃离心3min，弃上清。用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤两次，最后用适量JC-1染色缓冲液(1×)重悬，用流式细胞仪分析。

[0076] 线粒体在细胞凋亡中起着非常重要的作用，线粒体通路是诱导细胞凋亡的重要途径之一。线粒体跨膜电位 的下降，被认为是细胞凋亡反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体 崩溃，则细胞凋亡不可逆转，线粒体膜通透性发生改变，导致多种凋亡关键分子从线粒体膜腔中释放出来。一些分子包括胱天蛋白酶原(procaspase)、细胞色素C(胱天蛋白酶的激活剂)以及SmacDiablo(胱天蛋白酶的协同激活剂)等。

[0077] JC-1是一种新型的亲脂性阳离子型的膜电位敏感荧光探针，正常细胞中线粒体的膜电位高，JC-1以聚集体存在，488nm激发时发出很强的红色荧光，而凋亡细胞线粒体的膜电位发生去极化，红色荧光减弱，绿色荧光增强，通过红、绿荧光的比值判断线粒体膜电位的变化，从而了解线粒体在细胞凋亡中的变化。RCFE作用于SGC-7901细胞6小时后，用JC-1做荧光探针，流式细胞仪检测。由图10可以看出，加入药物后作用6小时可以明显引起细胞线粒体膜电位的下降，其下降程度随黄连用量的增加而增大，如图10所示。

[0078] 根据以上实验例，黄连与吴茱萸的配比分别为1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1的提取物(1mg/ml)孵育SGC-7901细胞48h后，SGC-7901细胞成活率显著降低，抑制率从(56.0±1.3)％升到(72.0±2.0)％，其抑制率与提取物中黄连的含量呈正相关，见图7。配比分别为1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1的药物孵育细胞48h后，流式细胞仪检测结果表明出现亚二倍体峰，这是典型的凋亡形态学及生化特征，其凋亡率分别为(8.50±1.9)％、(9.90±1.01)％、(17.15±1.68)％、(21.55±1.97)％、(34.40±1.06)％和(36.40±1.02)％，如图8所示，说明黄连与吴茱萸提取物抗胃癌作用的最佳配伍比例为黄连∶吴茱萸＝6∶1。另外，药物处理后首先观察到细胞线粒体膜电位发生改变，研究证明，当细胞线粒体膜电位崩溃，线粒体中的细胞色素C释放到细胞质中则细胞凋亡不可逆转。在已确立的线粒体通路中，细胞色素C从线粒体内释放至胞质中，与胞质中的ATP及Apaf-1结合、组成复合物apoptosomc激活下游的caspase，最终导致凋亡。由图10可以看出药物作用6小时，其绿/红光比值从1.26％±0.09上升到1.59±0.06，与空白组
0.54±0.03比较可以看出细胞线粒体膜电位明显下降。这表明，线粒体依赖的凋亡通路参与了黄连与吴茱萸配伍使用引发的SGC-7901细胞凋亡。

[0079] 【实施例4】左金方中各药物对胃癌细胞作用的研究

[0080] 为研究左金方中个药物成分的抗胃癌作用效果，选取与1mg/mL的左金方提取物相对应浓度的小檗碱(39.85μg/mL)、巴马汀(9.19μg/mL)、药根碱(4.86μg/mL)、吴茱萸碱(0.17μg/mL)、吴茱萸次碱(0.19μg/mL)、黄连水提取物(0.857mg/mL)及吴茱萸水提取物(0.143mg/mL)，作用于SGC-7901细胞，对照组为未处理的细胞，MTT法测定细胞活性，结果如表2所示：

[0081] 表2，左金方中不同药物成分对SGC-7901细胞活性的影响

[0082]

[0083] *p＜0.01 vs.control

[0084] 上述结果显示，左金方提取物对癌细胞的抑制率明显高于各单个药物成分的抑制效果，其原因在于左金方提取物成分复杂，在诱导肿瘤细胞凋亡中体现的是各种成分的综合作用，是整体效果的体现。

[0085] 以上实施方式的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。